周凱等

【摘 要】 膝骨關節(jié)炎為臨床常見疾病，目前對其病理生理變化、發(fā)病機制的認識仍然不甚明了，而動物膝骨關節(jié)炎模型是膝骨關節(jié)炎防治研究的重要手段。目前，醫(yī)學界對動物膝骨關節(jié)炎模型建立的具體方法討論較多，但對采用何種動物模型評價標準仍然缺乏統(tǒng)一的觀點，常采用的實驗動物為鼠和兔。文章就鼠類膝骨關節(jié)炎模型評價方法作一總結。

【關鍵詞】 骨關節(jié)炎，膝；鼠類；模型；評價方法

doi：10.3969/j.issn.2095-4174.2015.07.018

膝骨關節(jié)炎（knee osteoarthritis，KOA）是臨床常見的退行性關節(jié)疾病，隨著我國人口老齡化加劇，KOA發(fā)病率也隨之增高。目前，醫(yī)學界對KOA的認識尚未明了，直接在人類身體基礎上探究其病理生理變化、發(fā)病及防治機制具有極大的局限性，且與人類倫理沖突。因此，對KOA防治機制的探索在極大程度上依賴動物模型。在實驗動物的選擇上，由于鼠類關節(jié)組織結構與人類相近，且在罹患KOA時實驗室指標及形態(tài)學方面與人類患者類似，符合相關性、適當性、實用性原則，因而臨床上選用鼠類建立KOA模型較多[1-2]。鼠類KOA模型根據(jù)建模方法的不同可分為自發(fā)性模型及誘發(fā)性模型兩大類，前者是指實驗鼠不接受任何有意識的人為干預，在自然情況下所發(fā)生的KOA，抑或是由于基因變異并通過遺傳育種技術，傳代保留下來的骨關節(jié)炎（osteoarthritis，OA）動物模型：STRPort小鼠和Hartley 豚鼠等；而誘發(fā)性模型是指通過各種人為操作誘導產(chǎn)生的OA動物模型，包括Hulth法和半月板不穩(wěn)定術等。目前國內外研究中對動物KOA模型建立方法的探討較多[3]，具體建模方法已經(jīng)頗為成熟。然而，在相關論述中，討論評價動物模型建立成功與否的方法卻顯得相對較少。能否恰當?shù)剡x擇評價標準，往往可能左右整個實驗研究結果。本文對鼠類KOA模型評價方法作一綜述，以期為同道選擇運用評價方法時提供參考。

1 活體觀察指標評價

有研究者認為，建模后可通過直接觀察活體實驗鼠類膝關節(jié)局部狀況、步態(tài)改變及關節(jié)活動的變化[4]或直接以游標卡尺測量關節(jié)腫脹程度[5]，并與建模前的數(shù)據(jù)進行對比，來判斷造模是否成功。如需對上述觀察指標進行量化，則可在記錄上述觀察指標后，運用Lequesne MG[6]進行評分。在行為學指標上可觀察實驗鼠類在建模前后，活動時步態(tài)及休息時體位有無變化，活動有無增減，活動靈活性是否降低以及進食的時間，進食總量是否受到影響，以判斷實驗鼠類模型是否成功[7]。也有學者把鼠類膝關節(jié)外觀分級，協(xié)助判斷KOA模型的程度，如平均關節(jié)炎指數(shù)（MAI）采用關節(jié)炎評分（0～4分共5級）：0分，無關節(jié)炎；1分，關節(jié)有紅色斑點或輕度腫脹；2分，關節(jié)中度紅腫；3分，關節(jié)重度紅腫；4分，關節(jié)嚴重紅腫且不能負重。每只實驗鼠類的關節(jié)炎評價分數(shù)為四肢關節(jié)評價分數(shù)之和[8]。通過活體觀察、行為學及外觀的觀察可在不對實驗鼠類造成損傷的情況下，對KOA模型成功與否進行初步判斷，更符合客觀實際，可充分還原人類患病后診療過程。但此類指標相對缺乏具體、客觀的標準，在KOA定性上尚可，但在KOA病理分期上相對較差，且由于鼠類個體較小，干擾因素較多，導致上述觀察指標在鼠類模型上的采集有一定的難度。

2 病理學觀察指標評價

2.1 大體觀察 大體觀察指標可在處死實驗鼠類后行病理取材，將所取標本置于顯微鏡下進行觀察。主要觀察目標包括：鼠類膝關節(jié)表面光滑度、透明度及色澤，關節(jié)表面有無新生物，關節(jié)軟骨表面是否有裂隙、軟化或潰瘍等，還應觀察軟骨的缺損程度，軟骨下骨是否存在裸露情況[9]。具體評分標準如下（0～4分共5級）：0分，關節(jié)面光整，色澤如常；1分，關節(jié)面粗糙，有小的裂隙且色澤灰暗；2分，關節(jié)面糜爛，軟骨缺損深達軟骨淺中層；3分，關節(jié)面潰瘍形成，缺損深達軟骨深層；4分，軟骨剝脫，軟骨下骨質暴露[10]。還可在顯微鏡下觀察膝關節(jié)的滑膜增生情況，軟骨磨損程度及周圍骨贅形成數(shù)目等內容[11-12]，上述觀測指標對KOA鼠類模型具有確切的指示作用，能具體觀察到實驗鼠類KOA病變程度，且操作簡單，對實驗室資源消耗較小。但此類評價方法均為離體觀察法，必須處死實驗動物，有一定的局限性。

2.2 組織和細胞學觀察 組織和細胞學觀察法是在處死實驗鼠類后，切取部分膝關節(jié)軟骨，將標本制成切片后置于光鏡下觀察軟骨組織的層次、軟骨細胞及軟骨基質、潮線等的變化，并進行Mankin's評分[13]或改良Mankin's評分[14]以量化相關指標。Mankin's評分從整體結構、細胞結構、番紅染色、潮線完整性4個方面分不同等級進行評分，最高14分，最低0分。0～1分為正常軟骨；2～6分為早期OA；7～10分為中期OA；11～14分為晚期OA。但Mankin's評分建立于晚期OA病理模型且缺乏分期系統(tǒng)，對早期或輕微的OA不甚適用。

針對Mankin's評分系統(tǒng)的缺陷，國際OA研究學會建立的OOCHAS法對軟骨組織病理學進行分級評分[15-16]。OOCHAS法將KOA分為以下7級：0級，軟骨表面平整，軟骨完整；1級，軟骨表面淺層纖維形成，且不均勻；2級，軟骨表面不連續(xù)，伴有細胞增殖，在Ⅱ～Ⅲ層異染物質增加或減少；3級，軟骨皸裂擴散至Ⅲ層或出現(xiàn)侵蝕；4級，軟骨侵蝕加重，關節(jié)軟骨出現(xiàn)損害；5級，關節(jié)軟骨剝脫；6級，關節(jié)變形。

Chambers評分[17]，切取關節(jié)取內、外側股骨髁與內、外側脛骨平臺4個部分各12張切片，經(jīng)番紅O-固綠染色后，將標本置于光鏡下對其進行觀察。Chambers評分標準細則為：0分，正常軟骨；0.5分，軟骨正常，但軟骨染色減弱；1分，關節(jié)表面平整，有少量纖維覆蓋；2分，關節(jié)軟骨淺層纖維組織覆蓋，并且可見薄層軟骨剝脫；3分，軟骨層輕度磨損（< 20%全層軟骨）；5分，軟骨層中度磨損（20%～80%全層軟骨）；6分，軟骨層嚴重磨損（> 80%全層軟骨）。

上述觀察方法可對實驗動物KOA進行量化，利于實驗后期的數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析，有很強的可操作性，但是此類方法觀察指標過于細化，在組內以及組間差異經(jīng)過重復觀測后，可能導致差異相對較大，使實驗結果產(chǎn)生偏倚。

2.3 免疫組織化學、Western blot及PCR觀察 采用免疫組織化學、Western blot及PCR觀測軟骨中的目標基因如MMP、ZIP及Caspase等在退行性變軟骨中的表達情況。觀測結果判定可通過計算每個觀察視野內陽性細胞數(shù)和細胞總數(shù)，目標基因的表達量用陽性細胞數(shù)占細胞總數(shù)的百分比進行量化[18]，具體標準為：0分，陰性；1分，陽性細胞數(shù)≤10%；2分，10%<陽性細胞數(shù)≤50%；

3分，50%<陽性細胞數(shù)≤75%；4分，陽性細胞數(shù)>75%。陽性細胞數(shù)評分乘染色強度評分即為乘積分數(shù)，將乘積分數(shù)≤4分定為陰性，> 4分定為陽性[19]?；蛘甙辞衅娜旧珡姸仍u分：不著色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為

3分[19]。此類觀察方法針對性極強，在KOA相關機制研究中具有不可替代的作用，有望在KOA的發(fā)生、發(fā)展與治療的研究中帶來巨大契機；但其不是操作技術相對復雜且成本較高，對實驗室的要求也相對較高。

2.4 超微結構觀察 超微結構觀察是指在電鏡觀察亞細胞結構、大分子水平的變化，用以了解組織和細胞最細微的病變。Lippiello等[20]報道，通過在實驗動物食物中添加Omega-3脂肪酸，用以代替必需脂肪酸Omega-6會導致其軟骨纖維變性，軟骨超微結構退化。此方法可深入認識KOA的基本病變、病因和發(fā)病機制，但是目前在KOA動物模型研究中運用較少，經(jīng)驗相對缺乏。

2.5 細胞化學觀察 將實驗鼠類脛骨平臺內側軟骨組織制備成適宜厚度冰凍切片后，經(jīng)過一系列處理與干預，通過熒光顯微鏡觀察細胞內鋅離子、錳離子等的成像[21]。此類觀察方法針對性極強，可運用于KOA相關機制研究中，但其缺點與免疫組織化學、Western blot及PCR觀察相似。

3 影像學觀察評價

核磁共振成像（magnetic resonance imaging，

MRI）檢查，將實驗鼠類麻醉后固定雙膝，在核磁共振儀上進行雙膝掃描檢查，在鼠類股骨髁負重處軟骨的3個不同地方進行測量，取其平均值[22-24]。

此方法可以在不對動物帶來損傷的情況下，對KOA動物模型進行早期、精確的判斷，尤其在關節(jié)軟骨病變上具有特殊優(yōu)勢，此外，本檢測方法還可對軟骨下骨、骨髓、半月板、滑膜炎及關節(jié)滲出及肌腱功能不全等進行觀察[25]。

X線檢查，通過對實驗鼠類雙膝關節(jié)行X線檢查膝關節(jié)內外側間隙是否均勻一致，股骨髁、脛骨平臺關節(jié)面輪廓清晰、光整，骨密度均勻

與否[26-27]，X線片是早期研究者證實關節(jié)炎表現(xiàn)最直接、最有效的工具[25]。

光學相干斷層掃描（optical coherence tomography，OCT）具有較高的空間分辨率，可以實現(xiàn)對鼠類軟骨形態(tài)的掃描[28]，但是此技術僅能提供二維圖像，不利于對軟骨形態(tài)進行整體評價。此技術改進為利用Micro-CT關節(jié)造影術（活體膝關節(jié)腔注射離子造影劑）掃描重建髕骨軟骨，以觀察離體鼠類髕骨軟骨成分和形態(tài)學變化[29-30]；但是仍然存在圖像為2D的問題。

由于OCT的不足，有學者主張采用增強納米聚焦X 射線計算機斷層成像（contrast enhanced nanofocus X ray computed tomography，CE nano CT），認為該法可對鼠類關節(jié)軟骨和骨組織結構和生物化學等3D進行可視化同步成像和評價[31]。

4 實驗室觀察指標評價

大鼠血清iNOS、SOD濃度[32-33]，PⅡCP[34]及關節(jié)滑液內白細胞介素-1、白細胞介素-6、腫瘤壞死因子-α、基質金屬蛋白酶-3和血清中丙二醛、一氧化氮含量[35]。此類檢測指標較多，因具體實驗與理論依據(jù)不同而不同，目前實驗研究中運用較多，檢查方法成熟，成本較低，但鼠類關節(jié)滑液標本選取相對困難。

5 討 論

目前，醫(yī)學界通過KOA動物模型對KOA的病因病機、防治方法做了大量的研究工作，也取得了階段性的成果。對其發(fā)病機制認識及造模方式的選擇，醫(yī)學界至今尚未達成統(tǒng)一意見。KOA患者臨床及病理表現(xiàn)復雜，在臨床診斷及療效評估中需要考慮患者癥狀、體征、生存質量等，目前KOA療效評估已經(jīng)有行業(yè)內認可的評分量表，但這些量表在觀察指標上無法施行于實驗動物的運用中。動物KOA模型評價方法主要由實驗本身決定，如動物選擇、觀察指標、實驗方法及設計等因素決定，因此，在評價的實際運用中，我們實時關注評價方法的進展，并根據(jù)自身研究的預期目的，結合實驗觀察目標、經(jīng)費運算及實驗室條件等來選擇合理評價標準，以期獲得最為理想的實驗結果，為臨床實踐提供更好的支持。

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收稿日期：2015-04-09；修回日期：2015-05-20