唐艷斌，胡婉峰*

（1.華中農(nóng)業(yè)大學 食品科學與技術(shù)學院，湖北 武漢 430070；2.中國疾病預防控制中心 營養(yǎng)與健康所，北京 100050；3.國家衛(wèi)生計生委 微量元素重點實驗室，北京 100050）

β-葡聚糖（glucan）是以β-葡萄糖殘基通過β-1,3和β-1,4糖苷鍵以一定的比例連接而成的線性分子，在大麥、燕麥、高粱、大米和小麥等谷物的胚乳細胞壁中的含量尤其豐富[1]。β-葡聚糖通常以高分子形式溶于水，造成溶液黏度較高，給工業(yè)生產(chǎn)帶來諸多問題[2]。例如，在啤酒行業(yè)中，大麥作為主要生產(chǎn)原料，其β-葡聚糖含量（4%～8%）較高，造成麥汁和啤酒黏度增加，致使麥汁過濾困難、得率降低，并引起啤酒的非生物性渾濁，影響啤酒的穩(wěn)定性和質(zhì)量[3]。在飼料行業(yè)中，以大麥等谷物作為飼料，高分子質(zhì)量的β-葡聚糖引起畜禽胃液黏度增加，阻礙單胃動物對養(yǎng)分的吸收，谷物飼用價值降低。β-1,3-1,4-葡聚糖酶（EC 3.1.2.73）是啤酒行業(yè)和飼料工業(yè)中一種重要工業(yè)酶制劑，它主要水解β-葡聚糖中β-1,4糖苷鍵連接的3-O-替代的葡萄糖殘基成為較小的聚合物，從而降低β-葡聚糖對啤酒和飼料行業(yè)所造成的問題[3-5]。

β-1,3-1,4-葡聚糖酶的獲得主要由微生物發(fā)酵生產(chǎn)，發(fā)酵方法主要有液體發(fā)酵[6-9]。相比于液體發(fā)酵而言，固體發(fā)酵具有生產(chǎn)成本低，工藝簡單，對機械設備和耗能等要求不高，環(huán)境污染小，適宜真菌生長等優(yōu)勢，近年來越來越受到關(guān)注[10]。國內(nèi)外關(guān)于真菌產(chǎn)β-1,3-1,4-葡聚糖酶的研究還不是很多，到目前為止主要以中溫菌木霉（Trichoderma）和黑曲霉（Aspergillus niger）為主[11]，而關(guān)于耐熱真菌發(fā)酵產(chǎn)β-1,3-1,4-葡聚糖酶的固體發(fā)酵的研究報道較少[12-13]。

本研究前期分離篩選得到一株擬青霉WPG-1，發(fā)現(xiàn)該菌能夠產(chǎn)β-1,3-1,4-葡聚糖酶，擬進一步采用固體發(fā)酵的方式，通過單因素試驗優(yōu)化擬青霉WPG-1固體發(fā)酵產(chǎn)β-1,3-1,4-葡聚糖酶的發(fā)酵工藝，為其工業(yè)化生產(chǎn)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 培養(yǎng)基

菌種的初篩和復篩以及菌種保藏培養(yǎng)基都采用馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar，PDA）培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g，葡萄糖20.0 g，瓊脂15.0 g，蒸餾水1 000 mL。

種子液培養(yǎng)基：在250 mL三角瓶中加入1 g麩皮和50 mL營養(yǎng)鹽溶液，121 ℃滅菌30 min，冷卻后接種1 cm2大小左右菌絲體，置于空氣浴振蕩搖床中50 ℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)24 h。

固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基：碳源，氮源（氮素含量均為0.2%），20 mL營養(yǎng)鹽溶液（CaCl20.3 g/L，MgSO4·7H2O 0.3 g/L，KH2PO45 g/L），調(diào)節(jié)pH值為5.0。

1.1.2 試劑

大麥葡聚糖、葡萄糖：美國Sigma公司；蛋白質(zhì)低分子質(zhì)量標準品、脫氧核糖核苷三磷酸（deoxy-ribonucleoside triphosphate，dNTP）：大連TaKaRa公司；酵母提取物、胰蛋白胨：英國Oxoid公司；3,5-二硝基水楊酸（dinitrosalicylic acid，DNS）：美國Amresco公司；TaqPlus DNA聚合酶、PCR引物：上海生工生物工程股份有限公司。其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設備

LRH-恒溫恒濕培養(yǎng)箱：廣東省醫(yī)療器械廠；TU-1800PC紫外分光光度計：北京普析通用儀器設備有限責任公司；Power Pac Basic TM 型電泳儀：美國BIO-RAD 公司；GL-20B高速冷凍離心機：上海安亭科技儀器廠。

1.3 試驗方法

1.3.1 菌種的篩選

將來自新疆、青海、西藏、寧夏等地的200多個土樣分批用無菌水稀釋100倍，吸取0.1 mL涂布于馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基平板上，然后將平板置于45 ℃培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)4 d，觀察平板菌落生長情況，挑選平板上不同的耐熱真菌劃線純化。將初篩出的菌株進行進一步劃線分離，再在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)，直至得到單一菌株；再將得到的單一菌株在PDA培養(yǎng)基上保存于4 ℃條件下，每隔4～5周轉(zhuǎn)接一次。

1.3.2 菌種的鑒定

菌種鑒定分為兩個步驟：（1）肉眼觀察其單一菌落形態(tài)、顏色、氣味等；（2）采用分子生物學鑒定：DNA的提取與擴增：DNA的提取方法參照WANG L等的方法[14]。18S rDNA的擴增采用通用的引物NS1-NS24[15]。

聚合酶鏈反應（polymerse chin rection，PCR）體系：在50 μL的混合液中進行，混合液中含有2.3 μL 基因組DNA，5 μL PCR緩沖液，1 μL dNTP（1 mmol/L），2 μL引物（10 pmol/μL），0.7 μLTaq聚合酶（2 U/μL）和37 μL超純無菌水。

PCR條件：94 ℃4 min；94 ℃1 min，55 ℃1 min，72 ℃1.5 min，35個循環(huán)；最后延伸7 min。

DNA序列測定、序列比對和種系發(fā)育分析：PCR的擴增產(chǎn)物通過瓊脂糖凝膠電泳純化后，由上海Genecore生物技術(shù)有限公司進行測序通過Clustal X進行序列比對。對比對結(jié)果進行了校正和調(diào)整。選擇毛緣毛杯菌（Cookeina tricholoma）作為外群。用PAUP 4.0b10進行DNA分析。最后通過Bootstrap分析的1 000次重復和TBR交換技術(shù)對發(fā)育樹分支進行了驗證。

1.3.3 固體發(fā)酵產(chǎn)β-1,3-1,4-葡聚糖酶

在250 mL三角瓶中加入烘干后的各種碳源和19 mL營養(yǎng)鹽溶液，攪拌均勻，121 ℃滅菌30 min，冷卻后接種1 mL種子液，混勻后置于45 ℃培養(yǎng)箱中靜止培養(yǎng)4 d。

粗酶液的提?。好靠斯腆w發(fā)酵物加入10 mL 50 mmol/L，pH 6.0檸檬酸緩沖液，37 ℃下200 r/min振蕩提取2 h，10 000×g冷凍離心10 min，吸取上清液即為β-1,3-1,4-葡聚糖酶的粗酶液。

1.3.4 固體發(fā)酵產(chǎn)酶條件的優(yōu)化

采用單因素試驗法優(yōu)化擬青霉WPG-1固體發(fā)酵產(chǎn)β-1,3-1,4-葡聚糖酶的條件。選用不同的碳源考察對該菌株產(chǎn)酶的影響。在優(yōu)化碳源基礎上通過改變水分含量（從60%～90%）、氮源種類（氮素含量均為0.2%）、培養(yǎng)基初始pH值和培養(yǎng)溫度。在最佳培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件下，每天取樣后測β-1,3-1,4-葡聚糖酶活性和蛋白含量，了解產(chǎn)酶歷程。

1.3.5 酶活力及蛋白含量的測定

酶活力的測定方法[12]：取0.1 mL適當稀釋的酶液，加入0.9 mL（用50 mmol/L pH 6.0檸檬酸緩沖液配制）0.5%大麥葡聚糖底物中，60 ℃反應10 min，以葡萄糖作為標準采用DNS法測定所產(chǎn)生的還原糖量。β-1,3-1,4-葡聚糖酶的活力單位定義為：在上述反應條件下，每分鐘生成1 μmol葡萄糖所需要的酶量（U/g）。

蛋白含量的測定參照LOWRY O H等[17]的方法，以牛血清白蛋白作為標準蛋白。

1.3.6 十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳及酶譜

十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）電泳檢測按照LAEMMLI U K等[18]的方法。考馬斯亮藍R-250染色。β-1,3-1,4-葡聚糖酶酶譜分析為正常的SDS-PAGE后（電泳膠中含有0.2%的大麥葡聚糖），將電泳膠取出用25%的異丙醇溶液浸泡3次（10 min/次），使蛋白復性，然后用緩沖液浸泡3次（10 min/次）洗去異丙醇溶液，最后將電泳膠置于45 ℃條件下保溫30 min，加入0.5 g/L的剛果紅溶液染色30 min，用1 mol/L NaCl溶液脫色直至顯現(xiàn)透明帶。

1.3.7 數(shù)據(jù)處理

每組試驗設置3個重復，試驗數(shù)據(jù)采用Excel軟件處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 產(chǎn)酶菌株篩選

利用PDA培養(yǎng)基篩選平板，共篩選得到產(chǎn)葡聚糖酶真菌菌株25株，經(jīng)搖瓶發(fā)酵（1 g麩皮，1 g蛋白胨和50 mL營養(yǎng)鹽溶液，接種1 cm2大小左右菌絲體，置于空氣浴振蕩搖床中50 ℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)4 d）和酶活力測定，篩選出一株真菌產(chǎn)葡聚糖酶較高，為79.61 U/mL，該菌株在30～55 ℃范圍內(nèi)生長良好，最適生長溫度45 ℃，當溫度＞55 ℃基本不生長。PDA培養(yǎng)基45 ℃培養(yǎng)5 d的單菌落結(jié)果見圖1。由圖1可知，菌落正面顏色呈灰粉色，從毛狀菌落，無特殊氣味；顯微鏡下孢子呈卵圓形，分生孢子梗類似掃帚分枝。

圖1 菌株WPG-1菌落形態(tài)特征Fig.1 Colony morphology of strain WPG-1

2.2 菌株的分子生物學鑒定

以提取的WPG-1菌株DNA作為模板，以通用PCR引物進行擴增，引物序列為SR1R：5-TACCTGGTTGATCCT GCCAGT-3；SR6R：5-CCTTGTTACGACTTTTACTT-3。PCR產(chǎn)物進行瓊脂糖電泳分析，結(jié)果見圖2。

圖2 菌株WPG-1的18S rDNA PCR擴增電泳圖Fig.2 Electrophresis of PCR amplified 18S rDNA of strain WPG-1

將圖2中第1泳道的PCR擴增產(chǎn)物進行測序后，全長為1 711 bp。在18S rDNA基因序列同源性基礎上構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果見圖3，結(jié)合形態(tài)學觀察，通過分子生物學提取DNA測序比對后，初步鑒定該菌株為擬青霉屬（Paecilomycessp.），菌株命名為WPG-1。

圖3 菌株WPG-1的18S rDNA序列系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 Phylogenetic tree of strain WPG-1 based on 18S rDNA sequences

2.3 不同碳源對菌株WPG-1固體發(fā)酵產(chǎn)β-1,3-1,4-葡聚糖酶的影響

分別采用燕麥粉、大麥粉、玉米芯、白酒酒糟、高粱稈、麩皮、稻草粉作為單一碳源進行固體發(fā)酵產(chǎn)酶試驗，結(jié)果如表1所示。

表1 不同碳源對擬青霉WPG-1產(chǎn)酶的影響Table 1 Effect of carbon sources on β-1,3-1,4-glucanase production by Paecilomyces sp.WPG-1

由表1可知，燕麥粉作為碳源時菌株WPG-1產(chǎn)酶量最高為589.64 U/g，麩皮次之（518.02 U/g），其他幾種碳源如玉米稈、高粱桿、稻草等用作碳源時，所產(chǎn)β-1,3-1,4-葡聚糖酶活力均較低。這可能是由于燕麥粉中含有一定量的β-葡聚糖，而β-1,3-1,4-葡聚糖酶是誘導酶，可充分利用燕麥粉作為唯一碳源充分發(fā)酵產(chǎn)酶。因此，選擇燕麥粉作為固體發(fā)酵最佳碳源。

2.4 初始水分含量對菌株WPG-1固體發(fā)酵產(chǎn)β-1,3-1,4-葡聚糖酶的影響

固體發(fā)酵過程中，培養(yǎng)基初始水分含量是關(guān)鍵性因素之一。不同含水量對產(chǎn)β-1,3-1,4-葡聚糖酶的影響如圖4所示。由圖4可知，當培養(yǎng)基的初始水分含量為70%時，β-1,3-1,4-葡聚糖酶的產(chǎn)量最高（723.31 U/g）。許多研究表明固體發(fā)酵條件下，初始水分含量高適合大多數(shù)真菌生長和產(chǎn)酶[19]。這可能是因為含水量過低時，孢子萌發(fā)遲滯期延長，影響菌絲體的生長周期，同時降低了固態(tài)底物中營養(yǎng)物質(zhì)的溶解性和微生物生長所需要的水分活度，從而導致產(chǎn)酶量較低，而當含水量過高時，培養(yǎng)及表面黏連，造成培養(yǎng)基溶氧量不足，而發(fā)酵不徹底[20]。因此調(diào)節(jié)適當?shù)某跏妓趾繉晟L至關(guān)重要，該試驗選擇70%的初始水分含量固體發(fā)酵結(jié)果最適合。

圖4 初始水分含量對擬青霉WPG-1產(chǎn)β-1,3-1,4-葡聚糖酶的影響Fig.4 Effect of initial moisture content on β-1,3-1,4-glucanase productionby Paecilomyces sp.WPG-1

2.5 不同氮源對菌株WPG-1固體發(fā)酵產(chǎn)β-1,3-1,4-葡聚糖酶的影響

β-1,3-1,4-葡聚糖酶屬于誘導酶，其產(chǎn)酶量的高低受到酶誘導物及酶蛋白質(zhì)前體的調(diào)控，而酶蛋白質(zhì)的前體主要來自氮源。因此氮源的類型及性質(zhì)都會影響酶的合成和分泌。不同氮源（氮素含量均為0.2%）對產(chǎn)酶的影響結(jié)果如表2所示。

表2 不同氮源對擬青霉WPG-1產(chǎn)酶的影響Table 2 Effect of nitrogen sources on β-1,3-1,4-glucanase production by Paecilomyces sp.WPG-1

由表2可知，國產(chǎn)蛋白胨作為氮源時，產(chǎn)β-1,3-1,4-葡聚糖酶活最高為1 167.56 U/g。因此，選擇國產(chǎn)蛋白胨作為最佳氮源，進行下一步實驗優(yōu)化。

2.6 培養(yǎng)基初始pH對菌株WPG-1固體發(fā)酵產(chǎn)β-1,3-1,4-葡聚糖酶的影響

圖5 初始pH值對擬青霉WPG-1固體發(fā)酵產(chǎn)β-1,3-1,4-葡聚糖酶的影響Fig.5 Effect of initial pH on β-1,3-1,4-glucanase production by Paecilomyces sp.WPG-1

由圖5可知，偏酸性環(huán)境下有利于β-1,3-1,4-葡聚糖酶的合成。當初始pH自然（pH 5.4）時，擬青霉WPG-1固體發(fā)酵產(chǎn)β-1,3-1,4-葡聚糖酶的量達到最大（1 187.30 U/g）。這與李孝輝等[16]報道的黑曲霉G-415菌株固體發(fā)酵產(chǎn)β-葡聚糖酶的情況一致。因此，選擇當營養(yǎng)鹽初始pH為自然時為最佳發(fā)酵pH。

2.7 培養(yǎng)溫度對菌株WPG-1固體發(fā)酵產(chǎn)β-1,3-1,4-葡聚糖酶的影響

圖6 培養(yǎng)溫度對擬青霉WPG-1固體發(fā)酵產(chǎn)β-1,3-1,4-葡聚糖酶的影響Fig.6 Effect of culture temperature on β-1,3-1,4-glucanase production by Paecilomyces sp.WPG-1

由圖6可知，當發(fā)酵溫度為45 ℃時菌株產(chǎn)酶量最高，達到1 204.11 U/g。當培養(yǎng)溫度繼續(xù)上升至55 ℃時，酶活力急劇下降，為最高酶活力的30%左右。這是因為該菌株最適生長溫度為45 ℃，當溫度超過或低于45 ℃時，菌株都不能很好的生長，那么不能很好的利用培養(yǎng)基中的營養(yǎng)物質(zhì)進行發(fā)酵產(chǎn)酶，因此導致產(chǎn)酶量下降。本實驗選擇發(fā)酵溫度為45 ℃為最佳固體發(fā)酵溫度。

2.8 菌株WPG-1固體發(fā)酵產(chǎn)β-1,3-1,4-葡聚糖酶的產(chǎn)酶歷程

確定各發(fā)酵條件的最優(yōu)參數(shù)后，在最佳發(fā)酵條件的基礎上考察β-1,3-1,4-葡聚糖酶的產(chǎn)酶歷程，結(jié)果如圖7所示，所產(chǎn)胞外蛋白的SDS-PAGE電泳圖及相應的酶譜圖如圖8所示。

圖7 擬青霉WPG-1固體發(fā)酵產(chǎn)β-1,3-1,4-葡聚糖酶的歷程Fig.7 The time course of β-1,3-1,4-glucanase production by Paecilomyces sp.WPG-1

由圖7可知，菌株擬青霉WPG-1在優(yōu)化后的發(fā)酵條件下，從第3天開始產(chǎn)酶速度加快，到第5天時酶活力達到最高值1 324.49 U/g，然后隨著發(fā)酵時間的增加，酶活力開始下降。因此，發(fā)酵時間5 d為宜。

圖8 不同發(fā)酵時間擬青霉WPG-1發(fā)酵液SDS-PAGE電泳圖及酶譜圖Fig.8 SDS-PAGE electrophoresis and enzyme spectrum diagram of the fermentation broth produced by Paecilomyces sp.WPG-1 with different time

由圖8可知，擬青霉WPG-1所產(chǎn)胞外蛋白僅有1條β-1,3-1,4-葡聚糖酶帶，分子質(zhì)量為35 ku左右。

3 結(jié)論

從全國來源不同的土樣中篩選得到一株產(chǎn)β-1,3-1,4-葡聚糖酶的真菌菌株，經(jīng)過菌落形態(tài)及分子生物學檢測，初步鑒定為擬青霉（Paecilomycessp.）WPG-1。該菌株的最適生長溫度為45 ℃，通過單因素優(yōu)化試驗結(jié)果表明，當以燕麥粉為碳源，蛋白胨（氮素含量0.2%）為氮源，初始水分含量70%，初始pH為自然，培養(yǎng)溫度45 ℃時，培養(yǎng)發(fā)酵5 d，擬青霉WPG-1固體發(fā)酵產(chǎn)β-1,3-1,4-葡聚糖1 324.49 U/g，可較好地運用于飼料及啤酒工業(yè)。

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