胡繼衛(wèi)，洪 慧，張景華，陳晶晶，李玉鳳，張順禮

河北省唐山市人民醫(yī)院 乳腺外科（唐山 063001）

乳腺癌是女性常見的惡性腫瘤之一［1］。乳腺癌基因治療是一種全新的生物療法，可能成為臨床重要的輔助治療手段［2］。線粒體融合素基因－2（Mfn2）是我國學者陳光慧等［3］利用差異顯示法得到的一個新基因，其產(chǎn)物可抑制血管平滑肌細胞增殖，并可通過活化線粒體凋亡途徑促進血管平滑肌程序性細胞死亡［4］。研究［5］顯示，Mfn2基因在正常乳腺組織中高表達，而在乳腺癌組織及細胞中表達顯著降低，而過表達Mfn2基因可以顯著抑制人乳腺癌 MCF－7細胞增殖。表皮生長因子受體（EGFR）及其配體表皮生長因子（EGF）在一系列惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起重要作用，研究證實高表達EGFR的腫瘤患者預后較差［6］。本研究旨在初步探討Mfn2基因抑制乳腺癌細胞增殖的機制是否與抑制EGFR、EGF表達相關，為乳腺癌的基因治療提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料 人乳腺癌 MCF－7細胞（武漢大學中國典型培養(yǎng)物保藏中心）；重組真核表達質粒pEGFP－Mfn2（華大基因公司制備）；pEGFP－N1質粒（華大基因公司制備）；引物（北京三博志遠生物技術有限公司合成）。

1.1.2 試劑 DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清和胰蛋白酶（美國Gibco公司）；青霉素、鏈霉素雙抗（北京索萊寶公司）；Trizol、LipofectamineTM2000和 RT－qPCR試劑盒（美國Invitrogen公司）；瓊脂糖、T4 DNA連接酶和2 000bp DNA Marker（美國Promega公司）；鼠抗人 Mfn2多克隆抗體（美國Santa Cruz公司）；兔抗人EGFR及EGF多克隆抗體（北京博奧森生物技術有限公司）；免疫組化染色試劑盒SP－9000、DAB顯色劑（北京中杉金橋生物技術有限公司）；TritonX－100（美國Sigma公司）；逆轉錄cDNA第1鏈合成試劑盒（美國Fermentas公司）；限制性內切酶XhoⅠ、HindⅢ（TAKARA公司）；MTT、DMSO和PI（美國 AMRESCO公司）；10mg／mL RNaseA（北京索萊寶）。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) MCF－7細胞培養(yǎng)于DMEM 完全培養(yǎng)基（10%胎牛血清、100U／mL青霉素和100μg／mL鏈霉素），置于37℃、5%CO2的細胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)。實驗分為3組：對照組、pEGFP－N1組和pEGFP－Mfn2組。

1.2.2 質粒的構建及檢測 人Mfn2基因序列的開放閱讀框（ORF）特異性引物序列5＇端分別引入XhoⅠ和HindⅢ酶切位點序列。RT－PCR方法擴增出正常小鼠肝臟組織中全長Mfn2cDNA，大小為2 274bp。用XhoⅠ及HindⅢ雙酶切和T4DNA連接酶連接，鑒定陽性克隆，然后測序。逆轉錄引物序 列 為：上 游 5＇－ATCCTCGAGGCCACCATG TCCCTGCTCTTTTCTCG－3＇；下游 5＇－ATCAAGC TTTCTGCTGGGCTGCAGGTACT－3＇。

1.2.3 質粒轉染及轉染效率檢測 取對數(shù)生長期細胞，消化收集并調整細胞的密度為1.0×105個／孔接種于6孔板中，培養(yǎng)至80%融合度。加入不含血清DMEM培養(yǎng)基稀釋的質粒4μg，終量為100μL，對照組不加質粒；用不含血清DMEM培養(yǎng)基稀釋10μL LipofectamineTM2000至100μL，輕輕混合上述兩液，室溫中放置25min。隨后加入800μL無血清DMEM輕輕搖勻加入細胞中。轉染的細胞培養(yǎng)6h后，各孔加入1mL含20%血清的DMEM。48h后熒光顯微鏡檢測各組轉染效率。

1.2.4 RT－qPCR 檢測各組中 Mfn2mRNA 的表達 轉染的細胞培養(yǎng)48h后提取細胞總RNA定量。取1μg總RNA進行逆轉錄cDNA。RT－qPCR反應體系（20μL）：cDNA 1μL、SYBR Mix 10μL、上下游引物（各25mol／L）0.5μL、ddH2O補至20μL，冰上混合；94℃變性5min，94℃15s，60℃20s，72 ℃ 1min，共30個循環(huán)。內參GADPH。實驗結果用Comparative Delta－delta Ct法定量分析。Mfn2引物：上游5＇－TTCCACAA GGTGAGTGAGC－3＇，下 游 5＇－TTAGCAGACA CAAAGAAGATGC－3＇；GADPH 引 物：上 游 5＇－GAG AGGGAAATCGTGCGTGAC－3＇，下 游：5＇－CATCT GCTGGAAGGTGGACA－3＇。

1.2.5 免疫細胞化學檢測 Mfn2、EGFR、EGF蛋白的表達 對數(shù)生長期的細胞消化收集重懸，細胞調至密度4×104個／mL。12孔板每孔放置無菌玻片并滴加細胞懸液2mL培養(yǎng)2～3d，待細胞在玻片上爬至80%時，轉染質粒pEGFP－Mfn2、空質粒pEGFP－N1，并設對照組。培養(yǎng)48h后，4%多聚甲醛固定 30min，加 0.3% 的 PBS－Triton X 作 用10min，3%H2O2作用10min，玻片置載玻片濾紙吸干，加5%BSA工作液封閉，37℃濕盒中孵育30min，濾紙吸去封閉液，不洗；分別滴加一抗（Mfn2為1∶20稀釋，EGFR、EGF為1∶100稀釋），對照組用PBS代替，放于濕盒中4℃過夜；滴加PV－6000二抗，37℃ 濕盒中孵育35min；DAB顯色，自來水終止反應，蘇木素復染，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，鏡檢。以細胞質出現(xiàn)棕黃色或黃褐色顆粒為陽性，在高倍視野（×200）下，每張切片隨機觀察5個視野，計數(shù)每個視野陽性染色細胞，并計算其百分比。

1.2.6 MTT法檢測各組細胞增殖情況 將MCF－7細胞按2×103個／孔接種于96孔板中，24h后轉染質粒，每組3個復孔。對照組、pEGFP－N1組和pEGFP－Mfn2組每孔加入0.2μL質粒和0.5μL Lip 2000，補無血清DMEM至100μL，6h后每孔再加入100μL含20%血清的DMEM繼續(xù)培養(yǎng)，同時設不加質粒及Lip 2000的空白對照組。分別在24、48h每孔均更換200μL 10%血清的DMEM，加入20μL 5mg／mL MTT，避光溫育4h。去除舊培養(yǎng)基，所有孔中加入150μL DMSO，震蕩10min溶解。在490nm處測吸光度（A）值。細胞增殖抑制率＝（1－實驗組的A值／空白對照組的A值）×100%。

1.2.7 流式細胞術檢測細胞周期 對數(shù)生長期的MCF－7細胞接種在25cm2培養(yǎng)瓶，每瓶1×106個細胞，培養(yǎng)24h。轉染質粒，48h后消化收集細胞，75%冰乙醇固定過夜（4℃），上機前用預冷的PBS洗細胞3次并重懸。然后加入RNA酶、碘化丙啶（PI）避光染色15min，流式細胞儀檢測。

1.3 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 20.0軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，組間比較采用t檢驗，計數(shù)資料以率表示，組間比較采用χ2檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 pEGFP－Mfn2質粒構建成功

PCR產(chǎn)物cDNA在瓊脂糖凝膠電泳顯示為2 274bp左右，與預測大小基本相符。測序結果顯示重組表達質粒中插入的序列與已知的Gen Bank中Mfn2基因的序列基本一致，提示pEGFP－Mfn2質粒構建成功（圖1）。

2.2 熒光顯微鏡檢測各組轉染效率

熒光顯微鏡檢測3組細胞轉染后的綠色熒光強度，結果顯示轉染空質粒pEGFP－N1組和pEGFPMfn2組轉染率分別為（49.15±2.04）%，（51.10±2.18）%，均高于對照組（0.58±0.21）%，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），提示質粒轉染成功。

圖1 Mfn2開放閱讀框PCR產(chǎn)物

2.3 RT－qPCR檢測各組中 Mfn2mRNA的表達

與對照組和轉染pEGFP－N1組相比，pEGFPMfn2質粒組Mfn2mRNA表達水平顯著升高（P＜0.05）（圖2）。

圖2 實時熒光定量PCR法檢測各組中Mfn2mRNA的表達

2.4 免疫細胞化學檢測Mfn2蛋白的表達

pEGFP－Mfn2組Mfn2蛋白表達率為46.00%，顯著高于對照組15.00%及轉染pEGFP－N1組12.00%，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。

2.5 MTT法檢測各組細胞增殖結果

轉染24h后3組細胞增殖抑制率無顯著差異（P＞0.05）。轉染48h后，與對照組和pEGFP－N1組比較，pEGFP－Mfn2組細胞抑制率顯著升高（P＜0.05）（表1）。

表1 3組細胞增殖抑制率比較（n＝3，%，±s）

表1 3組細胞增殖抑制率比較（n＝3，%，±s）

注：與對照組比較，＊＊P＜0.01；與pEGFP－N1組比較，＃＃P＜0.01

組別4.68±0.88 4.05±0.78 pEGFP－N1組 5.17±0.72 8.34±2.72 pEGFP－Mfn2組 5.58±0.81 68.63±3.12＊＊＃＃24h 48h對照組

2.6 流式細胞儀檢測各組細胞周期分布

轉染后對照組、pEGFP－N1組和pEGFP－Mfn2組G0／G1期細胞百分率分別為（62.00±1.41）%、（61.00±1.63）%和（69.75±0.96）%，與對照組及pEGFP－N1組比較，PEGFP－Mfn2組細胞 G0／G1期比例顯著升高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；而空白組及轉染pEGFP－N1組相比，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）（圖3）。pEGFP－Mfn2質粒轉染48h后，MCF－7細胞明顯阻滯至G0／G1期。

圖3 流式細胞術檢測各組細胞DNA含量

2.7 免疫細胞化學檢測EGFR和EGF蛋白的表達

對照組、pEGFP－N1組及pEGFP－Mfn2組EGF蛋白表達率分別為（84.12±13.45）%、（85.74±10.22）% 和（12.14±3.42）%，pEGFP－Mfn2 組EGF蛋白表達率顯著低于其余兩組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。

對照組、pEGFP－N1組及pEGFP－Mfn2 組EGFR蛋白表達率分別為（86.45±9.04）%、（89.41±16.14）% 和（18.31±4.37）%，pEGFP－Mfn2 組EGFR蛋白表達率顯著低于其余兩組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。

3 討論

Mfn2又稱為增殖抑制基因（HSG）［3］，是我國學者陳光慧通過差異顯示技術獲得的一個新基因，它的編碼產(chǎn)物HSG／Mfn2可以通過抑制Ras信號傳導途徑使細胞周期阻滯于G0／G1期，從而抑制細胞增殖。研究證明HSG與多種疾病密切相關，近年來它作為一種抑癌基因得到人們的重視［8］。有研究應用免疫組化法檢測HSG在結直腸正常黏膜、良性病變及惡性腫瘤組織中的不同表達變化，結果顯示結直腸癌組織中HSG蛋白表達顯著低于良性腺瘤和正常黏膜組織，提示HSG蛋白在結直腸癌演變中具有重要意義［9］。

基因治療是指將外源功能基因導入患者的細胞中，以糾正先天代謝異常、提供新的功能或補償基因缺失的治療方法。乳腺癌基因治療途徑主要包括抑癌基因治療、原癌基因治療、多藥耐藥基因治療，以及免疫基因治療等，Mfn2導入治療即抑癌基因治療方法之一［10］。本實驗在 MCF－7細胞中成功轉染了質粒pEGFP－Mfn2，48h后用熒光顯微鏡檢測結果顯示轉染效率約50%，并用RT－qPCR法和免疫細胞化學法檢測到轉染質粒pEGFP－Mfn2組Mfn2 mRNA和蛋白水平都顯著升高，說明過表達Mfn2基因在 MCF－7細胞中成功轉染且表達。隨后用MTT法檢測過表達Mfn2基因對MCF－7細胞增殖的影響，結果提示與對照組和轉染空載體組相比，轉染pEGFP－Mfn2質粒組48h后細胞生長受到明顯抑制，且有顯著性差異（P＜0.05），說明在 MCF－7細胞中過表達Mfn2基因可以抑制腫瘤細胞的生長和增殖，進一步證實了Mfn2基因能夠抑制腫瘤的增殖。

細胞周期是細胞生命活動的一個基本過程，細胞分裂和DNA合成是細胞周期的兩個主要事件。在本實驗中，轉染質粒pEGFP－Mfn2組 MCF－7細胞中G0／G1期占（69.75±0.96）%，顯著高于空白對照組和轉染穿梭質粒組，說明在MCF－7細胞內過表達Mfn2基因，能將細胞周期阻滯于G0／G1期，從而干擾細胞周期的進展，抑制癌細胞的增殖。大鼠的體內和體外研究［11－12］顯示，Mfn2基因過表達能抑制血管平滑肌細胞增殖，細胞周期阻滯在G0／G1期，與本實驗結果相符。

EGFR及其配體EGF在許多人類腫瘤中都有表達。EGFR與EGF結合后通過作用于Ras信號通路，影響與增殖相關的轉錄因子活化及基因轉錄，加速癌細胞的增殖及分化，從而促進細胞中DNA、RNA、蛋白以及細胞外大分子的合成，加速腫瘤細胞的增殖和分化程度，同時EGF還能誘導腫瘤細胞中EGFR的表達，進一步增加腫瘤細胞的惡性程度［7］。在乳腺癌中，EGFR的表達水平與較差的預后和較低的生存率相關［13－14］。用藥物或者其他干預方法來阻斷EGFR的活性，抑制其磷酸化和信號傳導，能夠起到多種途徑的抗腫瘤作用，增強放、化療的抗腫瘤療效［15］。本實驗表明，我們將過表達Mfn2基因轉染入乳腺癌細胞后，EGFR、EGF表達顯著降低，提示轉染Mfn2基因后，導致了EGFR、EGF表達水平的下降，可能是通過抑制Ras信號通路，來影響與增殖有關的轉錄因子活化及基因轉錄的程度，抑制腫瘤細胞的增殖，降低腫瘤細胞的惡性程度。

綜上所述，Mfn2基因過表達可抑制MCF－7細胞EGF與其受體EGFR的表達，將MCF－7細胞阻滯于G0／G1期，抑制癌細胞的增殖。

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