葉錦霞 吳廣文 賴舜淼 鄭春松 李西海 劉獻(xiàn)祥 葉蕻芝

【摘 要】目的：觀察透骨消痛膠囊對膝骨關(guān)節(jié)炎大鼠軟骨內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的影響，探討透骨消痛膠囊治療

骨關(guān)節(jié)炎的可能機(jī)制。方法：將30只清潔級SD大鼠隨機(jī)分為正常對照組，模型對照組，透骨消痛膠囊高、中、低劑量組，每組6只。除正常對照組外，其余各組采用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4%的木瓜蛋白酶注射建立大鼠膝骨關(guān)節(jié)炎模型。給藥8周后，收集大鼠右側(cè)股骨髁和脛骨平臺，光鏡檢查軟骨組織的形態(tài)學(xué)變化，利用原位末端標(biāo)記法（TdT-mediated dUTP nick-end labeling，TUNEL）檢測軟骨細(xì)胞凋亡情況，免疫組化檢測軟骨組織內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激蛋白激酶（PKR-like ER kinase，PERK）、真核啟動因子2α（eukaryotic translation initiation factor 2α，eIF2α）、轉(zhuǎn)錄活化因子4（activating transcription factor 4，ATF4）、免疫球蛋白結(jié)合蛋白（immunoglobulin binding protein，Bip）、生長抑制DNA損傷基因153（growth arrest and DNA-damage-inducible gene 153，

GADD153）、軟骨細(xì)胞功能基因Ⅱ型膠原蛋白（CollageⅡ）和轉(zhuǎn)錄因子SOX-9蛋白的表達(dá)。結(jié)果：透骨消痛膠囊對大鼠骨關(guān)節(jié)炎模型關(guān)節(jié)軟骨的大體外觀及HE染色均有明顯改善，TUNEL結(jié)果顯示其能夠降低軟骨細(xì)胞凋亡指數(shù)（P < 0.01），免疫組化結(jié)果顯示透骨消痛膠囊較模型對照組能夠下調(diào)PERK、eIF2α、ATF4、Bip及GADD153蛋白表達(dá)，上調(diào)軟骨細(xì)胞功能基因CollageⅡ和SOX-9的蛋白表達(dá)

（P < 0.05或P < 0.01）。結(jié)論：透骨消痛膠囊可通過抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，減少軟骨細(xì)胞的凋亡數(shù)目，改善軟骨細(xì)胞形態(tài)，促進(jìn)軟骨細(xì)胞代謝及軟骨修復(fù)，以維持軟骨結(jié)構(gòu)的相對完整，從而延緩關(guān)節(jié)軟骨退變。

【關(guān)鍵詞】 骨關(guān)節(jié)炎，膝；透骨消痛膠囊；內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激；信號轉(zhuǎn)導(dǎo)；大鼠

doi：10.3969/j.issn.2095-4174.2015.11.001

Study on the Effect of Tougu Xiaotong Capsule（透骨消痛膠囊）on CartilageEndoplasmic Reticulum

Stress in Rats with Knee Osteoarthritis

YE Jin-xia，WU Guang-wen，LAI Shun-miao，ZHENG Chun-song，LI Xi-hai，LIU Xian-xiang，YE Hong-zhi

【ABSTRACT】 Objective：To observe the effect of Tougu Xiaotong Capsule （透骨消痛膠囊，TXC） on cartilage endoplasmic reticulum stress in rats with knee osteoarthritis in order to study its possible mechanism of treating osteoarthritis.Methods：Thirty clean SD rats were randomly divided into a normal control group，a model control group，and high，medium and low dose groups of TXC （HTXC group，MTXC group and LTXC group），

6 rats in each group.Except for the normal control group，the rest groups were given injections of 4% papain to establish rat models of knee osteoarthritis.After 8 weeks of medication，right lateral thighs and tibial plateaus of rats were collected to detect the morphological changes of cartilage tissue with light microscope.TUNEL （TdT-mediated UTP nick-end labeling） was used to detect chondrocyte apoptosis.Immunohistochemisty was used to detect the expressions of PERK （PKR-like ER kinase），eIF2α （eukaryotic translation initiation factor 2α），ATF4 （activating transcription factor 4），Bip （immunoglobulin binding protein），GADD153 （growth arrest and DNA-damage-inducible gene 153），CollageⅡ and transcription factor SOX-9.Results：TXC could significantly improve the general appearance and HE staining of articular cartilage of rat models.The results of TUNEL showed the decrease of chondrocyte apoptosis index （P < 0.01）.Immunohistochemistry results showed the down-regulation of the expression of PERK，eIF2α，ATF4，Bip and GADD153 and the up-regulation of the expression of CollageⅡ and SOX-9 （P < 0.05 or P < 0.01）.Conclusion：TXC，by way of inhibiting endoplasmic reticulum stress signal transduction，can reduce the number of chondrocyte apoptosis，improve the morphology of chondrocytes，promote the metabolism of chondrocytes and cartilage repair，and maintain relatively intact cartilage structure，to delay the degeneration of articular cartilage.

【Keywords】 osteoarthritis，knee；Tougu Xiaotong Capsule（透骨消痛膠囊）；endoplasmic reticulum stress；

signal transduction；rat

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激（endoplasmic reticulum stress，ERS）

是指由于各種原因使得細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)發(fā)生功能紊亂，導(dǎo)致錯誤折疊和未折疊蛋白在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔內(nèi)聚集以及Ca2+離子平衡紊亂的亞細(xì)胞器病理狀態(tài)[1]。ERS

是機(jī)體對外界或自身反應(yīng)的一種自我保護(hù)機(jī)制，以維持內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的穩(wěn)態(tài)，促進(jìn)細(xì)胞生存，但過強(qiáng)或持續(xù)時間過長的ERS可以誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[2-3]。采用福建中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二人民醫(yī)院院內(nèi)制劑透骨消痛膠囊治療早、中期骨關(guān)節(jié)炎（osteoarthritis，

OA），經(jīng)臨床長期觀察，療效可靠[4-8]。本研究從ERS角度觀察其對膝骨關(guān)節(jié)炎（knee osteoarthritis，

KOA）大鼠軟骨組織的影響，探討其防治OA的作用機(jī)制。

1 實驗材料

1.1 實驗藥物 透骨消痛膠囊由巴戟天、白芍、川芎和腫節(jié)風(fēng)組成，為福建中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二人民醫(yī)院的院內(nèi)制劑（批準(zhǔn)文號：閩制字Z20100006）。

1.2 實驗動物 健康2月齡清潔級SD大鼠30只，雄性，由上海斯萊克實驗動物有限責(zé)任公司提供，動物合格證號：SCXK（滬）2007-0005。福建中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心提供的清潔級醫(yī)學(xué)實驗動物環(huán)境設(shè)施，使用許可證號：SYXK（閩） 2009-0001。實驗中對動物處置符合科技部2006年《關(guān)于善待實驗動物的指導(dǎo)性意見》的規(guī)定。

1.3 主要試劑 木瓜蛋白酶（美國Genview公

司）；TUNEL檢測試劑盒（美國羅氏公司）；PERK，eIF2α，ATF4，Bip，GADD153，CollageⅡ和SOX-9一抗（北京博奧森生物技術(shù)有限公司）；（H+L） Goat anti Rabbit IgG（北京中杉金橋公司）；免疫組化染色MaxVISion試劑盒（福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司）；DAB顯色試劑盒（上海碧云天公司）。

1.4 主要儀器 生物組織石蠟包埋機(jī)（湖北孝感亞光醫(yī)用電子技術(shù)有限公司）；生物組織自動脫水機(jī)（湖北孝感亞光醫(yī)用電子技術(shù)有限公司）；全自動石蠟切片機(jī)（德國Leica公司）；IX70倒置相差顯微鏡（日本Olympus公司）；多功能真彩色細(xì)胞圖象分析管理系統(tǒng)（美國Media Cybernetics公司Image-Pro Plus）。

2 方 法

2.1 實驗分組及動物模型制備 動物適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，抽簽法隨機(jī)分為兩組，即正常對照組（6只）和實驗組（24只）。實驗組大鼠第1，4，7 d，采用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%的戊巴比妥鈉（40 mg·kg-1）麻醉成功后[9-10]，于右膝關(guān)節(jié)處剔毛，分別用碘酒、酒精消毒右后膝關(guān)節(jié)；將關(guān)節(jié)微屈，經(jīng)髕腱內(nèi)側(cè)進(jìn)針，關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4%的木瓜蛋白酶生理鹽水溶液 0.2 mL，隔3 d注射1次，共注射3次，復(fù)制OA模型[11]。正常對照組注射等量生理鹽水。

造模后2周，實驗組采用抽簽法隨機(jī)分為4組，即模型對照組，透骨消痛膠囊高、中、低劑量組，每組6只。

2.2 藥物劑量設(shè)置 根據(jù)人體與動物藥物等效劑量換算[12]方法，透骨消痛膠囊的高劑量為7.2 g·kg-1、

中劑量為3.6 g·kg-1、低劑量為1.8 g·kg-1，分早、晚2次灌胃，正常對照組和模型對照組給予等量生理鹽水灌服，連續(xù)8周。

2.3 動物取材 各組分別于藥物或生理鹽水干預(yù)8周后，用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%的戊巴比妥鈉（40 mg·kg-1）

腹腔注射麻醉；采集大鼠右側(cè)股骨髁和脛骨平臺，切取脛骨平臺，用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的多聚甲醛固定、用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的EDTA脫鈣劑脫鈣4～6周，

石蠟包埋，用蘇木素-伊紅（HE）染色、TUNEL和免疫組化檢測。

2.4 指標(biāo)檢測

2.4.1 大體觀察 實驗動物處死后，各組動物取右側(cè)股骨髁和脛骨平臺，肉眼大體觀察軟骨面情況。

2.4.2 HE染色觀察組織形態(tài) 光鏡下觀察軟骨形態(tài)學(xué)變化。

2.4.3 TUNEL檢測軟骨細(xì)胞調(diào)亡 計算凋亡指數(shù)（apoptosis index，AI），即每張TUNEL切片選取5個陽性細(xì)胞數(shù)最多的高倍鏡視野，每個視野計算100個軟骨細(xì)胞，計算陽性細(xì)胞數(shù)與總細(xì)胞數(shù)的百分比。

2.4.4 免疫組化染色 觀察軟骨組織中ERS相

關(guān)蛋白PERK、eIF2α、ATF4、Bip、GADD153，以及軟骨細(xì)胞功能基因CollageⅡ和SOX-9蛋白的

表達(dá)。

2.4.5 顯微照相和圖像分析 在200倍鏡下每份樣本隨機(jī)選取5個視野，獲取圖像并編號、存盤。采用多功能真彩色細(xì)胞圖像分析管理系統(tǒng)，分析所獲取的圖片并得出陽性細(xì)胞數(shù)百分率（PERK、eIF2α、ATF4、Bip、GADD153共5個指標(biāo)）。陽性細(xì)胞數(shù)分級：0級，0～1%；1級，> 1%～10%；

2級，> 10%～50%；3級，> 50%～80%；4級，>

80%～100%。測出圖像中陽性表達(dá)積分光密度（Integrated option density，IOD）（CollageⅡ及SOX-9兩個指標(biāo)），5個視野的平均值作為該樣品的積分光密度供統(tǒng)計使用。

2.5 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。計量資料以表示，組間比較采用One-Way ANOVA方差分析，多重比較采用SNK-q檢驗；計數(shù)資料采用χ2檢驗。以P < 0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié) 果

3.1 動物模型鑒定結(jié)果

3.1.1 大體形態(tài)觀察 正常對照組大鼠關(guān)節(jié)軟骨呈淡藍(lán)色且色澤清亮，表面光滑無裂痕，無纖維化和骨贅形成，見圖1（1）；模型對照組大鼠關(guān)節(jié)軟骨色澤灰暗蒼白，且關(guān)節(jié)表面可發(fā)現(xiàn)凹陷或缺損，見圖1（2）。

3.1.2 顯微鏡下形態(tài)觀察 軟骨HE染色顯示正常對照組關(guān)節(jié)表面光滑，四層結(jié)構(gòu)清晰，軟骨分布均勻，未見軟骨細(xì)胞簇集和炎性細(xì)胞浸潤，見圖2

（1）；模型對照組關(guān)節(jié)表面纖維性成分多，且凹凸不平，光滑度不如正常軟骨，表層細(xì)胞明顯減少，細(xì)胞“背靠背”現(xiàn)象消失，深層細(xì)胞出現(xiàn)了簇集現(xiàn)象，見圖2（2）。

3.2 一般情況觀察 正常對照組精神狀態(tài)良好，膝關(guān)節(jié)活動自如，毛色無異常變化。造模后，部分動物出現(xiàn)關(guān)節(jié)腫脹，膝關(guān)節(jié)活動明顯受限，自主活動減少。正常對照組關(guān)節(jié)軟骨表面光滑，色澤如常，未見明顯軟骨損傷；模型對照組關(guān)節(jié)軟骨表面粗

糙，色澤較暗，部分軟骨見缺損和裂隙；透骨消痛膠囊組關(guān)節(jié)軟骨損傷程度較模型對照組輕，部分軟骨可見表面稍微粗糙，有凹陷，但未見缺損。

3.3 HE染色結(jié)果 正常對照組關(guān)節(jié)軟骨表面光滑，四層結(jié)構(gòu)清晰可辨，各層次排列規(guī)律，表層細(xì)胞較小呈梭形，排列密集，其長軸平行于軟骨表面。中間層細(xì)胞較大呈圓形或橢圓形，排列無規(guī)律，呈雙細(xì)胞“背靠背”分布。肥大細(xì)胞層細(xì)胞大，由雙細(xì)胞逐漸過渡到多細(xì)胞成團(tuán)分布。軟骨細(xì)胞周圍基質(zhì)染成藍(lán)色，以放射層為中心往上下層染色漸淡；潮線整齊；軟骨下骨致密層厚度適中，骨松質(zhì)層骨小梁寬度和密度適中，骨細(xì)胞呈梭形，分布均勻，骨基質(zhì)均勻紅染[13]。見圖3（1）。

模型對照組關(guān)節(jié)軟骨層表面粗糙，變薄，完整性破壞，表層軟骨纖維化變性；部分區(qū)域軟骨較正常對照組局部增厚，軟骨細(xì)胞明顯增殖，排列紊亂，有簇聚現(xiàn)象，細(xì)胞“背靠背”現(xiàn)象消失，局部軟骨細(xì)胞凋亡，無肥大細(xì)胞存在，基質(zhì)纖維化；潮線不整齊；軟骨下骨部分致密層變薄，軟骨下骨增生，長入軟骨層，髓腔擴(kuò)大、開放。見圖3（2）。

透骨消痛膠囊高、中、低劑量組軟骨組織損傷情況比模型對照組輕，軟骨表面裂隙較少，部分區(qū)域仍有軟骨細(xì)胞排列不規(guī)則現(xiàn)象，但明顯優(yōu)于模型對照組，表層細(xì)胞形態(tài)接近正常，深層結(jié)構(gòu)變化不明顯，四層結(jié)構(gòu)欠清晰，個別區(qū)域有簇集現(xiàn)象，潮線較整齊。見圖3（3）、3（4）、3（5）。

3.4 TUNEL凋亡結(jié)果 應(yīng)用Tunel法對軟骨細(xì)胞凋亡情況進(jìn)行組織原位末端標(biāo)記檢測，發(fā)現(xiàn)正常對照組軟骨細(xì)胞也存在凋亡現(xiàn)象，有個別細(xì)胞呈棕黃色染色，見圖4（1）；模型對照組棕褐色染色細(xì)胞明顯增多，見圖4（2）；凋亡率明顯增高，透骨消痛膠囊給藥后，高、中、低劑量組細(xì)胞棕黃色染色細(xì)胞比模型對照組少，見圖4（3）、4（4）、4（5），凋亡指數(shù)較模型對照組顯著降低（P < 0.01），且有劑量依賴性。見表1。

3.5 免疫組化染色結(jié)果 光鏡顯微鏡下，細(xì)胞核或細(xì)胞漿出現(xiàn)棕黃色或棕褐色染色的部分為陽性，藍(lán)染為蘇木素復(fù)染的陰性。CollageⅡ和SOX-9中細(xì)胞及基質(zhì)棕黃色或棕褐色為陽性，藍(lán)染為陰性。與正常對照組比較，模型對照組和透骨消痛膠囊高、中、低劑量組PERK、eIF2α、ATF4、Bip和GADD153蛋白陽性率均有明顯提高，軟骨細(xì)胞功能基因CollageⅡ和SOX-9 蛋白表達(dá)量均降低。透骨消痛膠囊給予7.2 g·kg-1、3.6 g·kg-1、1.8 g·kg-1劑量后，PERK、eIF2α、ATF4、Bip和GADD153蛋白陽性率較模型對照組顯著降低（P < 0.01），CollageⅡ和SOX-9 蛋白表達(dá)量較模型對照組不同程度提高（P < 0.05或P < 0.01）。透骨消痛膠囊能改善質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4%的木瓜蛋白酶所致大鼠軟骨組織相關(guān)蛋白的異常變化，能改善木瓜蛋白酶造成的軟骨組織損傷。見表2、表3，圖5-11。

4 討 論

木瓜蛋白酶關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射誘發(fā)OA是一種常用的KOA造模方法，其誘發(fā)OA病變模型的病理變化與臨床OA極為相似，造模過程簡單，成功率高，發(fā)生時間短，適合快速大批量建立OA模型進(jìn)行軟骨病理、藥物防治的研究。OA中關(guān)節(jié)軟骨的形態(tài)變化，關(guān)節(jié)軟骨退行性改變及破壞是其基本病變，其病理改變的程度直接反映軟骨的退變情況。觀察OA病理進(jìn)程及藥物療效最直觀的辦法即觀察OA軟骨組織形態(tài)學(xué)的改變。故本實驗采用木瓜蛋白酶關(guān)節(jié)腔注射建立大鼠OA模型，在造模8周后，大體觀察即發(fā)現(xiàn)模型對照組關(guān)節(jié)軟骨表面粗糙，色澤較暗，部分軟骨見缺損；軟骨組織切片HE染色中發(fā)現(xiàn)，軟骨細(xì)胞呈簇集樣改變或者數(shù)量明顯減少，軟骨結(jié)構(gòu)層次紊亂不清楚，失去正常結(jié)構(gòu)，從而證明本實驗成功復(fù)制出大鼠KOA模型，模擬了KOA的病理改變過程。

本研究結(jié)果顯示，給予透骨消痛膠囊8周時，通過肉眼觀察，與模型對照組相比，軟骨顏色變淺，軟骨缺損等現(xiàn)象均有不同程度好轉(zhuǎn)。通過光鏡觀察可見透骨消痛膠囊高、中、低劑量組軟骨組織損傷情況比模型對照組輕，軟骨表面裂隙較少，部分區(qū)域仍有軟骨細(xì)胞排列不規(guī)則現(xiàn)象，但明顯優(yōu)于模型對照組，表層細(xì)胞形態(tài)接近正常，深層結(jié)構(gòu)變化不明顯，四層結(jié)構(gòu)欠清晰，個別區(qū)域有簇集現(xiàn)象。TUNEL法檢測顯示透骨消痛膠囊各給藥組棕黃色染色細(xì)胞數(shù)量明顯比模型對照組少，說明透骨消痛膠囊在一定程度上能減輕膝關(guān)節(jié)組織粘連，消除局部無菌性炎癥，改善微循環(huán)，減少關(guān)節(jié)內(nèi)壓力；減輕軟骨組織形態(tài)結(jié)構(gòu)的損傷程度，延緩軟骨退變，減緩OA的病變進(jìn)程。

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是重要的細(xì)胞器之一，其功能主要是膜蛋白和分泌性蛋白的折疊、蛋白質(zhì)糖基化修飾、蛋白質(zhì)的分泌等。各種理化因素，如紫外線、缺氧、營養(yǎng)物質(zhì)缺乏、病毒、氧化應(yīng)激等均可使內(nèi)質(zhì)網(wǎng)發(fā)生應(yīng)激反應(yīng)。近年對ERS的研究發(fā)現(xiàn)，過度的ERS反應(yīng)可以導(dǎo)致軟骨細(xì)胞的凋亡，這是獨(dú)立于Fas途徑和NO途徑的細(xì)胞凋亡途徑。在應(yīng)激條件下，細(xì)胞可以整合應(yīng)激反應(yīng)，調(diào)動應(yīng)激反應(yīng)蛋白減輕應(yīng)激因素對細(xì)胞的損傷，使內(nèi)質(zhì)網(wǎng)適應(yīng)新的內(nèi)環(huán)境要求；同時細(xì)胞表達(dá)的ERS蛋白如GADD153、Caspase-12等，也可以啟動細(xì)胞凋亡來處理不能修復(fù)的損傷細(xì)胞。ERS有3條信號通路：ATF-6（activating transcription factor 6）、Ire1（inositol-requiring 1）和PERK。3條通路可以通過TRAF-2（TNF receptor-associated factor 2）和GADD153啟動細(xì)胞凋亡基因，使軟骨細(xì)胞凋亡。其中PERK信號分子的激活可以磷酸化，后者可以激活A(yù)TF-4，上調(diào)GADD153的表達(dá)和下調(diào)細(xì)胞內(nèi)整體蛋白質(zhì)的合成水平，包括細(xì)胞生存必須的蛋白質(zhì)。研究表明，在OA患者的軟骨細(xì)胞中存在ERS，并且隨著病情的發(fā)展，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)過載，會通過GADDA153和CHOP的高表達(dá)誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞的

凋亡。

本實驗結(jié)果證實，透骨消痛膠囊對大鼠KOA有治療作用，能減輕過度的ERS反應(yīng)，保護(hù)關(guān)節(jié)軟骨，減輕軟骨損傷。

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收稿日期：2015-07-16；修回日期：2015-08-31