陳軍++舒祥++余南才

【摘要】目的：建立山苓祛斑凝膠的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。方法：運(yùn)用HPLC法測(cè)定祛斑凝膠提取物中尿囊素、阿魏酸含量作為評(píng)價(jià)指標(biāo)，流動(dòng)相分別為乙腈-0085%磷酸-水（5∶95）、（17∶83），流速為05mL/min、1mL/min，柱溫30℃，檢測(cè)波長(zhǎng)為224nm、316nm。結(jié)果：尿囊素、阿魏酸線性范圍0368～2208μg、0424～2544μg，精密度RSD 055%、092%，穩(wěn)定性RSD 14%、15%，重復(fù)性RSD 095%、055%。祛斑凝膠劑中尿囊素、阿魏酸含量分別為112mg/g、45mg/g。結(jié)論：該方法重復(fù)性好，質(zhì)量可控，可為該凝膠制劑進(jìn)行中試、生產(chǎn)提供參考。

【關(guān)鍵詞】山苓祛斑凝膠；含量測(cè)定；高效液相色譜法

【中圖分類號(hào)】R2841【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】 A【文章編號(hào)】1007-8517（2016）21-0011-03

黃褐斑也稱“肝斑”、“蝴蝶斑”，為面部黃褐色色素沉著，且多對(duì)稱蝶形分布于頰部，大小不一、形態(tài)不定，好發(fā)于育齡期女性[1]。黃褐斑由多種因素綜合作用導(dǎo)致，其發(fā)病與妊娠、長(zhǎng)期口服避孕藥、月經(jīng)紊亂有關(guān)，血中雌激素水平高是主要原因。目前，尚無(wú)徹底治愈方法，臨床治療方法有一定的副作用，如造成外源性褐黃病、皮膚萎縮、永久性脫色，甚至出現(xiàn)腎毒性、精神、神經(jīng)癥狀等，因而黃褐斑一直是醫(yī)學(xué)界關(guān)注的問(wèn)題。中醫(yī)藥治療黃褐斑有著悠久歷史，具有一定優(yōu)勢(shì)。中藥凝膠劑是一種新型外用制劑，適用于皮膚、黏膜及腔道，不僅避免口服給藥存在的胃腸道內(nèi)酶、酸等首過(guò)作用，而且可減輕藥物不良反應(yīng)，同時(shí)具有使用方便、舒適、生物相容性好等多種優(yōu)點(diǎn)，臨床上治療黃褐斑已取得較好療效[2-4]。復(fù)方中藥山苓祛斑方為我院中醫(yī)部周利副主任醫(yī)師經(jīng)驗(yàn)方，由山藥、茯苓、白芷、白及、當(dāng)歸等藥組成。研究以尿囊素、阿魏酸含量作為凝膠劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)[5-6]，用HPLC法測(cè)定凝膠劑中尿囊素、阿魏酸含量，為其質(zhì)量控制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1儀器與材料

1.1儀器DIONEX Ultimate 3000 型高效液相色譜儀（紫外DAD檢測(cè)器，美國(guó)DIONEX公司）；CP 2104 電子天平（奧豪斯儀器（上海）有限公司）。

1.2材料山藥、茯苓、當(dāng)歸等9味中藥材飲片（亳州國(guó)一堂中藥飲片有限公司），祛斑凝膠劑（批號(hào)：20150401、20150405、20150410，自制）；凝膠劑陰性樣品（自制不含當(dāng)歸及山藥的樣品各一份，批號(hào)20150410），尿囊素（批號(hào)：111501-200001）、阿魏酸對(duì)照品（批號(hào)：110773-200611）、茯苓（批號(hào)：121117-201302）、當(dāng)歸（批號(hào)：120927-201408）、山藥（批號(hào)：121137-201405）等對(duì)照藥材購(gòu)于中檢所，乙腈為色譜純，其余試劑為分析純。

2方法

2.1祛斑凝膠提取物中尿囊素含量測(cè)定

2.1.1色譜條件ODS C18色譜柱（Thermo-Scientific Syncronis， 250mm×4.6mm，5μm）；流動(dòng)相：乙腈-0.085%磷酸水（5∶95）；流速：0.5mL/min；柱溫：30℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：224nm；進(jìn)樣量：10μL。

2.1.2對(duì)照品溶液制備精密稱取尿囊素對(duì)照品9.2mg，置50mL量瓶中，用超純水稀釋至刻度。

2.1.3供試品溶液制備稱取山苓祛斑凝膠提取物3g，加入適量甲醇超聲溶解，加入100-200目硅膠4.5g，蒸干溶劑后進(jìn)行硅膠柱色譜分離。硅膠用量為50g （300～400目），洗脫劑選擇二氯甲烷∶甲醇（9∶1），收集200mL，濃縮后用甲醇稀釋至10mL，作為供試品溶液。

2.1.4陰性對(duì)照溶液制備按處方量制備除山藥外的所有組分的凝膠劑，作為山藥陰性對(duì)照樣品，余同“2.1.3”操作，即得。

2.1.5線性關(guān)系考察分別進(jìn)樣2、4、6、8、10、12μL以尿囊素含量為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，進(jìn)行線性回歸，得回歸方程y=9.0814x+0.0354，R2=0.9998，表明尿囊素在0.368～2.208μg線性關(guān)系良好。

2.1.6精密度試驗(yàn)精密吸取供試品溶液10μL，連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積積分值，結(jié)果表明：精密度良好，平均峰面積為15.5925，RSD為0.55%。

2.1.7穩(wěn)定性試驗(yàn)精密吸取尿囊素標(biāo)準(zhǔn)品溶液10μL，按0、4h、8h、12h、16h、24h 進(jìn)樣1次，記錄峰面積積分值，結(jié)果表明：尿囊素標(biāo)準(zhǔn)品穩(wěn)定性良好，RSD為1.4%。

2.1.8重復(fù)性試驗(yàn)取同一批凝膠劑6份，按尿囊素供試品制備方法制備供試品溶液，按“2.1.1”色譜條件進(jìn)樣6次，計(jì)算尿囊素平均含量為4.5mg/g，RSD為0.95%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.1.9加樣回收率試驗(yàn)稱取山苓祛斑凝膠提取物1.5g，分別加入尿囊素對(duì)照品溶液15μL，按照供試品溶液制備的方法處理，進(jìn)樣10μL，記錄峰面積積分值，代入回歸方程，計(jì)算尿囊素標(biāo)準(zhǔn)品的加樣回收率為97.2%，RSD為1.2%。

2.1.10尿囊素含量測(cè)定精密吸取供試品溶液10μL，液相色譜儀，記錄峰面積積分值，代入回歸方程，計(jì)算得出尿囊素含量為4.5mg/g。

2.2山苓祛斑凝膠提取物中阿魏酸含量測(cè)定

2.2.1色譜條件ODS C18色譜柱（Thermo-Scientific Syncronis， 250mm×4.6 mm，5μm）；流動(dòng)相：乙腈-水（17：83）；流速：1mL/min；柱溫：35℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：316nm，進(jìn)樣量：10μL。

2.2.2對(duì)照品溶液的制備精密稱取阿魏酸對(duì)照品，加甲醇制備成濃度為0.212μg/μL的溶液。

2.2.3供試品溶液的制備取山苓祛斑凝膠提取物10g，加甲醇超聲，并定容至50mL容量瓶中。

2.2.4陰性對(duì)照溶液制備按處方量制備除當(dāng)歸外的所有組分的凝膠劑，作為當(dāng)歸陰性對(duì)照樣品，余同“2.2.3”操作，即得。

2.2.5線性范圍考察分別精密吸取阿魏酸對(duì)照品溶液2、4、6、8、10、12μL注入液相色譜儀，測(cè)定峰面積，以峰面積和進(jìn)樣量求得回歸方程y=1.2937x +0.3404， R2=0. 9996，表明在0.424～2.544μg有良好線性關(guān)系。

2.2.6精密度實(shí)驗(yàn)精密吸取對(duì)照品溶液10μL，重復(fù)進(jìn)樣6次，測(cè)得峰面積，其RSD為0.92%，表明儀器精密度良好。

2.2.7穩(wěn)定性試驗(yàn)精密吸取阿魏酸標(biāo)準(zhǔn)品溶液10μL，按0、4、8、12、16、24h 進(jìn)樣1次，記錄峰面積積分值，結(jié)果表明：阿魏酸標(biāo)準(zhǔn)品穩(wěn)定性良好，RSD為1.5%。

2.2.8重復(fù)性試驗(yàn)取同一批凝膠劑6份，按阿魏酸供試品制備方法制備供試品溶液，按“2.2.1”色譜條件進(jìn)樣6次，計(jì)算阿魏酸平均含量為11.4mg/g，RSD為0.55%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.2.9加樣回收率實(shí)驗(yàn)精密量取兩份1mL樣品溶液：向其中一份精密添加阿魏酸對(duì)照品溶液，定容至50mL，測(cè)得平均回收率為96.8%，RSD為1.56%。

2.2.10阿魏酸含量測(cè)定精密吸取供試品溶液10μL，液相色譜儀，記錄峰面積積分值，代入回歸方程，計(jì)算得出阿魏酸含量為11.2mg/g。

2.3山苓祛斑凝膠劑TLC定性鑒別按2015版《中國(guó)藥典》一部及附錄（0502）薄層色譜法對(duì)祛斑凝膠劑中山藥、當(dāng)歸及茯苓進(jìn)行TLC定性鑒別[7]，供試品色譜中，在與對(duì)照藥材、對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)，陰性無(wú)干擾。

按文獻(xiàn)[8]對(duì)山苓祛斑凝膠劑中的尿囊素進(jìn)行薄層鑒定：取山苓祛斑凝膠劑10g，加入適量甲醇超聲溶解，溶解后吸取10μL點(diǎn)于硅膠GF254板，以氯仿∶乙酸乙酯∶丙酮∶甲酸∶甲醇（1∶8∶1∶1∶2）為展開(kāi)劑，15%的對(duì)二甲氨基苯甲醛的硫酸乙醇溶液為顯色劑。供試品色譜中，在與對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同黃綠色斑點(diǎn)，且陰性樣品無(wú)干擾。

3討論

3.1波長(zhǎng)選擇經(jīng)紫外光譜掃描，測(cè)得尿囊素在224nm處有最大吸收，阿魏酸在316nm處有最大吸收，故本文分別選擇224nm作為尿囊素的檢測(cè)波長(zhǎng)，316nm作為阿魏酸的檢測(cè)波長(zhǎng)。

3.2流動(dòng)相的選擇原有用甲醇-水（1∶9）測(cè)定尿囊素含量，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)其分離效果不好，分離度不能達(dá)到分析要求；甲醇

-磷酸二氫鉀緩沖液（2∶98）比例的極性太大，而純水對(duì)色譜柱的損害較大。經(jīng)摸索最后采用乙腈-0.085%磷酸-水

（5∶95） 作為流動(dòng)相，基本能夠達(dá)到較好的分離效果，尿囊素出峰時(shí)間大約在5.5min左右。重復(fù)性試驗(yàn)RSD為0.95%，加樣回收試驗(yàn)測(cè)得平均回收率為96.8%，RSD為1.56%也表明在此色譜條件下尿囊素的分離效果較為滿意。

研究通過(guò)測(cè)定山苓凝膠劑中尿囊素和阿魏酸的含量，初步確定了山苓凝膠劑的質(zhì)量控制方法。所建立的方法簡(jiǎn)單，準(zhǔn)確，分離度與重現(xiàn)性均好，可以用于控制山苓凝膠劑的質(zhì)量。

參考文獻(xiàn)

[1]

康金森，王雪飛，劉發(fā)，等.紅玉祛斑膠囊對(duì)黃褐斑模型小鼠的影響[J].中藥藥理與臨床，2013，29（4）：134-136.

[2]劉林，霍志斐，史樹(shù)堂，等.茯苓多糖的藥理作用概述[J].河北中醫(yī)，2010，32（9）：1427-1428.

[3]楊宏莉，李少春，張偉偉，等.山藥多糖的藥理作用[J].醫(yī)學(xué)研究與教育，2010，27（3）：80-82.

[4]樊靚，湯尚文，余海忠，等.山藥中尿囊素研究進(jìn)展[J].食品科學(xué)，2015，（3）：308-308.

[5]王海波，蔡寶昌.反相高效液相色譜法測(cè)定不同產(chǎn)地山藥中尿囊素的含量[J].中藥新藥與臨床藥理，2004，15（3）：190-192.

[6]胡杰，馮麗莉，崔福德.當(dāng)歸川芎中阿魏酸提取的研究[J].時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥，2004，15（11）：732-733.

[7]國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典（一部）[S].北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2015：57-58.

[8]凌育趙.淮山米粉中尿囊素的檢測(cè)及提取工藝研究[J].糧油食品科技，2005，13（3）：45-51.

[9]周進(jìn)，林世和，陳軍，等.正交試驗(yàn)法優(yōu)選祛斑凝膠的水提工藝[J].中醫(yī)藥導(dǎo)報(bào)，2015，21（9）：58-59.

[10]郭紅葉，匡穎，閆小平，等.祛斑凝膠劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2014，20（14）：45-47.

[11]劉芝蘭，王娟，沈平，等.當(dāng)歸中阿魏酸的提取和純化研究[J].高?；瘜W(xué)工程學(xué)報(bào)，2007，21（6）：1008-1012.

[12]賴寶林，王利勝，張升，等.中藥凝膠劑的研究進(jìn)展[J].中藥新藥與臨床藥理，2010，21（2）：211-213.

（編輯：陶希睿）