鄧星星，江 英*，盧志強(qiáng)，王 璐，陳國剛，王陳強(qiáng)

（石河子大學(xué)食品學(xué)院，新疆 石河子 832000）

無花果（Ficus caricaLinn）是一種開花植物，隸屬于?？崎艑?，富含黃酮、多糖、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）等具有防治心血管疾病和老年性癡呆癥的生理活性物質(zhì)及具有抗癌功效的呋喃香豆素內(nèi)酯等物質(zhì)[1-3]。研究表明，無花果不僅具有抗氧化、抗病毒、抗菌的作用，還具有降血糖、降低血膽固醇、抗癌等作用[4-5]。

無花果采后極易軟化、褐變、腐敗，常溫條件下只能保存1～2 d，很難長途運(yùn)銷[6]。無花果以鮮食和無花果干果為主，較少用于深加工，這就使得無花果產(chǎn)業(yè)模式單一，其發(fā)展在一定程度上受到制約。而無花果酒作為無花果的深加工產(chǎn)品能很好的解決這一問題。無花果酒在充分利用無花果資源的同時有著自己獨(dú)特的保健功能，更適合現(xiàn)代生活[7]。無花果酒的釀造現(xiàn)在市場上多為果酒的釀酒酵母，專用的無花果釀酒酵母很少。果酒的釀酒酵母雖然經(jīng)過長期的篩選與改良，發(fā)酵性能較好，但是可能不太適用無花果酒的發(fā)酵，會使酒中甲醇和雜醇油的含量偏高，缺乏無花果特有的風(fēng)味[8-9]。

新疆是我國無花果主產(chǎn)區(qū)之一，其中阿圖什地區(qū)的無花果享有盛名，被譽(yù)為“無花果之鄉(xiāng)”，目前已經(jīng)獲得無花果原產(chǎn)地域保護(hù)[10]。為了尋找優(yōu)良的無花果釀酒酵母，篩選無花果自身的內(nèi)源酵母，本實(shí)驗(yàn)選擇新疆阿圖什的大無花果干為原料，研究了菌株的篩選，菌株的生長特性，菌株的發(fā)酵特性以及菌株在酒精和二氧化硫脅迫下，生長特性的變化，最后對菌株進(jìn)行內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（internal transcribed spacer，ITS）序列分析。為無花果內(nèi)源酵母釀造果酒提供一定的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 原料及試劑

新疆阿圖什大無花果果干：購于干果市場；白砂糖（食用級）：購于市場；酵母粉、蛋白胨、瓊脂粉：北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；葡萄糖、氫氧化鈉、無水乙醇、甘油：天津市致遠(yuǎn)化工有限公司；鹽酸：北京化工廠；亞硫酸：北京世紀(jì)拓鑫精細(xì)化工有限公司；偏重亞硫酸鉀：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司：甲醇（色譜純）、異戊醇（色譜純）、異丁醇（色譜純）：天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所；果膠酶：法國LALLEMAND集團(tuán)；PCR 試劑及DNA Maker：寶生物工程有限公司產(chǎn)品；Goldview DNA 染料：北京賽百盛基因技術(shù)有限公司；PCR 引物：上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司。

1.1.2 培養(yǎng)基

無花果發(fā)酵培養(yǎng)基（20°Bx）：無花果干按料液比1∶9（g∶mL）進(jìn)行打漿，加入0.03%的果膠酶，45 ℃酶解2 h，然后加入白砂糖，調(diào)節(jié)可溶性固形物含量為20%，121 ℃滅菌15 min。

酵母浸出粉胨葡萄糖（yeast extract peptone dextrose，YEPD）培養(yǎng)基：酵母粉10 g/L，葡萄糖20 g/L，蛋白胨20 g/L，121 ℃滅菌20 min。根據(jù)發(fā)酵和培養(yǎng)要求，調(diào)整糖度和pH值。

酵母膏胨葡萄糖（yeast extract peptone dextrose，YPD）培養(yǎng)基：酵母粉10 g/L，葡萄糖20 g/L，蛋白胨20 g/L，瓊脂粉20 g/L，121 ℃滅菌20 min。

1.2 儀器與設(shè)備

SW-CJ-2D 雙人單面潔凈工作臺：蘇州蘇潔凈化設(shè)備有限公司；ZXSD-1160 全自動新型生化培養(yǎng)箱：上海智城分析儀器制造有限公司；722可見分光光度計(jì)：上海精密科技有限公司；BSA224S電子天平：北京賽多利斯天平有限公司；WYT-32型手持折光儀：福建泉州光學(xué)儀器廠；LDZX-40Ⅱ型立式自動電熱壓力蒸汽滅菌器：上海申安醫(yī)療器械廠；XSP-4C雙目生物顯微鏡：上海繪統(tǒng)光學(xué)儀器廠；BL-206-Ⅱ型高速冷凍離心機(jī)：上海安亭科技儀器廠；PowerPac Basic電泳儀、JS680C凝膠成像儀、PTC-0220 PCR儀：美國Bio-Rad公司；MultiNA核酸定量儀：日本島津儀器有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 無花果內(nèi)源酵母的初步篩選和富集培養(yǎng)

選取無花果干100 g，放入預(yù)先準(zhǔn)備好的燒杯中，向燒杯中倒入體積分?jǐn)?shù)為75%的酒精，使整個果實(shí)淹沒在酒精中2 min，用滅過菌的濾紙片擦干，然后用無菌水沖洗3遍，無菌濾紙吸干；再用3%次氯酸鈉浸泡2 min，無菌濾紙吸干后，無菌水沖洗4遍。將未使用的無菌水接種作為空白對照，以驗(yàn)證水的滅菌效果同時避免引入其他雜菌。無花果表面消毒后取最后一次沖洗的無菌水作為對照，以驗(yàn)證表面消毒效果[11-13]。然后，加入300 mL無菌水打漿，將漿液裝入500 mL的無菌三角瓶中，并添加偏重亞硫酸鉀20 mg于漿液中，用8層干燥的紗布包扎瓶口，于生化培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)，溫度為30 ℃，至漿液內(nèi)產(chǎn)生氣泡并能聞到酒香味后停止培養(yǎng)。

在無菌條件下，對發(fā)酵液進(jìn)行不同濃度的梯度稀釋，記錄并編號，選取適宜的稀釋梯度，將其涂布于YPD平板培養(yǎng)基上，并將不同濃度設(shè)計(jì)3個平行，于30 ℃靜置培養(yǎng)48 h，通過菌落形態(tài)及鏡檢觀察，初步確定酵母菌。經(jīng)過劃線分離純化，挑起單菌落與YEPD試管培養(yǎng)基中進(jìn)行富集培養(yǎng)。將富集后的酵母菌接入料液比為1∶9（g∶mL）的無花果漿液，通過白砂糖調(diào)節(jié)可溶性固形物含量為20%，靜置發(fā)酵培養(yǎng)7 d。依據(jù)國家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》和GB/T 5009.48—2003《蒸餾酒與配制酒衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)的分析方法》，分別測定酒精度、甲醇和雜醇油含量。通過菌落形態(tài)及發(fā)酵特性對比完成初步篩選。

1.3.2 菌株發(fā)酵生長特性對比

pH對酵母菌生長的影響：將初步篩選的酵母菌分別接入pH值為4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5的YEPD培養(yǎng)基（8°Bx）中，接種量為1×105CFU/mL，溫度為30 ℃，靜置培養(yǎng)12 h，測定OD600nm[14]，考察pH對酵母菌生長的影響。

溫度對酵母菌生長的影響：將初步篩選的酵母菌接入適宜pH的YEPD（8 °Bx）中，接種量為1×105CFU/mL，分別在26 ℃、28 ℃、30 ℃、32 ℃、34 ℃、36 ℃靜置培養(yǎng)12 h，測定OD600nm，考察溫度對酵母菌生長的影響。

接種量對酵母菌的生長的影響：將初步篩選的酵母菌接入適宜pH，適宜溫度的YEPD培養(yǎng)基（8°Bx）中，接種量分別為0.5×105CFU/mL，1.0×105CFU/mL和2.0×105CFU/mL，靜置培養(yǎng)12 h，測定OD600nm，考察接種量對酵母菌生長的影響。

1.3.3 生長曲線的繪制

將初步篩選的酵母菌接入適宜pH的YEPD培養(yǎng)基（8°Bx）中，接種量為1×105CFU/mL，溫度分別為對應(yīng)的適宜溫度和26 ℃，靜置培養(yǎng)24 h，每隔2 h取樣測定OD600nm，繪制酵母菌的生長曲線。

1.3.4 酵母菌生長耐受性試驗(yàn)

（1）酵母菌對乙醇及二氧化硫的耐受性測試

采用杜氏管發(fā)酵法測定酵母菌對乙醇及二氧化硫的耐受性。通過無菌過濾方式分別加入無水乙醇及偏重亞硫酸鉀，使得YEPD培養(yǎng)基（8°Bx）的乙醇體積分?jǐn)?shù)分別為0、5%、8%、11%、14%、17%，二氧化硫的含量分別為0、60 mg/L、120 mg/L、180 mg/L、240 mg/L、300 mg/L，接入酵母菌，接種量為1×105CFU/mL，pH值為5.0，溫度為30 ℃，靜置培養(yǎng)72 h，觀察杜氏小管中的產(chǎn)生氣泡的情況。

（2）發(fā)酵過程中總糖和酒精度的變化

將篩選的菌株接種到Y(jié)EPD發(fā)酵培養(yǎng)基上，調(diào)整糖度使得可溶性固形物含量為20%，接種量為1×105CFU/mL，pH值為5.0，溫度為30 ℃，靜置培養(yǎng)，每天測定糖度，并取樣測定酒精度和總糖含量，至糖度到達(dá)8%，轉(zhuǎn)移至15 ℃以下，低溫陳釀15 d。

（3）分子生物學(xué)鑒定（ITS序列分析）

將膠模具培養(yǎng)至對數(shù)生長期，離心收集酵母菌。使用脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）提取試劑盒提取目的酵母菌的基因組DNA。經(jīng)1%瓊脂糖凝膠中電泳檢測并確認(rèn)提取成功后，進(jìn)行ITS rDNA 基因片段的聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）擴(kuò)增[9]。所用通用引物為ITS1（5′TCCGTAGGTGAAC-CTGCGC3′）和ITS4（5′TCCTCCGCTTATTGATAT-GC3′）。PCR 反應(yīng)條件是：95 ℃預(yù)變性5 min，95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1.5 min，體系運(yùn)行4個循環(huán)，最后72 ℃延伸10 min。PCR 產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠中電泳檢測，取膠體于UV1 成像系統(tǒng)拍照，測序。將PCR 產(chǎn)物ITS 測序結(jié)果輸入美國國家生物技術(shù)信息中心（national center for biotechnology information，NCBI）網(wǎng)站的核酸數(shù)據(jù)庫比對系統(tǒng)，利用Blast 程序進(jìn)行核酸序列比對分析。用MEGA 5.0 軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，進(jìn)行親緣關(guān)系和系統(tǒng)發(fā)育分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 無花果內(nèi)源酵母的初步篩選

通過對發(fā)酵液的稀釋涂布、分離純化，得到3株生長度比較高的菌株，菌落表面光滑，顏色均一，為乳白色。分離獲得的菌株呈球形，卵圓形或梭形，均符合酵母菌的菌落特征，初步確定為酵母菌，經(jīng)顯微鏡觀察如圖1所示。然后對這3株酵母菌富集培養(yǎng)，并對富集培養(yǎng)后的菌落形態(tài)特征和發(fā)酵特性進(jìn)行研究，結(jié)果如表1所示。

圖1 3株分離菌株的菌體形態(tài)Fig.1 Cell morphology of three isolated yeast strains

表1 無花果內(nèi)源酵母的菌落形態(tài)和發(fā)酵特性Table 1 Colony characteristics and fermentation properties of endogenous yeast from fig fruit

SUYX-02和SUYX-03經(jīng)純化后，在YPD平板培養(yǎng)基上生長48 h的菌落生長狀況見圖2。由表1、圖2可知，雖然酵母菌SUYX-01的發(fā)酵液中甲醇和雜醇油的含量都很低，但是發(fā)酵液渾濁，發(fā)酵味較重，酒精度明顯偏低，不是優(yōu)良的發(fā)酵菌株。SUYX-02和SUYX-03的發(fā)酵液酒精度較高，而且有果香味，雜醇油含量雖然有點(diǎn)高，但在國家標(biāo)準(zhǔn)范圍內(nèi)，甲醇含量符合國家標(biāo)準(zhǔn)。而且對于成品酒雜醇油的含量可以進(jìn)行工藝優(yōu)化來降低。比較而言，SUYX-02和SUYX-03菌株適合無花果酒發(fā)酵，因此對其生長特性和發(fā)酵特性進(jìn)行深入研究。

圖2 酵母菌SUYX-02和SUYX-03生長48 h特征Fig.2 The character of strains SUYX-02 and SUYX-03 on YPD medium at 48 h

2.2 酵母菌SUXY-02和SUYX-03生長特性對比

2.2.1 pH對酵母菌生長的影響

圖3 pH對酵母菌生長的影響Fig.3 Effects of p H on yeast growth

由圖3可知，SUYX-02在pH較低和較高時，生長量都較低，在pH為5.0左右時取得較大的生長量時OD600nm為0.59；SUYX-03生長量在pH 4.0～5.5時逐漸增大，在pH為5.5時達(dá)到最大值OD600nm為0.61。酵母菌不同，最適合酵母菌生長的pH也有所差異。在本實(shí)驗(yàn)條件下，酵母菌SUYX-02適宜pH值為5.0，SUYX-03的適宜pH值為5.5。

2.2.2 溫度對酵母菌生長的影響

由圖4可知，酵母菌SUYX-02隨著溫度的增加，生長量逐漸增大，在32 ℃取得最大值時OD600nm為0.68，隨后生長量逐漸下降。酵母菌SUYX-03在30 ℃之前生長量隨溫度也是逐漸增加，并在30 ℃取得最大生長量時OD600nm為0.72，且最大生長量比SUYX-02的最大生長量大，30 ℃之后，隨溫度增加酵母菌SUYX-03的生長量迅速下降。在本實(shí)驗(yàn)條件下SUYX-02的最適溫度為32 ℃，SUYX-03的最適溫度為30 ℃。

圖4 溫度對酵母菌生長的影響Fig.4 Effects of temperature on yeast growth

2.2.3 接種量對酵母菌生長的影響

圖5 接種量對酵母菌的生長影響Fig.5 Effects of inoculum on yeast growth

由圖5可知，酵母菌SUYX-02和SUYX-03在自身適宜的溫度和pH生長條件下，隨著接種量的增加生長量也隨之增加。在接種量為0.5×105CFU/mL、1.0×105CFU/mL時，生長量雖都有增加但酵母菌SUYX-03始終比SUYX-02的生長量大，接種量為2.0×105CFU/mL時酵母菌SUYX-02超過SUYX-03的生長量，說明酵母菌SUYX-02生長迅速。接種量過低酵母菌種發(fā)酵生長較慢，影響發(fā)酵進(jìn)度；接種量過高酵母菌種發(fā)酵生長較快，難以控制發(fā)酵進(jìn)度[9]。對于工業(yè)生產(chǎn)，發(fā)酵接種量的選擇要依據(jù)具體的生產(chǎn)實(shí)際情況而定。對于本實(shí)驗(yàn)，為了使得兩株酵母菌的生長量差異較小，選擇1.0×105CFU/mL接種量來進(jìn)行發(fā)酵試驗(yàn)。

2.3 酵母菌生長曲線的測定

兩株酵母菌的生長曲線見圖6。酵母菌的生長曲線很好的顯示了酵母菌在生長周期內(nèi)的生長規(guī)律，了解酵母菌的生長周期，掌握其最佳生長階段，對于酵母類產(chǎn)品的更好地生產(chǎn)就顯得至關(guān)重要[15]。通過對兩株酵母菌的最佳發(fā)酵條件下進(jìn)行生長曲線的測定，能對這兩株菌的生長規(guī)律有著更深的了解。

圖6 酵母菌的生長曲線Fig.6 Growth curve of yeast

由圖6可知，對于酵母菌SUYX-03，其對數(shù)生長期為4～14 h，此時期酵母菌生長迅速酵母繁殖速度最旺盛，并且出芽率最高，14～24 h為平穩(wěn)期，在此期菌體產(chǎn)量與營養(yǎng)物質(zhì)的消耗間呈現(xiàn)出有規(guī)律的比例關(guān)系，＞24 h后進(jìn)入衰亡期，在此期間由于酵母菌SUYX-02生長迅速，代謝旺盛，二氧化碳迅速生成，在發(fā)酵液中產(chǎn)生氣泡，對OD值的測量產(chǎn)生影響；對于酵母菌SUYX-02，其對數(shù)生長期為4～14 h，穩(wěn)定期為14～28 h，＞28 h之后進(jìn)入衰亡期。酵母菌SUYX-03對數(shù)期和穩(wěn)定期有一定的持續(xù)時間，使得該酵母菌在生產(chǎn)應(yīng)用中有利于生產(chǎn)取菌及收集代謝產(chǎn)物。

2.4 酵母菌生長耐受性試驗(yàn)結(jié)果

2.4.1 乙醇耐受性

兩株酵母菌乙醇耐受性結(jié)果見表2。由表2可知，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)為11%時，杜氏小管內(nèi)有大量的氣泡產(chǎn)生；當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)為14%時，杜氏小管內(nèi)有極少的氣泡產(chǎn)生，說明酵母菌SUYX-02的最高乙醇耐受性為11%。當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)為14%時，杜氏小管內(nèi)有大量的氣泡產(chǎn)生；當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)為17%時，杜氏小管內(nèi)有極少的氣泡產(chǎn)生，說明酵母菌SUYX-03的最高乙醇耐受性為14%。酵母菌SUYX-02的乙醇耐受性偏低，而酵母菌SUYX-03的乙醇耐受性較好，適合一般酒精度的果酒發(fā)酵。

表2 酵母菌乙醇耐受性Table 2 Ethanol tolerance of yeast strains

2.4.2 二氧化硫耐受性

兩株酵母菌二氧化硫耐受性結(jié)果見表3。由表3可知，當(dāng)二氧化硫添加量為240 mg/L，杜氏小管內(nèi)有較多的氣泡產(chǎn)生；當(dāng)二氧化硫添加量為300 mg/L，杜氏小管內(nèi)有較少的氣泡產(chǎn)生，因此酵母菌SUYX-02的最高二氧化硫耐受性為240 mg/L。當(dāng)二氧化硫添加量為300 mg/L，杜氏小管內(nèi)有較多的氣泡產(chǎn)生；當(dāng)二氧化硫添加量為360 mg/L，杜氏小管內(nèi)有較少的氣泡產(chǎn)生，因此酵母菌SUYX-03的最高二氧化硫耐受性為300 mg/L。酵母菌SUYX-03的二氧化硫耐受性較好，符合果酒生產(chǎn)要求。

表3 酵母菌二氧化硫耐受性Table 3 SO2tolerance of yeast

2.5 發(fā)酵過程中總糖和酒精度的變化結(jié)果分析

通過篩選得到的酵母菌運(yùn)用到實(shí)際中發(fā)酵得到果酒，發(fā)酵性能的測定是判定酵母菌是否優(yōu)良的重要依據(jù)，是判定酵母菌發(fā)酵性能的重要指標(biāo)。將酵母菌SUYX-03接入無花果發(fā)酵培養(yǎng)基（20°Bx），溫度為30 ℃，模擬實(shí)際發(fā)酵過程，對該菌株的發(fā)酵性能進(jìn)行研究，結(jié)果見圖7。

圖7 酵母菌SUYX-03發(fā)酵過程中總糖及酒精度的變化Fig.7 Total sugar and alcohol content change in the fermentation broth of strain SUYX-03

由圖7可知，在發(fā)酵周期內(nèi)，隨時間的增加酒精度隨之增加，在第6天時達(dá)到最大的酒精度10.9%vol，同時發(fā)酵液中的總糖隨之減少最終達(dá)至4 g/L左右。在15 ℃此條件下陳釀15 d，糖度降低為2.5 g/L，酒精度為10.5%vol，發(fā)酵比較徹底，符合果酒發(fā)酵標(biāo)準(zhǔn)，酵母菌SUYX-03可以作為釀酒酵母菌株。

2.6 分子生物學(xué)鑒定結(jié)果分析

將酵母菌株SUYX-02、SUYX-03進(jìn)行ITS序列擴(kuò)增，擴(kuò)增結(jié)果見圖8。由圖8可知，在退火溫度55 ℃條件下，兩酵母擴(kuò)增片段長度750～100 bp，特異性目的條帶清晰且無雜帶。將獲得酵母菌SUYX-03的ITS 序列，進(jìn)行BLAST同源比對，結(jié)果酵母菌SUYX-03與酵母菌同源性最高，同源性為97%。基于酵母菌ITS序列的相似性而構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹見圖9。由圖9可知根據(jù)同源性比較該菌釀酒酵母的親緣關(guān)系最近。結(jié)合形態(tài)學(xué)結(jié)果與發(fā)酵特性，菌株SUYX-02、SUYX-03鑒定為釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）。

圖8 酵母菌ITS序列擴(kuò)增產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳圖Fig.8 Agarose gel electrophoretogram of yeast ITS sequences amplifying product

圖9 SUYX-03菌株的ITS rDNA 的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹Fig.9 ITS rDNA phylogenetic tree of strain SUYX-03

3 結(jié)論

從口感甘甜、營養(yǎng)豐富的新疆大無花果中經(jīng)過篩選得到一株優(yōu)良的酵母菌株SUYX-03，該酵母菌的適宜生長溫度為30 ℃，適宜pH值為5.5，最大酒精耐受性為14%vol，最高二氧化硫耐受性為300 mg/L。從生長曲線上看出其對數(shù)生長期為4～14 h，對數(shù)期和穩(wěn)定期時間合適，使得該酵母菌在生產(chǎn)應(yīng)用中更利于生產(chǎn)取菌及收集代謝產(chǎn)物。在有害物質(zhì)的生成方面，甲醇和雜醇油生成較少，符合果酒國家生產(chǎn)標(biāo)準(zhǔn)。

通過ITS序列分析，鑒定出菌株SUYX-03屬于酵母屬（Saccharomyce）中的釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）。由發(fā)酵試驗(yàn)得出該酵母菌是適合無花果果酒制作的優(yōu)良的釀酒酵母。

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