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高效液相色譜法測(cè)定銀杏葉提取物中總黃酮醇苷含量*

宋唯唯劉芬芬劉彩紅

(泰山醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，山東泰安271016)

摘要：目的建立銀杏葉提取物中總黃酮醇苷的HPLC含量測(cè)定方法。方法采用Hypersil ODS2色譜柱(4.6×250 mm，5 μm)，以甲醇- 0.4%磷酸溶液(55:45)為流動(dòng)相，檢測(cè)波長(zhǎng)360 nm，流速1.0 ml/min，柱溫35℃。結(jié)果槲皮素、山奈酚、異鼠李素進(jìn)樣量分別在10.0~60.0 μg/ml、10.0~60.0 μg/ml、1.0~30.0 μg/ml 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，平均回收率分別為99.42%、99.92%、98.11%。結(jié)論本方法簡(jiǎn)單、準(zhǔn)確,可以用于銀杏葉提取物中總黃酮醇苷的定量分析。

關(guān)鍵詞：高效液相色譜法； 銀杏葉提取物； 總黃酮醇苷

銀杏葉提取物(GBE)是銀杏科植物銀杏Ginkgobiloba.L.的干燥葉經(jīng)加工制成的提取物[1],具有擴(kuò)張冠狀動(dòng)脈血管、改善腦循環(huán)及明顯的抗血小板活化因子等獨(dú)特的藥理作用，主要活性成分為黃酮類和萜類內(nèi)酯[2]，它們是制定銀杏葉提取物和制劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的重要依據(jù)。國(guó)內(nèi)外制藥行業(yè)所用的GBE的含量標(biāo)準(zhǔn)為:銀杏黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù) 24%、銀杏萜內(nèi)酯質(zhì)量分?jǐn)?shù) 6%。不論是為衡量提取工藝的優(yōu)劣和控制GBE的質(zhì)量,還是為后續(xù)藥理藥效的實(shí)驗(yàn)研究提供可靠的數(shù)據(jù),建立一種能穩(wěn)定、可靠的定量分析其主要藥效物質(zhì)黃酮類化合物的方法是十分必要的。

銀杏葉提取物含有 20多種黃酮類化合物,通常都以糖苷的形式存在,測(cè)定每一種黃酮成分的含量十分復(fù)雜,這些成分的苷元部分為槲皮素、山萘酚、異鼠李素，通過測(cè)定樣品酸水解后三種主要甙元含量，再乘以一定的因子換算成總黃酮的含量[3]，是國(guó)際上公認(rèn)的衡量銀杏葉提取物內(nèi)在品質(zhì)的依據(jù)。因此，本研究以槲皮素、山萘酚、異鼠李素為對(duì)照品，建立了 HPLC法測(cè)定銀杏葉提取物中總黃酮醇苷含量的方法。

1實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1儀器和試劑大連依利特EC2006高效液相色譜儀，包括UV230II紫外-可見檢測(cè)器，P230II高壓恒流泵(A、B泵)。對(duì)照品槲皮素、山柰素和異鼠李素購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所；銀杏葉提取物樣品購(gòu)自西安昌岳植物化工有限公司。甲醇為色譜純、磷酸為分析純、水為雙蒸水。

1.2對(duì)照品溶液的制備分別精密稱取槲皮素、山奈素、異鼠李素對(duì)照品置于棕色容量瓶中，用甲醇配制成濃度為1.0 mg/ml，1.0 mg/ml，0.156 mg/ml的對(duì)照品溶液，4℃保存，備用。

1.3樣品溶液的制備精密稱取銀杏葉提取物約15 mg，置于100 ml圓底燒瓶中，加甲醇-25%鹽酸溶液(4∶1)混合溶液25 ml，超聲15 min，置電熱套上加熱回流60 min，迅速冷卻至室溫，轉(zhuǎn)移至50 ml的容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，3000 r/min離心5 min，0.22 μm的微孔濾膜過濾，既得。

2方法和結(jié)果

2.1色譜條件采用Hypersil ODS2色譜柱(4.6×250 mm，5 μm)，流動(dòng)相甲醇- 0.4%磷酸溶液(55∶45)，檢測(cè)波長(zhǎng)360 nm，流速1.0 ml/min，柱溫35℃。色譜圖見圖1。

圖1　對(duì)照品(A)及樣品(B)的HPLC圖譜

2.2線性關(guān)系考察精密吸取“1.3”項(xiàng)下槲皮素、山奈素、異鼠李素對(duì)照品貯備液,加甲醇配制成一系列濃度的混合溶液：對(duì)照品溶液 1(槲皮素10 μg/ml、山奈素10 μg/ml、異鼠李素1.0 μg/ml)，對(duì)照品溶液 2(槲皮素20 μg/ml、山奈素20 μg/ml、異鼠李素3 μg/ml)，對(duì)照品溶液 3(槲皮素30 μg/ml、山奈素30 μg/ml、異鼠李素5 μg/ml)，對(duì)照品溶液 4(槲皮素40 μg/ml、山奈素40 μg/ml、異鼠李素10 μg/ml)，對(duì)照品溶液 5(槲皮素60 μg/ml、山奈素60 μg/ml、異鼠李素25 μg/ml)。精密吸取上述對(duì)照品溶液各20 μl，注入液相色譜儀，記錄峰面積，以各對(duì)照品進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，做線性回歸，得槲皮素、山奈素、異鼠李素的回歸方程，結(jié)果見表 1。

表1　槲皮素、山奈素、異鼠李素的回歸方程、線性范圍及相關(guān)系數(shù)

2.3精密度試驗(yàn)精密吸取混合對(duì)照品溶液 20 μl，連續(xù)進(jìn)樣6次，結(jié)果槲皮素、山奈素、異鼠李素峰面積的RSD分別為1.71%、1.89%、0.98%，均小于2.0%，表明該方法精密度良好。

2.4穩(wěn)定性試驗(yàn)精密吸取供試品溶液 20μl，分別于配制后 0、 2、4、 8、 16、 24 h進(jìn)樣測(cè)定，結(jié)果槲皮素、山奈素、異鼠李素的RSD分別為0.89%、0.53%、0.75%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.5重復(fù)性試驗(yàn)取同一樣品6份，按照“1.4”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，測(cè)定槲皮素、山奈素、異鼠李素的平均含量，再按總黃酮醇苷含量 = (槲皮素含量 +山奈素含量 +異鼠李素含量)×2.51計(jì)算，總黃酮醇苷平均含量為24.76%，RSD為0.89%。結(jié)果表明本法重復(fù)性良好。

2.6回收率試驗(yàn)取已知濃度的樣品溶液(槲皮素6.0 μg/ml、山奈素4.8 μg/ml、異鼠李素4.0 μg/ml)，分別加入供試品含量80%、100%、120%的槲皮素，山奈素和異鼠李素對(duì)照品溶液，每種濃度各3份，進(jìn)樣20 μl，計(jì)算回收率，結(jié)果見表2。結(jié)果表明，該測(cè)定方法準(zhǔn)確度較高,槲皮素、山奈素、異鼠李素的3個(gè)濃度下的平均回收率分別為 99.42%、99.92%、98.11%。

表2　回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果(n=9)

2.7樣品含量測(cè)定精密稱取銀杏葉提取物0.0150 g，按照“1.4”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，用外標(biāo)法計(jì)算樣品中槲皮素、山奈素、異鼠李素的含量，分別為4 mg/g、3.2 mg/g、2.67 mg/g,按總黃酮醇苷含量=(槲皮素含量+山柰素含量+異鼠李素含量×2.51計(jì)算，樣品中總黃酮醇苷的含量為24.76%。

3討論

為了使所檢測(cè)的色譜峰分離度好，出峰時(shí)間合理，筆者在初實(shí)驗(yàn)過程中,分別比較了以下不同的流動(dòng)相對(duì)測(cè)定結(jié)果的影響：甲醇-0.4%磷酸溶液(50∶50)、甲醇-0.4%磷酸溶液(55∶45)及甲醇-水(50∶50)(用磷酸調(diào) pH=2.5)，結(jié)果選用甲醇-0.4%磷酸溶液(55∶ 45)作為流動(dòng)相時(shí)各個(gè)色譜峰的分離效果好。從以上方法學(xué)考察及試驗(yàn)結(jié)果可見，本測(cè)定方法準(zhǔn)確，重復(fù)性好,穩(wěn)定性較好，結(jié)果可靠，能夠準(zhǔn)確測(cè)定樣品中總黃酮醇苷的含量。

參考文獻(xiàn)：

[1]ChP(中國(guó)藥典).2010.VolⅠ(一部):392-393.

[2]Teris A B，Paola M. Chemical analysis and quality control of Ginkgo biloba leaves，extracts，and phytopharmaceuticals [J]. Chromatogr A, 2009, 1216(11): 2002-2032.

[3]趙一懿,郭洪祝,王京輝,等. 超高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定銀杏葉提取物中 11種黃酮苷類成分的含量[J]. 中國(guó)藥學(xué)雜志, 2012, 47(24): 2032-2037.

關(guān)于學(xué)報(bào)論文中的量和單位

1)應(yīng)嚴(yán)格執(zhí)行GB 3100～3102有關(guān)量和單位的規(guī)定。

2)量的符號(hào)一般為單個(gè)拉丁字母或希臘字母，并一律采用斜體(pH例外)。為區(qū)別不同情況，可在量符號(hào)的右側(cè)上、下方用上、下標(biāo)標(biāo)識(shí)。其中以量符號(hào)和代表變動(dòng)性數(shù)字的字母作角標(biāo)時(shí)用斜體，其他角標(biāo)(包括數(shù)字)用正體。

3)在表達(dá)量值時(shí)，在公式、圖、表和文字?jǐn)⑹鲋?，一律使用單位的?guó)際符號(hào)，且無例外地用正體。單位符號(hào)與數(shù)值間要空出1/4個(gè)字長(zhǎng)。

4)不許對(duì)單位符號(hào)進(jìn)行修飾，如加縮寫點(diǎn)、下標(biāo)、復(fù)數(shù)形式，或在組合單位符號(hào)中插入化學(xué)元素符號(hào)等說明性記號(hào)，等等。

5)圖、表中用符號(hào)表示數(shù)值的量和單位時(shí)，應(yīng)采用量與單位相比的形式，如m/kg，cB /mol·L-1。

6)指數(shù)、對(duì)數(shù)和三角函數(shù)中的變量等，都是數(shù)、數(shù)值或量的無量綱組合，如 exp( W/kT)，Ig(p /kPa)，sin(wt)。

7)統(tǒng)一用L(升)作為表示物質(zhì)濃度的基準(zhǔn)單位，而不使用μL，mL，dL以及mm3等作濃度單位的分母。

8)不能把ppm，pphm，ppb等縮寫字作單位使用。

9)詞頭不得單獨(dú)或重疊使用。如urn，不用u；mF，不用uuF。

10)組合單位的分母中一般不用詞頭。如kJ/mol不能寫成J/mmol。

HPLC determination of total flavone glycosides in Ginkgo biloba extract

SONGWei-weiLIUFen-fenLIUCai-hong

(College of Pharmacy, Taishan Medical University, Taian 271016,China)

Abstract:Objective: To establish an HPLC method for the determination of the contents of total flavone glycosides in Ginkgo biloba extract. Methods: The analyses were performed on a Hypersil ODS2 column (4.6×250mm,5 μm), and the mobile phase was methanol-water containing 0. 4% phosphoric acid (55:45) at the flow rate of 1 ml/min. The detection was carried out at 360 nm, and the column temperature was 35℃．Results: The calibration curves of quercetin, kaempferide and isorhamnetin had good linearinities with good recoveries in the ranges of 10.0~60.0μg/ml,10.0~60.0μg/ml and 1.0~30.0μg/ml, respectively. The average recoveries of the method were 99.42%, 99.92% and 98.11% respectively. Conclusion: The HPLC method is simple, accurate, which can be used for the determination of the contents of total flavone glycosides in Ginkgo biloba extract.

Key words:HPLC method； Ginkgo biloba extract； total flavone glycosides

收稿日期(2015-09-23)

doi:10.3969/j.issn.1004-7115.2016.01.011

中圖分類號(hào)：R917

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1004-7115(2016)01-0033-03

通訊作者：劉彩紅，女，主要從事中藥活性成分的研究，E-mail: chliu@tsmc.edu.cn。

作者簡(jiǎn)介：*宋唯唯(1993—)，女，2012級(jí)制藥工程本科一班。

基金項(xiàng)目：國(guó)家級(jí)大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目(201410439028)。