王倩++張玉芳++楊斌

摘要：腎臟缺血再灌注損傷為急性腎損傷最常見的病因之一，亦為腎移植手術(shù)中難以規(guī)避的損傷，其不僅延遲移植腎功能的恢復(fù)，而且會導(dǎo)致急、慢性免疫排斥反應(yīng)和腎功能異常。環(huán)孢素A仍是腎移植術(shù)后預(yù)防免疫排斥反應(yīng)的主要藥物，長期使用會造成腎損害。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)作為真核細(xì)胞生物中保持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的重要細(xì)胞器，其穩(wěn)態(tài)系統(tǒng)易受到許多因素如缺氧、氧化應(yīng)激和藥物刺激的影響而失衡，形成內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激。本文擬對內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激在腎臟缺血再灌注和環(huán)孢霉素A損傷中的作用及研究進(jìn)展做一綜述。

關(guān)鍵詞：內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激；腎缺血再灌注；環(huán)孢素A；自噬；凋亡

1緒論

在真核細(xì)胞中，未折疊蛋白以及錯(cuò)誤折疊蛋白的積聚引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（endoplasmic reticulum，ER）一系列功能的紊亂，稱為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激（ER stress，ERS）[1]。ERS與多種疾病相關(guān)，如糖尿病、動脈粥樣硬化及缺血再灌注損傷（ischemia reperfusion injury，IRI）等。由ERS誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡已被研究證實(shí)是IRI的重要發(fā)病機(jī)制[2]。腎臟IRI作為急性腎損傷的常見原因之一，可導(dǎo)致移植腎功能排異、炎癥，最終引起慢性腎功能不全[3]。各種腎臟疾病可誘發(fā)ERS，包括腎小球腎炎、糖尿病腎病、IRI及環(huán)孢素A（Cyclosporine A，CsA）治療引發(fā)的腎損傷。CsA作為鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶抑制劑之一，臨床廣泛應(yīng)用于腎移植術(shù)后提高腎移植患者的存活率。然而CsA對腎臟、肝臟、以及神經(jīng)系統(tǒng)均有潛在毒性，長期大劑量使用會加重腎損傷。因此，為尋找更安全有效的腎病治療手段，越來越多的學(xué)者開始關(guān)注該類腎臟損傷機(jī)制的研究。已有研究發(fā)現(xiàn)多種細(xì)胞器的應(yīng)激包括ERS、線粒體應(yīng)激等與腎臟IR和CsA腎損傷密切相關(guān)，因此，深入研究細(xì)胞器的應(yīng)激反應(yīng)將有助于更詳細(xì)地了解腎臟損傷的機(jī)制，為治療疾病提供新的靶點(diǎn)和策略。

2 ERS

缺血缺氧、氧化應(yīng)激、鈣超載等因素均為ERS發(fā)生的重要環(huán)境刺激。機(jī)體針對這一應(yīng)激反應(yīng)所做出的適應(yīng)性應(yīng)答為未折疊蛋白反應(yīng)（unfolded protein response，UPR），減輕蛋白錯(cuò)誤折疊所帶來的不良影響[1]。 細(xì)胞通過減少蛋白質(zhì)合成，增加幫助蛋白質(zhì)折疊的分子伴侶等方式緩解內(nèi)質(zhì)網(wǎng)壓力，因而適度ERS是維持內(nèi)質(zhì)網(wǎng)穩(wěn)態(tài)的一種保護(hù)機(jī)制[4]。當(dāng)ERS強(qiáng)度過大，超過細(xì)胞自身的調(diào)節(jié)能力，進(jìn)而激活凋亡信號快速去除受損細(xì)胞器，引起細(xì)胞凋亡[5]。

2.1 ERS的生存途徑 RNA依賴的蛋白激酶樣激酶（PKR like ER kinase， PERK）、肌醇需要性激酶（inositol requiring enzyme l，IRE1）和活化轉(zhuǎn)錄因子6（activating transcription factor 6， ATF6）這3種跨膜蛋白是ER腔內(nèi)蛋白聚集的感受器。生理情況下跨膜蛋白分別與糖調(diào)節(jié)蛋白（glucose regulated protein78，GRP78）等伴侶分子結(jié)合而處于無活性狀態(tài)，當(dāng)ER腔內(nèi)出現(xiàn)大量未折疊或錯(cuò)誤折疊蛋白時(shí)，伴侶分子與跨膜蛋白解離，活化的PERK、IRE1及ATF6進(jìn)一步觸發(fā)UPR。PERK與GRP78解離后，活化的PERK使其mRNA的翻譯受到抑制，并磷酸化下游真核起始轉(zhuǎn)錄因子2α（Eukaryotic translation initiation factor 2α，eIF2α）進(jìn)而失活，從而衰減蛋白質(zhì)的翻譯過程[6]。IRE1解離后活能從X盒結(jié)合蛋白1（XBP-1）mRNA中特異性剪切核苷酸，編碼轉(zhuǎn)錄因子XBP-1，進(jìn)而與特異性UPR元件結(jié)合，誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的轉(zhuǎn)錄程序。ATF6在從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)轉(zhuǎn)移至高爾基體的過程中被跨膜蛋白酶所裂解，釋放出活性ATF6并結(jié)合于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激元件，激活ER分子伴侶基因的轉(zhuǎn)錄，見圖1。

圖1 ERS生存途徑

2.2 ERS的自噬途徑 自噬是由應(yīng)激刺激（營養(yǎng)缺乏、ERS、氧化應(yīng)激以及病毒感染等）而產(chǎn)生，通過溶酶體降解細(xì)胞自身的組成，在細(xì)胞生長發(fā)育、內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮調(diào)節(jié)作用并維持合成與降解之間的平衡。在腎臟中自噬能降解錯(cuò)誤蛋白的折疊，有利于急性腎損傷的恢復(fù)[7]。 Chandrika在體外培養(yǎng)的腎小管上皮細(xì)胞模型中發(fā)現(xiàn)，ERS誘導(dǎo)的自噬對細(xì)胞具有促存活作用。與野生型細(xì)胞相比，自噬缺陷的細(xì)胞在受到ERS刺激時(shí)會增強(qiáng)caspase-3的活化和細(xì)胞死亡，進(jìn)一步支持了ERS誘導(dǎo)的自噬對細(xì)胞具有保護(hù)作用。同樣在小鼠IR模型中， ERS誘導(dǎo)的自噬能明顯改善腎臟IRI以及腎功能。在應(yīng)激條件下，自噬通常被認(rèn)為是促進(jìn)細(xì)胞存活的適應(yīng)性存在。然而過度ERS誘發(fā)的自噬反應(yīng)可以導(dǎo)致細(xì)胞死亡[8]，進(jìn)而加重腎臟IRI。

2.3 ERS的凋亡途徑 作為ERS的重要信號分子，跨膜蛋白并沒有直接參與，而是通過激活相應(yīng)的下游的信號分子來完成凋亡程序。PERK激活下游的eIF2α和活化轉(zhuǎn)錄因子4（Activating transcription factor 4，ATF4），進(jìn)而啟動了C/EBP 同源蛋白（CHOP）的表達(dá)與轉(zhuǎn)錄，使得CHOP的表達(dá)量較生理情況下明顯上調(diào)[9]。CHOP作為ERS凋亡的轉(zhuǎn)錄因子，在ERS反應(yīng)中誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。被激活的IRE1招募接頭分子，形成復(fù)合物后繼續(xù)激活JNK。CHOP蛋白和JNK激酶均能下調(diào)Bcl-2的表達(dá)，誘導(dǎo)Bcl-2等發(fā)生構(gòu)象變化，胞質(zhì)內(nèi)Ca2+濃度升高誘發(fā)凋亡。Caspase的特異性級聯(lián)反應(yīng)也是ER凋亡的重要途徑之一，該通路中的凋亡信號是由位于ER外膜的caspase-12下傳。在發(fā)生ERS時(shí)，鈣依賴性蛋白酶將酶原形式的前體caspase-12直接剪切和激活，進(jìn)而激活caspase-9，最終激活凋亡執(zhí)行子caspase-3，見圖2。

圖2 ERS凋亡途徑

3 ERS與腎臟IRI的相互作用

IR是組織器官在缺血所致?lián)p傷的基礎(chǔ)上恢復(fù)血流灌注后組織損傷進(jìn)一步加重，甚至發(fā)生不可逆性損傷的現(xiàn)象。IRI是導(dǎo)致急/慢性腎功能衰竭的一個(gè)重要原因，隨著腎臟移植普遍應(yīng)用于臨床，IR作為移植中不可避免的過程，引起移植組織內(nèi)的炎癥反應(yīng)引起以壞死性凋亡為主的細(xì)胞死亡。

3.1腎缺血再灌注誘導(dǎo)ERS反應(yīng) Intermedin（IMD）作為降鈣素基因相關(guān)肽家族成員能下調(diào)GRP78、CHOP等ERSR中的重要調(diào)節(jié)分子，抑制ERSR改善腎臟IR損傷[10]。Lempiainen等研究發(fā)現(xiàn)，小鼠腎臟IRI模型可誘導(dǎo)ERS的發(fā)生，CHOP的表達(dá)增加[11]。CHOP敲除鼠的腎小管凋亡細(xì)胞數(shù)明顯少于野生型小鼠，CHOP敲除鼠的腎臟形態(tài)和功能損傷程度明顯輕于野生型小鼠。CHOP敲除鼠在前體Caspase 3裂解和Bax蛋白生成水平上均低于野生型小鼠。相反，Bcl-2的表達(dá)水平在CHOP敲除鼠均高于野生型小鼠[12]。這些結(jié)果表明，IR誘發(fā)ERS并激活CHOP相關(guān)細(xì)胞凋亡信號通路，如激活caspase-12、9、3的特異性級聯(lián)反應(yīng)[13]。

氧調(diào)節(jié)蛋白150（oxygen-regulated protein，ORPl50）作為可誘導(dǎo)ER分子伴侶的一種細(xì)胞保護(hù)劑，在急性腎衰病人的腎組織顯著增高。ORP150 過表達(dá)轉(zhuǎn)基因小鼠能夠緩解腎IR導(dǎo)致的損傷，而ORP150表達(dá)下降的小鼠IRI更加嚴(yán)重[14]，由此顯示ERS在腎臟IRI中起著關(guān)鍵的作用。

3.2過度ERS加重缺血再灌注損傷 Montie等發(fā)現(xiàn)細(xì)胞在應(yīng)激情況下會通過eIF2α來抑制細(xì)胞的翻譯過程。腎臟IR后在皮質(zhì)以及髓質(zhì)，特別是皮髓質(zhì)交界區(qū)的小管上皮細(xì)胞中eIF2α的表達(dá)明顯增加。eIF2α激活PERK產(chǎn)生UPR從而發(fā)生ERSR。UPR在IR的病理過程中具有重要作用，被激活而產(chǎn)生的UPR在一定程度上減輕了細(xì)胞損傷，然而隨著IR的時(shí)間變長，ER中錯(cuò)誤蛋白折疊率也相應(yīng)上升。過度ERSR導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)錯(cuò)誤蛋白的累積和細(xì)胞凋亡，在IR基礎(chǔ)上加重了組織損傷。IRI激活UPR，因此，在持續(xù)UPR的刺激下超過了細(xì)胞自身防御能力，啟動細(xì)胞凋亡信號通路，使得腎IRI反而會加重[15]。

4 ERS與CsA腎損傷

CsA通過阻斷T細(xì)胞活化成功發(fā)揮了抑制異體移植物免疫反應(yīng)的作用，被廣泛用于移植術(shù)后防止器官排斥反應(yīng)的自體免疫治療疾病。由于CsA會誘導(dǎo)腎小管細(xì)胞的凋亡，長期使用會導(dǎo)致一系列的副作用，在許多臨床案例都有體現(xiàn)[16]。

4.1 CsA誘導(dǎo)ERS的產(chǎn)生 近來Ciechomska等[17]在環(huán)孢素誘導(dǎo)的人膠質(zhì)瘤細(xì)胞中檢測到p-PERK和IRE1α的表達(dá)證明了UPR的存在，同時(shí)也發(fā)現(xiàn)CHOP和ER分子伴侶BIP表達(dá)上調(diào)，從而推測CsA可以誘導(dǎo)ERS的產(chǎn)生。Liu等人[18]在慢性CsA腎病的大鼠模型中研究發(fā)現(xiàn)：由ERS引起的腎小管上皮細(xì)胞凋亡是CsA腎病的發(fā)病機(jī)制之一。Yong-Min Choi[19]等人在CsA誘導(dǎo)的HK-2（human embryonic kidney cell）細(xì)胞模型發(fā)現(xiàn)，CHOP mRNA的表達(dá)隨時(shí)間推移而明顯增加，證實(shí)了CsA的腎毒性作用誘發(fā)了ERSR。CsA長期治療后CHOP的表達(dá)進(jìn)一步升高，說明長期CsA治療誘發(fā)ERS最終導(dǎo)致腎小管細(xì)胞凋亡。

4.2適度ERS抵抗CsA損傷 CsA長期低劑量使用誘導(dǎo)了機(jī)體產(chǎn)生UPR來作為一種防御機(jī)制，恢復(fù)ER中蛋白正確折疊，降低CsA誘發(fā)ERS的損傷[20]。以往的研究發(fā)現(xiàn)CsA誘導(dǎo)細(xì)胞自噬，在CsA的慢性治療中會增加自噬體積累和減少自噬體清除。近期有研究發(fā)現(xiàn)在環(huán)孢素腎病中可通過誘導(dǎo)ERS發(fā)生自噬起到細(xì)胞的保護(hù)作用從而來減輕CsA的不良反應(yīng)，其機(jī)制在于自噬能抑制ERS引起的細(xì)胞凋亡[21]。自噬作用也被認(rèn)為是除凋亡與壞死外細(xì)胞死亡的第三種形式，而自噬作用與ERS的聯(lián)系在腎臟疾病中的作用還有待進(jìn)一步探討。

5 ERS的檢測、抑制及干擾

新的證據(jù)表明，ERS和擾亂ER蛋白平衡都將增加腎小球以及腎小管疾病的發(fā)生率[22]。若能早期檢測到ERS的存在并對其進(jìn)行干擾均會減少腎臟相關(guān)疾病的發(fā)病率。Yeawon Kim證明中腦星形膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（MANF）可以作為ERS的潛在尿生物標(biāo)志物。早期發(fā)現(xiàn)和干預(yù)ERS進(jìn)程和恢復(fù)ER平衡有利于ERS相關(guān)疾病治療，其可行性高于逆轉(zhuǎn)腎細(xì)胞損傷的治療。這一發(fā)現(xiàn)將能通過尿中MANF尋找到具有較高的疾病進(jìn)展風(fēng)險(xiǎn)的患者，有助于將腎臟相關(guān)疾病進(jìn)行風(fēng)險(xiǎn)分層，預(yù)測疾病的進(jìn)展，監(jiān)測治療反應(yīng)。

近來RNA干擾（RNA interference ， RNAi）作為一種有效工具，能夠以序列同源互補(bǔ)的mRNA為靶點(diǎn)，通過促使特定基因的mRNA降解，高效、特異地沉默體內(nèi)特定基因的表達(dá)，誘發(fā)細(xì)胞呈現(xiàn)出特定基因缺失的表型[23]。ERS中跨膜蛋白、分子伴侶、凋亡轉(zhuǎn)錄因子等在ERS中起著極為關(guān)鍵的作用，若能將其與特定序列結(jié)合形成RNA沉默復(fù)合物，抑制其在ERS中表達(dá)，即可以達(dá)到緩解IR和CsA損傷的效果。

6結(jié)論

綜上所述，任何細(xì)胞內(nèi)外環(huán)境的改變?nèi)鏘R及CsA所致的腎損傷可誘導(dǎo)ERS的發(fā)生，越來越多的證據(jù)表明ERS在疾病的發(fā)生發(fā)展中起著非常重要的作用，包括腎小球和腎小管疾病。因此，隨著ERS機(jī)制研究的深入，可為研究腎臟缺血再灌注和環(huán)孢素腎損傷的發(fā)病機(jī)制和預(yù)防策略提供新的思路。

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編輯/孫杰