劉 樺，楊曉龍，唐 麗，胡開鋒，劉明佳，劉 戟△

1.四川大學(xué)華西基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與法醫(yī)學(xué)院 生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室（成都 610041）；2.成都醫(yī)學(xué)院 生物醫(yī)學(xué)系（成都 610500）

結(jié)腸癌是我國(guó)高發(fā)癌癥之一，是發(fā)生于結(jié)腸部位常見的消化道惡性腫瘤，目前主要通過手術(shù)和化學(xué)藥物治療，但其預(yù)后欠佳［1］。約50%結(jié)腸癌患者發(fā)現(xiàn)時(shí)已是中晚期，因此，尋找結(jié)腸癌早期篩查和評(píng)估預(yù)后的良好腫瘤標(biāo)志物一直是臨床研究的熱點(diǎn)。研究［2］表明，慢性炎癥是結(jié)腸癌的一個(gè)重要特征，炎癥因子通過調(diào)控腫瘤微環(huán)境，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移，因此尋找炎癥標(biāo)志物有利于結(jié)腸癌的診斷。

中性粒細(xì)胞明膠酶相關(guān)性脂質(zhì)運(yùn)載蛋白（neutrophil gelatinase－associated lipocalin，NGAL）參與抗微生物、抗氧化應(yīng)激來保護(hù)正常組織。在一些炎癥性疾病中，炎癥因子促進(jìn)NGAL表達(dá)上調(diào)。近年來研究［3］發(fā)現(xiàn)，NGAL在腫瘤中的表達(dá)不均一，依組織類型不同而表現(xiàn)各異。NGAL能夠通過激活誘導(dǎo)表皮細(xì)胞向間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)變（epithelialmesenchymal transition，EMT）來促進(jìn)癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移，其有望成為一種潛在的結(jié)腸癌診斷標(biāo)志物［4］。本研究通過對(duì)NGAL與結(jié)腸癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移關(guān)系的研究，以評(píng)價(jià)NGAL對(duì)結(jié)腸癌發(fā)生發(fā)展的潛在生物學(xué)功能。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

PCDNA3.1－NGAL質(zhì)粒購(gòu)買于上海艾博思生物有限公司；pet32a－tev、E.coilDH5α菌株、BL21－DE3菌株來自實(shí)驗(yàn)室保存；BamHⅠ和XhoⅠ限制性內(nèi)切酶、T4連接酶、DNA Maker、蛋白質(zhì) Maker購(gòu)于Fermentas公司；DNA膠回收試劑盒購(gòu)于Tiangen公司；異丙基硫代半乳糖苷（IPTG）、基質(zhì)膠購(gòu)于Sigma公司；內(nèi)毒素（LPS）購(gòu)于Sigma公司；NGAL酶聯(lián)免疫試劑盒購(gòu)于武漢新啟迪生物科技有限公司；人結(jié)腸癌細(xì)胞株SW480購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)，于－80℃凍存；NGAL抗體購(gòu)于 Cell Signal Technology公司，其余抗體購(gòu)于Santa Cruz公司；細(xì)胞培養(yǎng)基和胎牛血清購(gòu)于 Gibco公司；PVDF膜和ECL顯影液購(gòu)于Millipore公司；X光膠片購(gòu)于Kodak公司；其余化學(xué)試劑均為分析純。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) SW480在含10% 胎牛血清DMEM培養(yǎng)基中（100U／mL青霉素，100μg／mL鏈霉素），于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.2 重組質(zhì)粒構(gòu)建 根據(jù)NGAL基因序列設(shè)計(jì)引物。上游引物5＇CGGGATCCATGCCCCTAG GTCTCCTGT 3＇，下劃線部分為BamH Ⅰ酶切位點(diǎn)；下游引物5＇CCCTCGAGTCAGCCGTCGATAC ACTGG 3＇，下劃線部分為XhoⅠ酶切位點(diǎn)。以pcdna 3.1－NGAL質(zhì)粒為模板進(jìn)行PCR，PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳后，按照回收試劑盒說明書純化回收目的片段。將NGAL基因純化產(chǎn)物與載體pet32a－tev分別用BamHⅠ和XhoⅠ限制性內(nèi)切酶進(jìn)行雙酶切，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳后，切膠回收線性載體與目的基因片段［5］。將NGAL目的基因與pet32a－tev線性載體以2∶1用T4連接酶22℃連接1h后，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到大腸埃希菌感受態(tài)細(xì)胞E.coliDH5α中。挑取單克隆菌提質(zhì)粒，送公司（華大基因）測(cè)序。

1.2.3 NGAL的表達(dá)與純化將 pet32a－tev－NGAL載體轉(zhuǎn)化到BL21－DE3，涂在含100μg／mL氨芐青霉素的LB平板中，挑取單克隆于LB培養(yǎng)基中。加入IPTG（終濃度0.2mmol／L），18℃誘導(dǎo)過夜，離心半徑4cm，8 000r／min，離心15min，收菌。超聲波破碎后離心收集上清，經(jīng)親和層析后，獲得pet32a－tev－NGAL融合蛋白［6］。將融合蛋白經(jīng)tev酶4℃酶切過夜，離心收集上清，將上清過陽(yáng)離子樹脂，得到NGAL蛋白。

1.2.4 內(nèi)毒素檢測(cè) 參考試劑操作說明書，以注射用生理鹽水配制不同濃度內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品：0.25、0.125、0.062 5、0.031 25EU／mL，各取100μL加入檢測(cè)試劑中，取NGAL蛋白溶液100μL加入檢測(cè)試劑中。每個(gè)濃度重復(fù)3管，以生理鹽水為陰性對(duì)照，于37℃培養(yǎng)箱中保溫60min，以形成凝膠且不滑落為陽(yáng)性，反之為陰性。觀察NGAL的內(nèi)毒素含量。

1.2.5 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn) 將生長(zhǎng)良好的SW480細(xì)胞以6×104個(gè)／孔接種于6孔板中，培養(yǎng)24h后，待密度達(dá)到90%以上時(shí)，用200μL的槍頭在6孔板中劃痕，PBS洗2次，加入50、100、200ng／mL 3個(gè)不同濃度NGAL雙無培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48h。在48h時(shí)，照相觀察劃痕愈合情況。

1.2.6 細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn) 采用24孔板懸掛式Transwell小室，將經(jīng)不同濃度NGAL處理48h后的細(xì)胞，PBS洗2次，用無血清培養(yǎng)液重懸。將200μL細(xì)胞懸液（3×105個(gè)／mL）加入上室，將含20%胎牛血清DMEM培養(yǎng)基540μL加入24孔板下室，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，培養(yǎng)48h，取出小室，經(jīng)4%多聚甲醛固定后，結(jié)晶紫染色，用濕棉簽擦去膜上面未穿過膜的細(xì)胞，自然風(fēng)干后［7］，在顯微鏡下照相，低倍鏡下隨機(jī)選取5個(gè)視野計(jì)數(shù)。最終以穿膜細(xì)胞的數(shù)目代表體外遷移能力。

1.2.7 細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn) 將ECM基質(zhì)膠按1∶5用無血清DMEM稀釋，取50μL均勻涂在Transwell小室底部膜上室面，37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)4h，使基質(zhì)膠自然聚合成凝膠。加入經(jīng)不同濃度NGAL處理48h后的細(xì)胞，PBS洗2次，用無血清培養(yǎng)液重懸。將200μL細(xì)胞懸液（4×105個(gè)／mL）加入上室，將含20%胎牛血清DMEM培養(yǎng)基540μL加入24孔板下室，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，培養(yǎng)48h，取出小室，經(jīng)4%多聚甲醛固定后，結(jié)晶紫染色，用濕棉簽擦去膜上面未穿過膜的細(xì)胞，自然風(fēng)干后，在顯微鏡下照相，低倍鏡下隨機(jī)選取5個(gè)視野計(jì)數(shù)。最終以穿膜細(xì)胞的數(shù)目代表體外侵襲能力。

1.2.8 免疫印跡檢測(cè) 收集經(jīng)不同濃度NGAL處理后的細(xì)胞，按1×106個(gè)／mL細(xì)胞濃度加入100μL細(xì)胞裂解液，震蕩，冰上放置1h，4℃，離心半徑4cm，13 000r／min，離心15min，取上清液加上樣緩沖液，85℃加熱變性10min，樣品中蛋白經(jīng)BCA試劑盒定量，以確保蛋白上樣量一致。通過12%SDS－PAGE電泳分離后，轉(zhuǎn)膜至PVDF膜上。分別加入一抗（一抗稀釋比例均為1∶1 000），4℃孵育過夜。用TBST洗膜后，辣根過氧化物酶標(biāo)記二抗（1∶5 000），37℃孵育1h，TBST洗滌PVDF膜5次，每次10min，加入ECL顯影劑后，通過X光膠片曝光［8］。

1.2.9 ELISA檢測(cè)血清中NGAL的表達(dá)量 參考試劑盒說明書，將正常人血清30例及Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ期結(jié)腸癌患者每期各30例，共150例的血清進(jìn)行檢測(cè)，以空白孔調(diào)零，酶標(biāo)儀檢測(cè)450nm波長(zhǎng)下的吸收值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

ELISA實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)記錄為450nm處的光吸收值，細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)中細(xì)胞劃痕處為劃痕愈合程度，遷移、侵襲實(shí)驗(yàn)中數(shù)據(jù)為穿過基質(zhì)膜的細(xì)胞個(gè)數(shù)。采用SPSS 13.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用成組設(shè)計(jì)t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 NGAL與結(jié)腸癌分期成正相關(guān)

為研究NGAL與結(jié)腸癌惡化的關(guān)系，收集了不同腫瘤分期患者的血樣，通過ELISA實(shí)驗(yàn)對(duì)NGAL表達(dá)量進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果表明，隨著腫瘤的惡化，NGAL表達(dá)量逐漸增加，二者成正相關(guān)。其中，Ⅳ期血樣標(biāo)本中，NGAL含量高達(dá)（160±10）ng／mL，與Tis血液樣本比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）（表1）。

表1 結(jié)腸癌各期NGAL表達(dá)量（n＝30，±s）

表1 結(jié)腸癌各期NGAL表達(dá)量（n＝30，±s）

注：與Tis比較，＊P＜0.05

Tis ⅠⅡⅢ Ⅳ結(jié)腸癌患者血液中 90±20 110±17 125±21 143±14 160±10＊NGAL含量／（ng／mL）

2.2 重組質(zhì)粒構(gòu)建、蛋白質(zhì)純化及內(nèi)毒素檢測(cè)

以pcDNA－NGAL載體為模板，進(jìn)行PCR，1%瓊脂糖凝膠電泳可見570bp左右的DNA片段，與預(yù)期一致。用BamHⅠ和XhoⅠ限制性內(nèi)切酶酶切載體pet32a－tev－NGAL后，1%瓊脂糖凝膠電泳可見570bp左右和6 000bp左右的DNA片段。構(gòu)建的重組質(zhì)粒測(cè)序結(jié)果與NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)登陸序列一致（圖1）。

圖1 瓊脂糖凝膠電泳分析PCR產(chǎn)物

用蛋白純化儀過親和層析柱，高濃度咪唑梯度洗脫，在咪唑濃度為100mmol／L ～200mmol／L時(shí)出峰，12%SDS－PAGE電泳驗(yàn)證，可獲得純度較高的融合蛋白，經(jīng)tev酶酶切后，離子交換樹脂純化，在相對(duì)分子質(zhì)量25×103處有明顯的單一目的條帶與NGAL分子量大小相符。純化后的NGAL蛋白，經(jīng)15%SDS－PAGE分析后，進(jìn)行蛋白印跡鑒定，在相對(duì)分子質(zhì)量約為25×103處可見特異性雜交帶，表明為NGAL蛋白（圖2）。

圖2 純化后NGAL蛋白的檢測(cè)

內(nèi)毒素檢測(cè)：通過鱟試劑對(duì)純化獲得的NGAL蛋白進(jìn)行內(nèi)毒素檢測(cè)，結(jié)果為內(nèi)毒素含量＜0.125 EU／mg。

2.3 NGAL促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞遷移和浸潤(rùn)

為研究NGAL對(duì)結(jié)腸癌轉(zhuǎn)移的調(diào)控作用，使用不同質(zhì)量濃度NGAL處理結(jié)腸癌細(xì)胞SW480 48h。通過細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)、Transwell、基質(zhì)膠實(shí)驗(yàn)對(duì)其遷移和侵襲能力進(jìn)行檢測(cè)。劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，NGAL處理組的細(xì)胞明顯向劃痕處生長(zhǎng)并靠攏，呈濃度依賴性。Transwell、基質(zhì)膠實(shí)驗(yàn)分別檢測(cè)NGAL對(duì)細(xì)胞遷移與浸潤(rùn)能力的影響，通過結(jié)晶紫染色并計(jì)數(shù)，NGAL處理組SW480比對(duì)照組細(xì)胞數(shù)明顯增多，由此可見，NGAL促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞SW480轉(zhuǎn)移（圖3～5）。

圖3 劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)NGAL促進(jìn)SW480轉(zhuǎn)移（×10）

圖4 Transwell檢測(cè)NGAL對(duì)結(jié)腸癌SW480細(xì)胞遷移能力的影響（×10）

圖5 基質(zhì)膠實(shí)驗(yàn)檢測(cè)NGAL對(duì)結(jié)腸癌SW480細(xì)胞浸潤(rùn)能力的影響（×10）

2.4 NGAL激活EMT信號(hào)通路

50、100 、200ng／mL NGAL處理 48h后，SW480細(xì)胞中的E－cadherin明顯減少，并增強(qiáng)了N－cadherin和Vimentin的表達(dá)。同時(shí)，也增強(qiáng)了信號(hào)分子β－catenin的表達(dá)。結(jié)果表明，NGAL促進(jìn)SW480的遷移和浸潤(rùn)能力。在癌癥轉(zhuǎn)移過程中，惡性基因MMP－9、MMP－2的表達(dá)有助于細(xì)胞間基質(zhì)的降解［9］。同時(shí)，VEGF基因與結(jié)腸癌腫瘤血管生成、轉(zhuǎn)移和腫瘤生長(zhǎng)密切相關(guān)。本研究中，經(jīng)過NGAL處理后，細(xì)胞胞內(nèi)MMP－9、MMP－2 和VEGF的表達(dá)明顯增強(qiáng)（圖6）。

圖6 Western blot檢測(cè)EMT相關(guān)標(biāo)志物

3 討論

腫瘤轉(zhuǎn)移是惡性腫瘤的主要特征之一，是導(dǎo)致患者死亡的首要因素，是癌細(xì)胞與宿主細(xì)胞相互作用的連續(xù)復(fù)雜過程［10］。EMT是上皮細(xì)胞通過特定程序轉(zhuǎn)化為具有間質(zhì)表型細(xì)胞的生物學(xué)過程，是上皮細(xì)胞來源的惡性腫瘤細(xì)胞獲得遷移和侵襲能力的重要生物學(xué)過程。N－cadherin、E－cadherin和βcatenin的改變導(dǎo)致了EMT的發(fā)生［11］。通過EMT過程，上皮細(xì)胞失去細(xì)胞極性，失去與基底膜的連接等上皮表型，獲得了較高的遷移與侵襲、抗凋亡和降解細(xì)胞外基質(zhì)的能力等間質(zhì)表型［12］。因而，闡明調(diào)控惡性腫瘤細(xì)胞發(fā)生EMT過程的分子機(jī)制，并探索基于EMT關(guān)鍵分子的診斷方法及靶向EMT關(guān)鍵分子的治療手段是腫瘤轉(zhuǎn)移中EMT機(jī)制研究的關(guān)鍵性問題。

隨著對(duì)NGAL在腫瘤領(lǐng)域的進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，炎癥反應(yīng)和惡性腫瘤可誘使NGAL在多種腫瘤中表達(dá)上調(diào)，并在腫瘤復(fù)發(fā)與轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用，NGAL參與了許多腫瘤的發(fā)生發(fā)展，在不同的腫瘤中，NGAL的功能表現(xiàn)與作用機(jī)制不盡相同，且在腫瘤中的表達(dá)是不均一的，依組織類型不同而表現(xiàn)各異，其分子機(jī)制還有待闡明［13］。本研究利用基因工程的方法，構(gòu)建重組表達(dá)載體pet32a－tev－NGAL，轉(zhuǎn)化入大腸桿菌（BL21－DE3）進(jìn)行表達(dá)，經(jīng)鎳柱親和層析純化，tev酶酶切，再過HIS柱純化，收集穿透峰獲得NGAL蛋白。Western blot結(jié)果表明，NGAL能夠激活腫瘤轉(zhuǎn)移的重要信號(hào)途徑——EMT途徑；ELISA結(jié)果表明，NGAL的表達(dá)量與不同分期腫瘤惡化程度成正相關(guān)。通過對(duì)NGAL激活EMT信號(hào)通路促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞SW480轉(zhuǎn)移的研究，有助于為結(jié)腸癌以及其他腫瘤發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制研究提供幫助，同時(shí)也有助于進(jìn)一步推進(jìn)相關(guān)腫瘤臨床診斷與治療的應(yīng)用基礎(chǔ)研究。

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