董 丹，車振明，關(guān)統(tǒng)偉*

（西華大學(xué)微生物研究所，食品生物技術(shù)四川省高校重點實驗室，四川 成都 610039）

纖維素是植物細(xì)胞壁的主要組成成分，廣泛分布于自然界中。據(jù)統(tǒng)計，每年全球通過光合作用產(chǎn)生的纖維素總量達(dá)1.7×1012kg[1]。自然界中能產(chǎn)纖維素酶的微生物種類繁多，主要包括真菌，放線菌和部分酵母菌、部分細(xì)菌等[2]。纖維素酶多為糖蛋白，酶分子的一級結(jié)構(gòu)由核心催化域（catalytic domain，CD）、纖維素結(jié)合域（cellulose binding domain，CBD）和將這兩部分相連的鏈接區(qū)（linker）三部分組成，也有僅含核心催化區(qū)而無CBD區(qū)的纖維素酶，這類酶主要是水解水溶性纖維素[3-4]。

纖維素酶除了用于谷物發(fā)酵產(chǎn)酒外，還有很廣泛的用途（應(yīng)用于如食品、紡織、飼料、石油勘探、中藥成分提取等領(lǐng)域[5-6]），作為一種綠色飼料添加劑，將飼料中的部分纖維素降解成可消化吸收的還原糖，提高飼料利用率[7-12]。目前，纖維素應(yīng)用最成功的領(lǐng)域就是纖維素在工業(yè)上的大規(guī)模應(yīng)用，如用酸性纖維素酶水洗整理牛仔布，這也是目前纖維素酶應(yīng)用用量最大的領(lǐng)域[13]。目前纖維素酶制造成本還相對較貴，但其應(yīng)用卻日益廣泛，因而要想其大量運用于商業(yè)領(lǐng)域，降低其成本就尤為重要。高產(chǎn)纖維素菌能大大降低纖維素酶的制造成本，因此高產(chǎn)纖維素酶菌株的篩選是關(guān)鍵問題之一。白酒是用谷物釀造而成的，但是目前僅僅是利用谷物中的淀粉來發(fā)酵生產(chǎn)酒，對谷物和谷物殼中的纖維素利用卻很少。利用微生物發(fā)酵的方法，使纖維素在纖維素酶的酶促反應(yīng)下水解成二糖和葡萄糖，從而不僅使谷物的利用率增加，提高了出酒率，也使得酒糟的營養(yǎng)價值提高和減輕了環(huán)境污染問題。

本實驗從白酒糟中篩選產(chǎn)纖維素酶的菌株，并通過測定酶活力大小得出其最適生長pH值和溫度，可為酒廠實際生產(chǎn)過程中充分利用纖維素酶提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

白酒酒糟：瀘州老窖釀酒廠，采自2014年7月，密封保存于-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 試劑

牛肉膏、蛋白胨、硫酸氫氨、氯化鈉、羧甲基纖維素鈉（carboxymethylcellulose sodium-Na，CMC-Na）、磷酸氫二鉀、硫酸鎂、葡萄糖（均為分析純）：成都科龍化工試劑廠；3,5-二硝酸水楊酸（3,5-dinitrosalicylic acid，DNS）（化學(xué)純）：南京歐特化工試劑廠。

1.1.3 培養(yǎng)基

篩選培養(yǎng)基：CMC-Na 1 g，瓊脂2 g，（NH4）2SO40.25 g，K2HPO40.3 g，MgSO4·7H2O 0.05 g，定容至100 mL，pH值為7.2。

種子培養(yǎng)基：牛肉膏1 g，蛋白胨0.3 g，NaCl 0.5 g，定容至100 mL，pH值為7.0。

發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)基：（NH4）2SO40.25 g，K2HPO40.3 g，MgSO4·7H2O 0.05 g，CMC-Na 0.6 g，葡萄糖0.4 g，定容至100 mL，pH值為7.0。

1.2 儀器與設(shè)備

DHP-9052電熱恒溫培養(yǎng)箱、DHG-9075A電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱：上海一恒科學(xué)儀器有限公司；ZWY-1102C恒溫培養(yǎng)振蕩器：上海智城分析儀器制造有限公司；TDZS-WS冷凍離心機：上海盧湘儀；LDZX-75KB立式壓力蒸汽滅菌器：上海中安醫(yī)療器械廠；DYY-8C雙定時電泳儀：北京市六一儀器廠。

1.3 實驗方法

1.3.1 產(chǎn)纖維素酶菌株的初篩

稱取10 g白酒酒糟置于100 mL的錐形瓶中，加入90 mL無菌水，搖勻。取混合后溶液的上清液按10倍稀釋法依次稀釋成10-2、10-3、10-4倍的稀釋溶液，用無菌移液槍分別移取100 μL各稀釋液于篩選培養(yǎng)基，用涂布棒將菌液均勻涂布于培養(yǎng)基表面，放置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2～3 d，觀察有無水解圈的產(chǎn)生，通過測定水解圈的大小來初步判定菌株酶活力的大小。

1.3.2 產(chǎn)纖維素酶菌株的復(fù)篩

（1）選取培養(yǎng)基上呈單菌落的菌，用無菌的竹簽分別挑取不同形態(tài)的菌落進(jìn)行分離純化。放置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2～3 d[14]，重復(fù)此步驟直至每種菌為純菌落。

（2）當(dāng)培養(yǎng)的菌純化后，向培養(yǎng)基里加入適量的2%剛果紅溶液[15]，染色15 min后用蒸餾水和1 mol/L氯化鈉溶液清洗[16]。觀察菌團周圍有無水解圈，有水解圈的菌可初步判定為產(chǎn)纖維素酶菌株。菌落若產(chǎn)生羧甲基纖維素酶（CMCase），培養(yǎng)基中的羧甲基纖維素（CMC）將被分解，剛果紅將不能吸附并著色，再用1 mol/L氯化鈉溶液洗滌后，菌落周圍就會形成透明圈，而平板中沒有產(chǎn)生CMCase的菌落和其他部位仍為紅色[17-18]。

（3）將產(chǎn)纖維素酶菌菌株保藏于-20 ℃冰箱中備用。

1.3.3 產(chǎn)纖維素酶菌株的鑒定

DNA的提?。篋NA的提取采用改良十六烷基三甲基溴化銨法（cetyltrimethyl ammonium bromide，CTAB）[19-20]法。得到的樣品總DNA于-20 ℃保存，作為后續(xù)PCR的模板。

PCR及產(chǎn)物的純化：以提取得到的DNA為模板，細(xì)菌選擇通用引物Eμ27F（5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'）；1490R（5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'）。反應(yīng)條件：95 ℃、4 min，95 ℃、60 s，56 ℃、60 s，72 ℃、120 s，35個循環(huán)；72 ℃、10 min。PCR反應(yīng)體系為50 μL：10×Buffer 5 μL、dNTP4μL、Taq酶0.5 μL、上下游引物各1μL、ddH2O37.5μL、DNA模板1 μL。PCR產(chǎn)物用1.4%瓊脂糖凝膠電泳檢測，電泳時間40 min。純化過程按照DNA膠回收試劑盒中的步驟進(jìn)行，具體步驟參照OMEGA公司E.Z.N.A.TM Gel Extraction Kit試劑盒說明。

測序：PCR產(chǎn)物純化后送往生工生物工程（上海）股份有限公司測序，測序結(jié)果提交NCBI（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）進(jìn)行Blast序列分析。

1.3.4 纖維素酶活力測定

（1）纖維素粗酶液的制備

將產(chǎn)纖維素酶菌株接種于種子培養(yǎng)基中，37 ℃、200 r/min搖床培養(yǎng)24 h后，取發(fā)酵液以2%的加樣量加入發(fā)酵培養(yǎng)基，37 ℃、200 r/min 搖床培養(yǎng)24 h。培養(yǎng)后8 000 r/min常溫離心10 min，取上清液為粗酶液測定纖維素酶活力。

（2）纖維素酶活力的測定方法

DNS試劑的配制：稱取DNS 3.15 g，加水500 mL，攪拌5 s，45 ℃水浴。然后逐步加入100 mL 0.2 g/mL氫氧化鈉溶液，同時不斷攪拌。直到溶液清澈透明（在加入氫氧化鈉的過程中，溶液的溫度不能超過48 ℃）。再逐步加入四水酒石酸鉀鈉91.0 g、苯酚2.50 g和無水硫酸鈉2.50 g。繼續(xù)45 ℃水浴加熱，同時補水300 mL，不斷攪拌，直到加入的物質(zhì)完全溶解。停止加熱，冷卻至室溫后，用水定容至1 000 mL。用燒結(jié)玻璃過濾器過濾。取濾液，儲存在棕色瓶中，避光保存。室溫條件下保存7 d后使用，有效期6個月。

葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的測定見參考文獻(xiàn)[21]。

羧甲基纖維素酶活定義：1 g固體酶（或1 mL液體酶），在指定溫度和pH條件下，水解CMC-Na底物0.5 h，產(chǎn)生相當(dāng)于1 mg葡萄糖的還原糖量，為一個酶活力單位，以U/g（或U/mL）表示。簡寫成CMCA-DNS[17]。

羧甲基纖維素（還原糖法）酶活測定過程：取1 mL粗制酶液與2 mL CMC-Na溶液（底物）在50 ℃水浴下混合反應(yīng)30 min，取出后加入DNS試劑3.0 mL[18]，放入沸水浴中加熱10 min，取出后用流水迅速冷卻至室溫，蒸餾水定容至20 mL，分光光度計在波長540 nm處測定OD值，通過葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線求出還原糖的含量，根據(jù)產(chǎn)生1 mg葡萄糖的還原糖量，為一個酶活力單位為計算方法，計算出具體的酶活（空白試驗除先滅酶外，其余條件不變）。

1.3.5 最適溫度的測定

將1 mL粗制酶液與2 mL的CMC-Na溶液混合后，分別在20 ℃、30 ℃、40 ℃、45 ℃、50 ℃、55 ℃、60 ℃、65 ℃、70 ℃、75 ℃、80 ℃條件下反應(yīng)30 min后測定其酶活。

1.3.6 最適pH值的測定

將1 mL粗制酶液與2 mL的CMC-Na溶液混合后，放置在溫度30 ℃條件，調(diào)節(jié)pH值分別為2、3、4、5、6、7條件下反應(yīng)后，測定其酶活。

2 結(jié)果與分析

2.1 產(chǎn)纖維素酶菌種篩選結(jié)果

2.1.1 菌株初篩結(jié)果

表1 產(chǎn)纖維素酶菌株的初篩結(jié)果Table 1 Preliminary screening results of cellulose-producing strain

由表1可知，菌株p1004的水解圈最大，菌株p1001的水解圈次之，水解圈最小的是菌株p1002。

2.1.2 菌株復(fù)篩結(jié)果

將初篩得到的菌株進(jìn)行分離純化，待菌落長成后選擇透明圈較大、菌落較小的菌株進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)。對菌落進(jìn)行剛果紅染色，初篩得到的3株產(chǎn)纖維素菌株產(chǎn)生的透明圈的效果明顯，其中菌株p1001和p1004的透明圈更加明顯。

2.1.3 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制以及纖維素酶活力的測定

通過繪制的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=0.616 1x-0.030 7（R2=0.996 4），根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算出3株菌的酶活力。在p1001、p1002、p1004三株菌株中，酶活力最高的菌株為p1004，酶活力大小為1.23 U/mL，約為p1001、p1002酶活力的兩倍。

2.2 產(chǎn)纖維素酶菌種的鑒定

表2 菌株分子鑒定結(jié)果Table 2 Identification results of strains

由表2可知，這三株菌同屬于一個屬即芽孢桿菌屬（Bacillus）。經(jīng)鑒定p1001為解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens），p1002為枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis），p1004為甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌（Bacillus methylotrophicus），與其相似菌株的相似度分別為100%、100%、99%。

2.3 溫度對菌株酶活力的影響

將不同纖維素粗制酶液與底物在不同的溫度條件下反應(yīng)后，得到酶活力隨溫度變化的曲線如圖1所示。

圖1 溫度對菌株p1001(A)、p1002(B)、p1004(C)酶活力的影響Fig.1 Effect of temperature on enzyme activity of strain p1001 (A),p1002 (B) and p1004 (C)

從圖1A可以看出，菌株p1001在20～45 ℃酶活力緩慢上升，45～55 ℃酶活力快速上升，55～80 ℃酶活力快速下降，最適生長溫度為55 ℃。從圖1B可以看出，菌株p1002在20～40 ℃酶活力緩慢上升，40～55 ℃酶活力快速上升，55～70 ℃酶活力快速下降，70～80 ℃酶活力下降趨勢稍微變緩，最適生長溫度為55 ℃。從圖1C可以看出，菌株p1004在20～40 ℃酶活力緩慢上升，40～55 ℃酶活力快速上升，55～60 ℃酶活力緩慢下降，60～80 ℃酶活力下降速率增加，最適生長溫度為55 ℃。故三種菌株的最適生長溫度均為55 ℃。

三株菌的酶活力隨溫度的變化情況都出現(xiàn)了先增后減的情況，隨著溫度從低溫升至55 ℃時，在最適溫度下，細(xì)胞生長最快，細(xì)胞膜的通透性最強，因此在此條件下，細(xì)菌內(nèi)酶活力最強，當(dāng)溫度持續(xù)升高的過程中，高溫破壞了細(xì)菌的細(xì)胞結(jié)構(gòu)，致使細(xì)菌不能正常的進(jìn)行新陳代謝，以至于抑制了細(xì)菌正常的產(chǎn)酶功能，酶活力降低，故最適溫度為55 ℃。

2.4 pH值對菌株酶活力的影響

將纖維素粗酶液與底物在不同pH條件下反應(yīng)后，得到酶活力隨pH值變化的曲線如圖2所示。

圖2 pH對菌株p1001(A)、p1002(B)、p1004(C)酶活力的影響Fig.2 Effect of pH on enzyme activity of strain p1001 (A),p1002 (B) and p1004 (C)

從圖2可知，菌株p1001在pH值為2～4時，菌株p1002和p1004在pH值為2～5時，酶活力隨pH值的增加而增加，pH值在5時達(dá)到最大值，在pH值＞5時，酶活力隨pH值的增加急劇下降。因此三種菌株的最適生長pH值均為5。

酶在最適pH范圍內(nèi)表現(xiàn)出活性，大于或小于最適的pH值，都會降低酶活性。主要是因為pH值的不同會改變底物分子和酶分子的帶電狀態(tài)，從而影響酶和底物的結(jié)合；過高或過低的pH值都會影響酶的穩(wěn)定性，進(jìn)而使酶遭受不可逆的破壞，因此最適pH值為5。

3 結(jié)論

長期以來，酶的產(chǎn)量和酶活力低一直是制約纖維素酶實際應(yīng)用的一個重要原因，因此，不斷的篩選高產(chǎn)纖維素酶菌株，對纖維素資源的利用有著重要的意義。本實驗中分離得到的三株產(chǎn)纖維素酶菌株的最適產(chǎn)酶溫度都為55 ℃，pH值為5。菌株p1004所產(chǎn)纖維素酶最大酶活為1.2 U/mL，約為菌株p1001和p1002最大酶活的兩倍。因此，利用菌株p1004來提高纖維素酶產(chǎn)量具有一定的實用價值，為后期解決纖維素酶產(chǎn)量低、活力低等問題提供了理論基礎(chǔ)。

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