一氧化氮合酶與基質(zhì)金屬蛋白酶-9在孕婦胎膜早破中的表達(dá)

王占輝

(青島市膠州中心醫(yī)院產(chǎn)科, 山東 青島 266300)

【摘要】目的探討一氧化氮合酶(iNOS)與基質(zhì)金屬蛋白酶-9(MMP-9)在胎膜早破中的表達(dá)及其臨床意義。方法入選在我院進(jìn)行規(guī)律產(chǎn)檢的90例中足月胎膜早破者30例(tPROM組)，早產(chǎn)胎膜早破者30例(pPROM組)，正常足月妊娠并進(jìn)行剖宮產(chǎn)終止妊娠者30例(對(duì)照組)。分別采用免疫組織化學(xué)染色和ELISA法檢測(cè)胎膜、血清及羊水中iNOS和MMP-9的表達(dá)，并通過(guò)HE染色檢測(cè)是否患有絨毛膜羊膜炎。結(jié)果iNOS在pPROM組胎膜中的表達(dá)高于tPROM組(P<0.01)和對(duì)照組(P<0.01),在tPROM和對(duì)照組中表達(dá)無(wú)顯著差異(P>0.05)。MMP-9在PROM組胎膜、血清及羊水中的表達(dá)均高于正常組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。結(jié)論iNOS和MMP-9的表達(dá)水平與PROM的發(fā)生密切相關(guān)，且iNOS和MMP-9的表達(dá)相互關(guān)聯(lián)。

【關(guān)鍵詞】基質(zhì)金屬蛋白酶; 一氧化氮合酶; 早產(chǎn)胎膜早破; 足月胎膜早破

【中圖分類號(hào)】R 714.15+1【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】A

收稿日期：( 2014-01-07； 編輯： 張文秀)

The clinical significance of inducible nitric oxide synthase and matrix metalloproteinases-9 in patients with premature rupture of membranesWANG Zhanhui

(DepartmentofObstetrics,JiaozhouCentralHospitalofQingdao,Qingdao266300,Shandong,China)

Abstract【】ObjectiveTo explore the clinical significance of matrix metalloproteinases-9 (MMP-9) and inducible nitric oxide synthase(iNOS) in patients with premature rupture of membranes and the relationship between MMP-9 and iNOS. Methods60 pregnant women underwent PROM and 30 women delivered by cesarean section before labor were divided into three groups due to their state: the term premature rupture of the membranes group (tPROM), the preterm premature rupture of the membranes group(pPROM), and the control group who had cesarean section without PROM. Immuno histochemical method was used to detect the expression level of MMP-9 and iNOS in fetal membranes. The level of MMP-9 in serum and amniotic fluid was detected by ELLSA. ResultsThe expression level of iNOS in fetal membranes in pPROM group was higher than that expressed in tPROM group(P<0.01) and control group(P<0.01). A statistically significant difference of the expression of MMP-9 was also found in fetal membranes(P<0.01), serum(P<0.01) and amniotic fluid(P<0.01) in PROM group than in control group. ConclusionThe expression level of iNOS and MMP-9 has close relationship with PROM.

【Key words】Matrix metalloproteinase-9; Nitric oxide synthase; Preterm premature rupture; Term preterm rupture

胎膜早破(premature rupture of membranes，PROM)是指孕婦在臨產(chǎn)前胎膜發(fā)生破裂，根據(jù)發(fā)生時(shí)間不同，會(huì)對(duì)母兒造成不同程度的危害。若在妊娠滿37周后出現(xiàn)稱為足月胎膜早破(premature rupture of membranes of term，tPROM)，在28周到37周出現(xiàn)稱為早產(chǎn)胎膜早破(preterm premature rupture of membranes，pPROM)[1]。統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)，PROM在足月妊娠和早產(chǎn)中的發(fā)生比例分別為10%和3.5%[2]。胎膜早破是引起早產(chǎn)、圍生期胎兒死亡的常見(jiàn)原因之一，國(guó)內(nèi)外研究人員雖對(duì)其發(fā)病原因和發(fā)病機(jī)制進(jìn)行了大量研究，提出多種觀點(diǎn)(如代謝失衡)[3]，但其確切病因及病理目前尚未完全明確。一氧化氮合酶(iNOS)和基質(zhì)金屬蛋白酶-9(MMP-9)被認(rèn)為是與調(diào)節(jié)病理部位代謝密切相關(guān)的兩個(gè)因素，目前對(duì)其在癌變[4-5]、感染[6]部位的變化及作用機(jī)理研究較多，但是鮮有關(guān)于iNOS、MMP-9與PROM關(guān)系的報(bào)道。了解iNOS、MMP-9和PROM的關(guān)系對(duì)PROM的預(yù)防、診斷和治療具有重要意義。本研究旨在通過(guò)檢測(cè)MMP-9和誘導(dǎo)型iNOS在早產(chǎn)、足月胎膜早破組和正常足月妊娠組的胎膜組織中的表達(dá)，探討其與PROM發(fā)病的關(guān)系，現(xiàn)報(bào)告如下。

1資料與方法

1.1研究對(duì)象選取于2012年6月1日到2013年9月30日在我院進(jìn)行規(guī)律產(chǎn)檢，并于28周以后發(fā)生胎膜早破的病例60例，其中足月胎膜早破者30例(tPROM組)，早產(chǎn)胎膜早破者30例(pPROM組)，選取正常足月妊娠并進(jìn)行剖宮產(chǎn)終止妊娠者30例作為對(duì)照組。三組孕婦年齡在23～35歲之間，平均(27.93±5.48)歲，使用SPSS進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析后發(fā)現(xiàn)各組孕婦的年齡和孕產(chǎn)次均無(wú)顯著差異(P>0.05)。

1.2儀器與試劑儀器：離心機(jī)(Thermo)，酶標(biāo)儀(Thermo)，石蠟包埋機(jī)(Leica)，石蠟切片機(jī)(Leica)。試劑：蘇木素伊紅染色試劑盒，iNOS兔抗人多克隆抗體，二步法抗兔、鼠通用型免疫組化檢測(cè)試劑盒，人基質(zhì)金屬蛋白酶-9定量ELISA試劑盒等，以上試劑均購(gòu)自北京中杉生物技術(shù)公司

1.3診斷標(biāo)準(zhǔn)分別根據(jù)孕婦最后一次月經(jīng)時(shí)間準(zhǔn)確計(jì)算孕周。PROM診斷標(biāo)準(zhǔn)參照人衛(wèi)版教材《婦產(chǎn)科學(xué)》第七版。

1.4實(shí)驗(yàn)方法與步驟

1.4.1取樣方法 在進(jìn)行剖宮產(chǎn)手術(shù)前，首先對(duì)所有病例進(jìn)行常規(guī)靜脈取血3ml，術(shù)中抽取羊水3ml，置于-4℃冰箱過(guò)夜保存，離心，取上清，置于-20℃冰箱中保存待用。胎盤娩出后取近破口處的胎膜，用PBS沖洗3次，去掉蛻膜組織和血跡。將取出的樣品分為兩份，分別用于HE染色和免疫組化染色。

1.4.2切片與染色①石蠟切片：將樣品做好標(biāo)記后分別進(jìn)行常規(guī)4%多聚甲醛固定，24～48h后依次進(jìn)行脫水、透明、浸蠟、包埋、切片、烤片。②經(jīng)常規(guī)脫蠟、水化后一部分進(jìn)行HE染色，鏡檢。③按照試劑盒說(shuō)明分別對(duì)切片進(jìn)行iNOS、MMP-9免疫組化染色。首先將剩余樣片用血清進(jìn)行封閉，分別加一抗4℃孵育過(guò)夜，后加二抗室溫孵育1h。最后進(jìn)行封片，鏡檢。④用ELISA法檢測(cè)血清和羊水中iNOS和MMP-9的含量：從冰箱中取出樣品，室溫溶解后，配制標(biāo)準(zhǔn)品，然后加樣，經(jīng)過(guò)孵育、洗滌、顯色、終止后，于酶標(biāo)儀上450nm波長(zhǎng)下進(jìn)行吸光度(OD值)測(cè)定。⑤HE染色鏡檢每個(gè)視野中中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)情況，每個(gè)高倍鏡視野中大于11個(gè)則判斷患有絨毛膜羊膜炎。參照Fromwitz綜合記分法對(duì)免疫組化鏡檢照片進(jìn)行半定量分析，并根據(jù)陽(yáng)性細(xì)胞百分率及顯色深淺評(píng)分，評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)見(jiàn)表1。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 對(duì)實(shí)驗(yàn)中得出的數(shù)據(jù)，使用SPSS軟件對(duì)計(jì)數(shù)資料進(jìn)行t檢驗(yàn)分析，對(duì)等級(jí)資料進(jìn)行秩和檢驗(yàn)分析，相關(guān)性分析用Spearman等級(jí)相關(guān)分析,當(dāng)P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表1　MMP-9和iNOS在胎膜組織中表達(dá)評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)

2結(jié)果

2.1HE染色觀察通過(guò)觀察胎膜石蠟切片HE染色結(jié)果，胎膜早破患者中，感染者23人，未感染者37人；對(duì)照組中，感染者6人，未感染者24人。兩組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=3.078,P=0.079)。

2.2iNOS在胎膜中的表達(dá)iNOS在pPROM組胎膜中的表達(dá)水平高于對(duì)照組，差異極顯著(P<0.01)，見(jiàn)表2；iNOS在tPROM組胎膜中的表達(dá)與對(duì)照組相比，差異不顯著(P>0.05)，見(jiàn)表3。

表2　iNOS在pPROM和對(duì)照組胎膜中的表達(dá)

表3　iNOS在tPROM和對(duì)照組胎膜中的表達(dá)

2.3MMP-9在胎膜和血清及羊水中的表達(dá)

2.3.1MMP-9在胎膜組織中的表達(dá)MMP-9在pPROM組胎膜中的表達(dá)高于對(duì)照組，差異極顯著(P<0.01)，見(jiàn)表4；其在tPROM組中的表達(dá)也高于對(duì)照組，差異顯著(P<0.05)，見(jiàn)表5；MMP-9在pPROM組和tPROM組中表達(dá)無(wú)顯著差異(P>0.05)。

2.3.2MMP-9在血清及羊水中的表達(dá)MMP-9在pPROM組血清和羊水中的表達(dá)高于對(duì)照組，差異極顯著(P<0.01)；其在tPROM組血清和羊水的表達(dá)也高于對(duì)照組，差異極顯著(P<0.01)；MMP-9在tPROM組血清中的表達(dá)高于pPROM組，表達(dá)差異顯著(P<0.05)，在羊水中差異極顯著(P<0.01)，見(jiàn)表6。

表4　MMP-9在pPROM和對(duì)照組胎膜中的表達(dá)

表5　MMP-9在tPROM和對(duì)照組胎膜中的表達(dá)

表6　MMP-9在血清及羊水中的表達(dá)

注：血清中pPROM組較對(duì)照組t=27.72，P=0.00；tPROM組與對(duì)照組比較t=26.24，P=0.00；pPROM組與tPROM組比較t=5.04，P=0.02；羊水中pPROM組較對(duì)照組t=0.48，P=0.00；tPROM組與對(duì)照組比較t=7.38，P=0.00；pPROM組與tPROM組比較t=0.60，P=0.00

2.4胎膜中iNOS和MMP-9的相關(guān)性分析iNOS和MMP-9在胎膜中的表達(dá)符合正相關(guān)(P<0.01)，見(jiàn)表7。

表7　iNOS和MMP-9的相關(guān)性

注：r=0.560；P=0.000

3討論

胎膜是一個(gè)無(wú)血管，無(wú)神經(jīng)的實(shí)體，通過(guò)羊水維持其穩(wěn)定性[7]，從而為胎兒提供一個(gè)穩(wěn)定的發(fā)育環(huán)境。而胎膜的完整性與膠原蛋白的分泌和代謝密切相關(guān)[8]。微生物感染[9]、營(yíng)養(yǎng)狀況不佳[10，11]、外傷、胎膜發(fā)育不良等狀況均會(huì)造成膠原的代謝失衡，從而引起胎膜早破。iNOS主要位于噬中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞，正常情況下不表達(dá)。iNOS在病理部位過(guò)量表達(dá)，引起異常部位NO濃度過(guò)高，參與體內(nèi)免疫調(diào)節(jié)過(guò)程。而外源刺激持續(xù)存在，NO持續(xù)升高會(huì)導(dǎo)致炎癥級(jí)聯(lián)瀑布反應(yīng)，進(jìn)一步推動(dòng)炎癥反應(yīng)的發(fā)展[12]。當(dāng)胎膜早破發(fā)生iNOS表達(dá)過(guò)量的NO，NO作為一種信號(hào)分子，參與抗菌，抗病毒[13]，由此進(jìn)一步保護(hù)胎兒正常發(fā)育。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，iNOS在pPROM中的表達(dá)顯著高于tPROM組和對(duì)照組，由此推斷iNOS在pPROM發(fā)病中起重要作用；由tPROM組和對(duì)照組差異不顯著，推斷iNOS在tPROM的發(fā)病中不起重要作用，且pPROM和tPROM的發(fā)病機(jī)理可能并不相同?；|(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)是Zn2+依賴型的肽鏈內(nèi)切酶，可降解多種細(xì)胞外基質(zhì)蛋白，并且受多種生理和病理過(guò)程的調(diào)控。MMP-9可降解胎膜中的膠原，而膠原又是決定胎膜機(jī)械性能的主要成分[2]，所以MMP-9在研究PROM發(fā)病機(jī)理中至關(guān)重要。此外MMP-9可激活包括CXCL5、CXCL6、CXCL8在內(nèi)的多種趨化因子配體，并可促進(jìn)釋放細(xì)胞表面受體(如，腫瘤壞死因子-α受體)從而改變局部微環(huán)境[14]。MMP-9有多個(gè)炎癥相應(yīng)元件，尤其是蛋白-1和NF-κB位點(diǎn)使其對(duì)炎癥刺激敏感[15]。本研究顯示MMP-9在pPROM和tPROM組的羊水和血清中的表達(dá)量均高于對(duì)照組，差異顯著；且其在pPROM和tPROM中的表達(dá)差異不顯著。MMP-9在三組胎膜中的免疫組化染色結(jié)果和羊水及血清中的結(jié)果相吻合，所以推斷組織中MMP-9的正常表達(dá)對(duì)維持胎膜完整性方面具有一定影響。這與前人的研究結(jié)果是一致的[16-17]。使用NO抑制劑會(huì)影響MMP-9基因的表達(dá)而抑制MMP-9的產(chǎn)生，從而影響胚胎著床。本實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了iNOS和MMP-9的分泌水平與PROM的發(fā)生存在關(guān)聯(lián)。研究表明NO與過(guò)氧化物陰離子反應(yīng)產(chǎn)生的過(guò)氧硝酸根是調(diào)節(jié)助氧化劑和NO毒性作用的關(guān)鍵[18]。NO可能是通過(guò)生成過(guò)氧硝酸根來(lái)間接激活MMP-9前體[19]，從而產(chǎn)生大量MMP-9降解胎膜中包括膠原在內(nèi)的細(xì)胞外基質(zhì)蛋白，造成胎膜早破。

4結(jié)論

iNOS和MMP-9的表達(dá)水平與PROM的發(fā)生密切相關(guān)，且iNOS和MMP-9的表達(dá)相互關(guān)聯(lián)，前者能夠刺激后者的表達(dá)。同時(shí)，也可根據(jù)iNOS對(duì)MMP-9的關(guān)聯(lián)作用，使用iNOS抑制劑，間接調(diào)控MMP-9的生成，以減少PROM的發(fā)生。

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