郭志峰

[摘要] 目的 探討血清中期因子（MK）、血小板因子4（PF4）及黏蛋白1（MUC1）的含量檢測在乳腺癌患者病情評估中的應用價值。 方法 選取2012年10月～2016年2月內(nèi)蒙古自治區(qū)赤峰市醫(yī)院（以下簡稱“我院”）腫瘤內(nèi)科收治的180例乳腺腫瘤患者作為觀察對象，依據(jù)組織病理分型將其分為乳腺良性腫瘤（90例）、乳腺癌（90例）。其中90例乳腺癌患者依據(jù)TNM分期分為Ⅰ/Ⅱ期（40例）、Ⅲ/Ⅳ期（50例）；根據(jù)分化程度分為高/中分化（50例）、低/未分化（40例）；根據(jù)淋巴結轉(zhuǎn)移情況分為淋巴結未轉(zhuǎn)移（50例）、淋巴結轉(zhuǎn)移（40例）。將同期在我院接受體檢的120名健康女性作為對照組。收集血清，比較各組之間血清MK、PF4以及MUC1的含量。實時熒光定量PCR（qPCR）檢測乳腺癌細胞內(nèi)MK、PF4以及MUC1過表達對基質(zhì)金屬蛋白酶（MMP）2和MMP9表達的影響，酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）檢測過表達MK、PF4以及MUC1對細胞上清中血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）A、VEGFB和VEGFC含量的影響。 結果 乳腺良性腫瘤患者MK和PF4含量明顯高于對照組（P < 0.05），乳腺癌患者血清中MK、PF4及MUC1的含量明顯高于乳腺良性腫瘤患者（P < 0.05）；Ⅲ/Ⅳ期、低/未分化、淋巴結轉(zhuǎn)移患者血清中MK、PF4以及MUC1含量明顯高于Ⅰ/Ⅱ期、高/中分化、淋巴結未轉(zhuǎn)移的患者（P < 0.05）；過表達MK、PF4以及MUC1組細胞內(nèi)MMP2和MMP9的mRNA含量明顯高于空載體對照組（P < 0.05）；過表達MK、PF4以及MUC1組細胞培養(yǎng)上清中VEGFA、VEGFB、VEGFC的含量明顯高于空載體對照組（P < 0.05）。 結論 乳腺癌患者血清中MK、PF4以及MUC1異常升高；MK、MUC1過表達可能通過調(diào)節(jié)MMP2、MMP9以及VEGFA、VEGFB、VEGFC的表達影響血管新生和乳腺癌的侵襲。MK、PF4和MUC1可作為新的判定乳腺癌生物學行為的血清標志物。

[關鍵詞] 乳腺癌；中期因子；血小板因子；黏蛋白；基質(zhì)金屬蛋白酶；血管內(nèi)皮生長因子

[中圖分類號] R737.9 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-7210（2017）04（b）-0099-04

[Abstract] Objective To investigate the application value of content determination of serum midkine （MK）， platelet factor 4 （PF4） and mucoprotein 1 （MUC1） in the disease assessment of patients with breast cancer. Methods One hundred and eighty patients with breast cancer admitted to Department of Medical Oncology， Chifeng Hospital （“our hospital” for short） from October 2012 to February 2016 were selected as research objects， and they were divided into benign breast tumor （90 cases） and breast cancer （90 cases）. The 90 cases with breast cancer were divided into Ⅰ/Ⅱ stage （40 cases） and Ⅲ/Ⅳ stage （50 cases） according to the TNM staging； they were divided into high/medium differentiation （50 cases） and low/undifferentiated （40 cases） dependent on differentiation grade； they were divided into without lymphatic metastasis （50 cases）， lymphatic metastasis （40 cases） according the conditions of lymphatic metastasis. Meanwhile， 120 cases of healthy women taken physical examination in our hospital at the same time were recruited as control group. The serum was collected， and the contents of MK， PF4 and MUC1 in all groups were compared. The effects of over-expression of MK， PF4 and MUC1 in the breast cancer cells for the expression of matrix metalloproteinase （MMP）2 and MMP9 were detected by real-time quantitative PCR （qPCR）. The effects of over-expression of MK， PF4 and MUC1 for the contents of vascular endothelial growth factor （VEGF）A， VEGFB and VEGFC in cellular supernatant were detected by enzyme-linked immunosorbent assay （ELISA）. Results The contents of serum MK and PF4 in patients with benign breast tumor were significantly higher than those of control group （P < 0.05）. While， the contents of serum MK， PF4 and MUC1 in patients with breast cancer were significantly higher than those of patients with benign breast tumor （P < 0.05）. The contents of serum MK， PF4 and MUC1 in patients with Ⅲ/Ⅳ stage， low/undifferentiated and lymphatic metastasi were significantly higher than those of patients with Ⅰ/Ⅱ stage， high/medium differentiation and without lymphatic metastasis （P < 0.05）. The contents of mRNA of MMP2 and MMP9 in the cells with over-expression of MK， PF4 and MUC1 were significantly higher than that of empty gsensor control group （P < 0.05）. Moreover， the contents of VEGFA， VEGFB and VEGFC in supernatant of cells with over-expression of MK， PF4 and MUC1 were significantly higher than that of empty gsensor control group （P < 0.05）. Conclusion The contents of serum MK， PF4 and MUC1 in patients with breast cancer were absolutely increased. Over-expression of MK and PF4 affects angiogenesis and the invasion of breast cancer may be through regulating the expression of MMP2， MMP9 and VEGFA， VEGFB， VEGFC. MK， PF4 and MUC1 can be as the new serum markers to judge the biological behavior of breast cancer.

[Key words] Breast cancer； Midkine； Platelet factor； Mucoprotein； Matrix metalloproteinase； Vascular endothelial growth factor

乳腺癌為女性最常見的惡性腫瘤[1]，其診療的關鍵是早期診斷，目前，常通過檢測腫瘤組織中的相關分子進行病理分期和腫瘤惡性程度的判定[2]。腫瘤組織的獲取需要穿刺活檢，屬于有創(chuàng)檢查的范疇，不適合病情的長期監(jiān)測和評估[3]；并且，一般影像學能查出時腫瘤灶已較大，穿刺活檢在發(fā)現(xiàn)早期腫瘤并進行診斷方面存在弊端，迫切需要新的臨床診斷標志物。中期因子（MK）在不同腫瘤中呈明顯高表達，且與腫瘤發(fā)生、發(fā)展、血管形成及轉(zhuǎn)移密切相關，嚴重影響預后[4]。血小板因子4（PF4）通過促進血小板的產(chǎn)生調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境進而加劇腫瘤生長[5]。Solassol等[6]在2010年首次報道，PF4在乳腺導管原位癌中的表達明顯高于非癌變組。PF4在其他的腫瘤早期也呈高表達，已成為結、直腸癌病變的獨立預測因子[7-8]。黏蛋白1（MUC1）作為黏蛋白家族成員，在乳腺癌細胞中也呈現(xiàn)高表達[9]，在乳腺癌診斷和治療中具有潛在的臨床應用價值。本研究探討了MK、PF4和MUC1在正常乳腺、乳腺良性腫瘤及乳腺癌人群血清中的表達情況，通過體外細胞實驗深入探究了MK、PF4和MUC1在乳腺癌進展中可能的機制。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2012年10月～2016年2月在內(nèi)蒙古自治區(qū)赤峰市醫(yī)院（以下簡稱“我院”）治療的乳腺腫瘤患者180例，均經(jīng)病理確診為乳腺腫瘤，且未接受化療、放療及內(nèi)分泌治療，無既往腫瘤病史，年齡31～70歲，中位年齡55歲，按組織病理學分為乳腺良性腫瘤（90例）、乳腺癌（90例）。按照UICC/AJCC 2009年第7版TNM分期標準[1]將90例乳腺癌患者分為Ⅰ/Ⅱ期（40例）、Ⅲ/Ⅳ期（50例）；根據(jù)分化程度分為高/中分化（50例）、低/未分化（40例）；根據(jù)淋巴結轉(zhuǎn)移情況分為未轉(zhuǎn)移（50例）、轉(zhuǎn)移（40例）。選取同期在我院接受體檢的120名健康女性作為對照組，年齡30～66歲，中位年齡53歲。所有患者均術前取靜脈血2 mL，取血漿置于-80℃保存待測。

1.2 主要試劑

MK（貨號ESK5522-96T）購自上海生工有限公司，PF4（Fitzgerald產(chǎn)品，貨號：55R-1999）為北京達科為生物技術有限公司，MUC1定量酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）試劑盒（貨號：E0413h）購自北京華夏遠洋科技有限公司，血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）A、VEGFB和VEGFC的產(chǎn)品均為Abnova產(chǎn)品，購于艾美捷科技有限公司。RPMI1640、TRIzol購自Gibco，逆轉(zhuǎn)錄酶（M-MLV）、RNA酶抑制劑、dNTP、Taq DNA聚合酶、瓊脂糖等均購于Promega公司。Lipofect2000購于Invitrogen。pcDNA4-MK、pcDNA4-PF4、pcDNA4-MUC1質(zhì)粒為我院外科實驗室質(zhì)粒庫保存的質(zhì)粒。

1.3 實驗方法

1.3.1 酶聯(lián)免疫吸附測定 采用全自動酶標儀VERSAmax（美國），按照ELISA試劑盒說明書加入不同濃度的標準品100 μL，待測樣品100 μL，100 μL的蒸餾水為空白對照。每孔加50 μL的酶標記溶液。封口膠密封酶標板，37℃孵育箱中孵育反應1 h。酶標板清洗5次。最后，用吸水紙徹底拍干。每孔各加入50 μL A、B顯色液。避光，20～25℃反應15 min，加入50 μL終止液終止。在450 nm波長下進行吸光度的測定，依據(jù)標準品讀數(shù)，繪制標準曲線。將待測樣品數(shù)據(jù)代入標準方程，計算得出結果。

1.3.2 細胞轉(zhuǎn)染 實驗分四組，分別轉(zhuǎn)染5 μg空載體、5 μg pcDNA4-MK、5 μg pcDNA4-PF4、5 μg pcDNA4-MUC1。按照Lipfectamine2000說明書，轉(zhuǎn)染MCF-7細胞24 h，收集細胞培養(yǎng)上清，ELISA檢測VEGFA、VEGFB、VEGFC的表達。實時熒光定量PCR（qPCR）檢測MMP2和MMP9的表達。

1.4 實時熒光定量PCR

Trizol試劑盒提取細胞樣本總RNA，將總RNA通過MMLV逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。qPCR檢測MK、PF4及MUC1的過表達效率及MMP2和MMP9的表達。

1.5 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 23.0軟件對相關數(shù)據(jù)進行分析和處理，計量資料以均數(shù)±標準差（x±s）表示，采用t檢驗，以P < 0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 MK、PF4和MUC1在乳腺癌患者血清中顯著高表達

乳腺良性腫瘤患者中MK、PF4的含量較對照組顯著增高（P < 0.05），而MUC1在對照組和乳腺良性腫瘤患者中的表達變化差異無統(tǒng)計學意義（P > 0.05）。與乳腺良性腫瘤患者比較，乳腺癌患者MK、PF4和MUC1均顯著上調(diào)（P < 0.05）。見表1。與淋巴結未轉(zhuǎn)移、Ⅰ/Ⅱ期、高/中分化患者比較，淋巴結轉(zhuǎn)移、Ⅲ/Ⅳ期、低/未分化患者中MK、PF4和MUC1的表達明顯上調(diào)（P < 0.05）。見表2～4。

2.2 過表達MK、PF4和MUC1促進VEGFA、VEGFB、VEGFC的表達

過表達MK和MUC1后，VEGFA、VEGFB、VEGFC的表達明顯上調(diào)（P < 0.01），而過表達PF4顯著抑制了VEGFA、VEGFB和VEGFC的表達（P < 0.05）。見表5。

2.3 過表達MK、PF4和MUC1促進MMP2和MMP9的表達

過表達MK、PF4和MUC1，qPCR檢測MMP2和MMP9的表達，MK、PF4和MUC1顯著促進了MMP2和MMP9的表達（P < 0.01）。見圖2。

3 討論

研究發(fā)現(xiàn)MK與腫瘤血管形成有關[10]。過去MK的研究多側(cè)重于檢測腫瘤組織中MK的表達，忽略了血清學的檢測[11]。本研究發(fā)現(xiàn)MK在乳腺癌患者血清中的表達水平明顯高于健康人和乳腺良性腫瘤患者，并且過表達MK促進VEGFA、VEGFB、VEGFC的表達和MMP2、MMP9的表達，其中VEGF與血管的形成有關，而MMP2和MMP9可能通過改變細胞的黏附參與腫瘤細胞的侵襲和遷移過程。由此推斷：MK參與乳腺腫瘤的進展可能通過促進VEGFs和MMPs的表達參與血管形成和癌細胞遷移。

PF4是內(nèi)源性血管生成抑制物，抑制VEGF功能而發(fā)揮作用。本研究也印證PF4抑制VEGF的表達，本研究發(fā)現(xiàn)，PF4在乳腺癌患者血清中呈明顯高表達趨勢。有研究認為PF4通過促進血小板的形成，參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展[7]。本研究的不足之處是未深入研究PF4對乳腺癌形成的影響機制。在今后的研究中，還將進一步深入探討PF4在乳腺癌進展中的功能機制。

MUC1為膜結合型黏液素分子，加速腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移[12]。在乳腺癌中常出現(xiàn)頂端定位不清，呈非極性分布且過度表達[13]。MUC1的抗原決定簇CA15-3通常作為血清癌胚抗原，用于監(jiān)測乳腺癌的復發(fā)轉(zhuǎn)移，在出現(xiàn)遠處轉(zhuǎn)移的乳腺癌患者中，有50%～80%的患者伴有CA15-3水平增高[14]。MUC1在乳腺癌組織中的陽性表達率較高（78%～90%）[15]。由于其在腫瘤組織尤其是在腺癌患者組織和血清中有較高的表達，使其成為一種新的腫瘤標志物。目前，臨床上已有檢測外周血MUC1表達的試劑盒，對于晚期和復發(fā)轉(zhuǎn)移患者的檢出率可達75%，但對于早期的乳腺癌患者檢出率較低[16]。本研究也發(fā)現(xiàn)，在正常健康人和乳腺良性疾病患者的血清中，MUC1表達量變化不明顯。因此推測：MUC1并非是乳腺癌早期診斷的理想標志物，MUC1可能在乳腺癌的動態(tài)追蹤、療效判定和預后診斷方面有一定的參考價值。

綜上所述，MK、PF4和MUC1在乳腺癌患者血清中顯著增高，并且與乳腺癌分期進展及淋巴結轉(zhuǎn)移密切相關，越晚期的乳腺癌患者，血清中MK、PF4和MUC1的含量越高，并且，乳腺良性腫瘤MUC1表達相比正常人變化不明顯，提示MUC1作為早期的預警標志物不理想。進一步的細胞實驗顯示：過表達MK和MUC1顯著促進VEGFA、VEGFB和VEGFC表達以及MMP2和MMP9的表達，提示，MK和MUC1可能參與乳腺癌組織中血管的形成，并且可能與乳腺癌的侵襲有關。總之，本研究提示，血清中MK和PF4可能作為早期的預警標志物，而MUC1可能參與乳腺癌的進展與侵襲。

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（收稿日期：2016-11-17 本文編輯：張瑜杰）