程銳等

[摘要] 目的 研究膜型基質(zhì)金屬蛋白酶-1（MT1-MMP）表達對肝細胞癌血管生成擬態(tài)（VM）形成的影響及機制。 方法 構(gòu)建靶向MT1-MMP的RNA干擾質(zhì)粒載體，轉(zhuǎn)染肝癌細胞系Bel7402，實時定量PCR及Western blot檢測干擾效果；在體外三維細胞培養(yǎng)體系中觀察其對VM管狀結(jié)構(gòu)形成的影響；Transell侵襲小室實驗檢測細胞侵襲能力。 結(jié)果 靶向抑制MT1-MMP的表達下調(diào)腫瘤細胞侵襲能力，影響肝癌細胞在三維細胞培養(yǎng)體系中VM管狀結(jié)構(gòu)的形成。 結(jié)論 MT1-MMP表達影響肝細胞癌VM的形成，可能成為肝細胞癌抗血管生成治療的新靶點。

[關(guān)鍵詞] 肝細胞癌；基質(zhì)金屬蛋白酶；血管生成擬態(tài)；RNA干擾

[中圖分類號] R735.7 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-7210（2014）12（c）-0013-04

Eeffects of expression of membrane-type 1 matrix metalloproteinase on vasculogenic mimicry formation in hepatocellular carcinoma

CHENG Rui CAI Xinran ZHOU Haohui KE Kun CHEN Yanling

Department of Hepatobiliary Surgery， Union Hospital Affiliated to Fujian Medical College， Fujian Province， Fuzhou 350001， China

[Abstract] Objective To investigate the effect of MT1-MMP on vasculogenic mimicry （VM） formation in hepatocellular carcinoma （HCC） and discuss its possible mechanisms. Methods RNA interfere plasmid targeting MT1-MMP was constructed and transfected into a HCC cell lines. Interference effect was detected by real time PCR and Western blot. VM networks in 3D cell culture system were observed with a microscope. Cell invasion assay was performed using 24-well transwell. Results Inhibition of MT1-MMP expression impaired VM network formation in vitro by down-regulating cell invasion. Conclusion MT1-MMP influences vasculogenic mimicry formation in HCC cell line and offers a potential molecular target for HCC antiangiogenesis therapy.

[Key words] Hepatocellular carcinoma； Matrix metalloproteinase； Vasculogenic mimicry； RNAi

1999年Maniotis等[1]在對眼葡萄膜色素瘤及轉(zhuǎn)移性皮膚黑色素瘤的研究中發(fā)現(xiàn)一種無內(nèi)皮細胞參與，由腫瘤細胞排列形成的管道結(jié)構(gòu)，血管造影證實其參與腫瘤的血液供應(yīng)。他們將這種血管樣結(jié)構(gòu)命名為血管生成擬態(tài)（vculogenic mimicry，VM）。VM合理的解釋了目前針對內(nèi)皮細胞的抗血管生成藥物實際療效與預(yù)期存在較大差距的原因，對經(jīng)典的抗腫瘤血管生成治療理論提出了挑戰(zhàn)[2]。后續(xù)的研究證實VM存在于多種高侵襲性的腫瘤，且存在VM的患者預(yù)后不佳[3-5]。原發(fā)性肝細胞癌是一種惡性程度、侵襲性高的實體腫瘤，手術(shù)切除后復(fù)發(fā)率高，預(yù)后較差[6-7]。肝細胞癌中VM的存在已被證實[8-10]。但目前肝細胞癌VM形成機制及治療靶點的研究仍處于起步階段。本研究擬探討膜型基金屬蛋白酶（MT1-MMP）表達對肝細胞癌VM生成的影響，為肝細胞癌抗血管生成治療提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 細胞株及主要試劑

Bel 7402肝癌細胞系購于中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會細胞庫；兔抗人MT1-MMP抗體購于英國Abcam公司；胎牛血清、DMEM培養(yǎng)基、PCR 引物、Trizol RNA提取試劑、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、Lipofectamine 2000TM脂質(zhì)體、質(zhì)粒抽提試劑盒購于美國Invitrogen公司；易必迪血管生成板（IBIDITM μ-slide）購于德國Ibidi公司；基質(zhì)膠購于美國Corning公司Tanswell侵襲小室購于美國Millipore公司；蛋白抽提試劑盒購于杭州碧云天生物科技有限公司；羊抗兔二抗、BCA蛋白定量試劑盒購于武漢博士德生物工程有限公司。

1.2 MT1-MMP的siRNA質(zhì)粒的構(gòu)建

根據(jù)RNA干擾序列設(shè)計原則，設(shè)計2條靶向MT1-MMP基因的RNA干擾靶點序列分別為ATCACTT-TCTGCATCCAGA和GTACTACCGTTTCAACGAA。合成含干擾序列的DNA雙鏈，酶切后連接入同一真核質(zhì)粒載體pGenesil 1.2中。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞，所獲克隆行PCR鑒定。

1.3 細胞轉(zhuǎn)染及MT1-MMP表達的檢測

Bel7402細胞株在含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)，置于37℃含5%CO2的溫箱中。細胞分為兩組：siRNA組使用RNA干擾質(zhì)粒載體進行轉(zhuǎn)染；陰性對照組使用陰性對照質(zhì)粒轉(zhuǎn)染；使用Lipofectamine 2000TM脂質(zhì)體進行質(zhì)粒轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染24 h后，消化貼壁生長的Bel7402細胞，1000 r/min離心5 min， 離心半徑為13.5 cm。收集細胞，PBS 洗滌兩次，轉(zhuǎn)移至EP管中，5000 r/min離心1 min，棄去上清。使用Trizol抽提總mRNA，按說明書使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將mRNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA分子。根據(jù)PCR引物設(shè)計的原則，軟件設(shè)計 PCR引物：上游5′-CTGCCTACCGACAAGATTGATG-3′；下游 5′-TCCCTTCCCAGACTT-TGATGTT-3′實時熒光定量PCR檢測各組細胞中MT1-MMP mRNA表達，磷酸甘油醛脫氫酶（GAPDH）作為內(nèi)參，每個樣本做3個復(fù)孔。結(jié)果采用2-△△CT法分析。

按蛋白抽提試劑盒說明書操作，抽提各組細胞的總蛋白，并用BCA蛋白定量試劑盒進行蛋白定量。行10%十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE），并轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上，經(jīng)含5%脫脂牛奶的TBST溶液封閉后，與兔抗人MT1-MMP抗體作用，二抗標記后進行顯色。用凝膠圖象分析系統(tǒng)處理膠片，采用Image J軟件進行相對定量分析。GAPDH作為內(nèi)參，每個樣本做3個復(fù)孔。

1.4 三維細胞培養(yǎng)

向IBIDITM μ-slide血管生成板中加入基質(zhì)膠，每孔加入10 μL，置于37℃靜置30 min待基質(zhì)膠塑形。收集轉(zhuǎn)染24 h后的細胞、制成細胞懸液，以2×105 個/孔的濃度加入到基質(zhì)膠表面，37℃培養(yǎng)48 h。顯微鏡觀察VM管狀結(jié)構(gòu)的形成情況。Transwell侵襲實驗檢測體外細胞侵襲力用50 mg/L Matrigel 1∶8稀釋液包被Transwell小室底部膜的上室面，4℃風(fēng)干。然后將小室放入培養(yǎng)板中，在上室加入100 μL預(yù)溫的無血清培養(yǎng)基，室溫下靜置30 min，使基質(zhì)膠水化。轉(zhuǎn)染后的細胞用PBS清洗2次，然后用含BSA的無血清培養(yǎng)基重懸細胞，調(diào)整細胞密度至1×105/mL，取細胞懸液100 μL加入Transwell小室，接著向24孔板下室加入500 μL含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基，置于37℃ 5% CO2的培養(yǎng)箱中孵育24 h。取出Transwell小室，用棉簽擦去上室內(nèi)的細胞；用甲醛固定細胞，后用0.1%結(jié)晶紫染色；400倍光鏡下隨機計數(shù)10個視野內(nèi)的細胞數(shù)，取穿膜平均細胞數(shù)值表示腫瘤細胞侵襲能力，并進行統(tǒng)計處理。實驗重復(fù)3 次。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 17.0統(tǒng)計學(xué)軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差（x±s）表示，兩組間比較采用t檢驗。以P < 0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 成功構(gòu)建并轉(zhuǎn)染靶向MT1-MMP基因的siRNA質(zhì)粒載體

使用質(zhì)粒抽提試劑盒抽提質(zhì)粒后，用限制性內(nèi)切酶酶切后行電泳檢測并測序，結(jié)果顯示酶切片段大小正確，構(gòu)建成功。見圖1。

1：靶向膜型基質(zhì)金屬蛋白酶-1的干擾序列PCR產(chǎn)物；2：質(zhì)粒載體；DL2000 Marker（從左往右）：100、250、500、750、1000、2000 bp

圖1 構(gòu)建的RNA干擾質(zhì)粒載體用Hind Ⅲ+EcoRⅠ酶切后電泳圖

2.2 siRNA質(zhì)粒轉(zhuǎn)染抑制MT1-MMP表達

使用Lipofectamine 2000TM脂質(zhì)體，將抽提獲得的siRNA質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)染Bel7402肝癌細胞系，熒光顯微鏡下觀察可見細胞有熒光報告基因的表達（圖2，封三），表明轉(zhuǎn)染獲得成功。質(zhì)粒轉(zhuǎn)染24 h后的收集各組細胞，實時定量PCR和Western blot檢測干擾后MT1-MMP的表達情況結(jié)果顯示，siRNA組相對于陰性對照組，MT1-MMP基因的mRNA表達及蛋白表達均明顯下調(diào)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05）（圖3）。

2.3 三維細胞培養(yǎng)

在三維細胞培養(yǎng)體系中對各組細胞進行培養(yǎng)，實驗結(jié)果顯示，陰性對照組能形成典型的VM管腔樣結(jié)構(gòu)，而siRNA組細胞不能形成VM結(jié)構(gòu)（圖4，封三）。提示靶向抑制Bel7402細胞中MT1-MMP的表達影響其在三維細胞培養(yǎng)體系中VM管狀結(jié)構(gòu)的形成。

2.4 Transwell侵襲實驗

為研究MT1-MMP表達抑制對肝癌細胞侵襲力的影響，本研究采用了Transwell侵襲實驗，將兩組細胞接種到Matrigel侵襲小室中，培養(yǎng)24 h后，對穿過Matrigel膠的細胞進行計數(shù)。結(jié)果顯示，siRNA組穿膜細胞的數(shù)量較陰性對照組明顯下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05），提示MT1-MMP的下調(diào)可降低Bel7402細胞的侵襲力。見圖5，封三。

3 討論

血管生成是實體腫瘤生長的決定性因素，而抗血管生成已成為腫瘤治療的研究熱點[11]。肝細胞癌血供豐富，且惡性程度高，手術(shù)切除率低，是抗腫瘤血管生成靶向治療的理想對象。經(jīng)典的肝癌血管生成靶向治療主要針對內(nèi)皮細胞，代表藥物如索拉非尼，目前已廣泛應(yīng)用于臨床。然而這類靶向藥物的實際臨床療效與預(yù)期仍有較大差距[12]。肝細胞癌中VM的發(fā)現(xiàn)表明這類腫瘤存在不依賴內(nèi)皮細胞的其他供血方式，從而為提高靶向藥物的療效提供了新的研究方向。

目前對于肝細胞癌VM形成的機制尚不明確，研究發(fā)現(xiàn)可能與基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMPs）密切相關(guān)[13]。MMPs由鋅離子依賴性蛋白酶組成，可以直接或間接作用于細胞外基質(zhì)中的多種主要成分，并通過影響細胞黏附分子、生長因子及趨化因子等的生理功能，參與腫瘤細胞的遷移及血管生成過程，與腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移等病理生理過程密切相關(guān)，在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中起著重要作用[14]。MT-MMP是MMPs的一個亞家族，現(xiàn)發(fā)現(xiàn)有6種MT-MMP。其中MT1-MMP與惡性腫瘤的侵襲行為關(guān)系密切，且在原發(fā)性肝細胞癌中高表達[15]。Hess等[16]的研究發(fā)現(xiàn)通過阻斷磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）信號通路，抑制MT1-MMP的表達，能夠減少MMP2的活化，從而減少黑色素瘤細胞血管擬態(tài)的形成。故本研究認為，在原發(fā)性肝細胞癌中，MT1-MMP表達的上調(diào)很可能是血管生成擬態(tài)形成的重要機制，而MT1-MMP極有可能成為減少肝細胞癌中血管生成擬態(tài)形成、實現(xiàn)抗腫瘤血管生成治療的有效靶點。

基于以上認識，本研究構(gòu)建了靶向MT1-MMP的RNA干擾質(zhì)粒載體，轉(zhuǎn)染至肝癌細胞株Bel7402中，該細胞株已被證實在體外三維培養(yǎng)體系中能夠形成VM管狀結(jié)構(gòu)。而本實驗中所使用的RNAi質(zhì)粒載體是將兩個作用于MT1-MMP基因不同部位mRNA的shRNA構(gòu)建入同一質(zhì)粒載體，每個shRNA能獨立發(fā)揮RNA干擾的作用，從而更有效的實現(xiàn)基因沉默。實驗結(jié)果顯示，相對于對照組，siRNA組細胞中MT1-MMP在mRNA和蛋白水平的表達均受到明顯抑制。與此同時，siRNA組細胞在三維培養(yǎng)體系中形成VM管狀結(jié)構(gòu)的能力也被抑制。此外，本研究對轉(zhuǎn)染后細胞的侵襲能力及MMP2、MMP9的活性進行了檢測，結(jié)果顯示抑制MT1-MMP的表達下調(diào)腫瘤細胞侵襲能力，而這可能是MT1-MMP影響肝細胞癌VM形成的潛在機制。

綜上所述，MT1-MMP表達能通過改變肝細胞癌細胞侵襲能力影響VM的形成，可能成為肝細胞癌抗血管生成治療的新靶點。

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（收稿日期：2014-05-25 本文編輯：任 念）