平振杰，蘇亞蕊，關(guān)愛民，郜曉峰*

（1.河南大學(xué) 藥學(xué)院，河南 開封 475000；2.河南大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，河南 開封 475000）

隨著全球經(jīng)濟的快速發(fā)展，能源問題成為經(jīng)濟發(fā)展的重要因素，尋找能夠取代化石燃料的潛在能源迫在眉睫。生物發(fā)酵生產(chǎn)燃料成為最有效的方法之一，而生物丁醇則為生物燃料最具前景的研究之一。丁醇不僅是一種重要的有機化工原料，也是一種極具潛力的新型生物燃料。與乙醇相比，丁醇具有如下優(yōu)點[1]：性質(zhì)更接近烴類，其熱值（2.7×107J/L）比乙醇（2.1×107J/L）更為接近汽油（3.0×107J/L），能與汽油任意比例混合，能量密度與燃燒值高，且具有較低的蒸汽壓，揮發(fā)性低，腐蝕性小，水溶性低，污染輕等，因此丁醇被認為是汽油最好的潛在替代燃料。但從20世紀50年代開始，由于石油工業(yè)的迅速崛起，歐洲，北美等地生物丁醇發(fā)酵工業(yè)受到強烈的沖擊，逐漸被化石燃料工業(yè)取代[1]。最近幾年，隨著石油價格的波動及環(huán)境污染的加劇，生物發(fā)酵生產(chǎn)丁醇及其相關(guān)化合物又重新受到廣泛關(guān)注。

當前，工業(yè)生產(chǎn)高級醇大多使用甘薯、玉米等糧食作物作為原料，而潛在可替代原料（木質(zhì)纖維素，合成氣，CO2，廢蛋白類等）往往被當做廢棄物處理掉。隨著生物技術(shù)的不斷成熟，可替代原料已逐漸應(yīng)用到生物丁醇發(fā)酵過程中。該文系統(tǒng)介紹了近年來多種替代原料應(yīng)用到生物丁醇的研究進展，探討并展望了其在生物燃料發(fā)酵行業(yè)存在的問題及發(fā)展前景，提出了提高廢棄物生產(chǎn)丁醇的策略，對提高廢棄資源的利用效率、減少環(huán)境污染等方面具有一定意義。

1 生物丁醇以及高級醇生產(chǎn)的潛在替代原料

1.1 木質(zhì)纖維素類

纖維素是一種最具開發(fā)潛力的生物燃料發(fā)酵原料，主要由纖維素（35%～50%）、半纖維素（25%～35%）和木質(zhì)素（10%～20%）構(gòu)成。能分解木質(zhì)纖維素的微生物主要包括梭菌屬（Clostridium）和鏈霉菌屬（Streptomyces）等細菌，以及真菌中的曲霉屬（Aspergillus）、腐質(zhì)霉屬（Humicola）、白腐菌屬（Phanerochaete）和木霉屬（Trichoderma）等[2]。HIGASHIDE W等[3]從一株腐爛的雜草中分離出能直接利用纖維素的解纖維梭菌（Clostridium cellulolyticum），此梭菌是一種能天然利用纖維素和半纖維素的嗜溫梭菌。然而一般產(chǎn)溶劑菌株不具備分解木質(zhì)纖維的能力，往往需要預(yù)處理后才能用于溶劑生產(chǎn)。不同纖維原料采用處理方式的不同，發(fā)酵丁醇產(chǎn)率也有差異。SU H F等[4]酶水解甘蔗渣以C.beijerinckiiNCIMB 8052進行發(fā)酵，丙酮、丁醇、乙醇（acetone-butanol-ethanol，ABE）總?cè)軇┝窟_到11.9 g/L，其中丁醇產(chǎn)量為6.4 g/L。YANG M等[5]通過添加木聚糖酶和表面活性劑PEG 4000對大麥秸稈進行預(yù)處理，處理后葡萄糖得率由53.2%提高到86.9%，木糖得率由36.2%提升到70.2%，C.acetobutylicumDSM 1731菌株發(fā)酵酶解液中ABE總?cè)軇┊a(chǎn)量10.8 g/L，其中丁醇產(chǎn)量達到7.9 g/L。LU C C等[6]以C.acetobutylicumJB200（丙酮丁醇梭菌）發(fā)酵木薯渣水解液，氣提分離丁醇產(chǎn)量可以達到20 g/L。LIU Z Y等[7]以C.beijerinckiiATCC 55025發(fā)酵麥麩水解液，72 h后丁醇的產(chǎn)量為8.8 g/L。若針對不同纖維原料，開發(fā)出廉價的、簡便的前期處理工藝或選育不需要預(yù)處理就能直接發(fā)酵丁醇的菌株，能顯著加快纖維素生產(chǎn)丁醇的發(fā)展。近幾年來一些關(guān)于菌株發(fā)酵纖維產(chǎn)丁醇的相關(guān)報道見表1。

表1 關(guān)于木質(zhì)纖維素生產(chǎn)丁醇的相關(guān)報道Table 1 Reports about cellulosic butanol in recent years

1.2 合成氣

合成氣即由CO、H2、CO2等組成的混合氣體，一般來說，能利用合成氣發(fā)酵的微生物要么是以CO或CO2為碳源、以氫為能源，要么以CO為碳源和能源，但這些微生物發(fā)酵丁醇產(chǎn)量都很低，無法達到以糧食或植物纖維為原料生產(chǎn)丁醇的水平，故需尋找一些合成氣利用效率較高但不能生產(chǎn)丁醇的微生物，通過基因工程在其體內(nèi)構(gòu)建生成丁醇的代謝途徑；或原本能利用合成氣生產(chǎn)丁醇的微生物進行代謝工程改造，從而提高丁醇生產(chǎn)能力。目前報道的可自然利用合成氣發(fā)酵合成生物丁醇的菌株僅有梭狀芽胞桿菌（C.carboxidivorans）和食甲基丁酸桿菌（Butyribacterium methylotrophicumDSM 3468）[15]。C.carboxidivorans在自然條件下能利用合成氣產(chǎn)正丁醇、乙醇、丁酸和乙酸[16]。但野生型C.carboxidivorans主要產(chǎn)乙酸（每消耗1mol CO產(chǎn)56 mmol乙酸），正丁醇是次要產(chǎn)物（每消耗1 mol CO產(chǎn)8.9 mmol正丁醇[15]）。PHILLIPS J R等[16]利用C.carboxidivorans在特定比例合成氣（CO∶H2∶CO2=70∶20∶10）中改進發(fā)酵條件，丁醇質(zhì)量濃度超過1 g/L。Alkalibaculum bacchiCP15利用合成氣能代謝乙醇，卻不能合成丁醇，LIU K等[17]通過A.bacchiCP15和C.propionicum混合培養(yǎng)發(fā)酵，利用合成氣發(fā)酵產(chǎn)乙醇、正丙醇及正丁醇，其中正丁醇質(zhì)量濃度也達到1 g/L。TANNER R S等[18]通過研究發(fā)現(xiàn)C.ljungdahlii利用合成氣能獨立生產(chǎn)乙醇但卻不能獨立生產(chǎn)正丁醇，KOPKE M等[19]將丁醇代謝途徑的關(guān)鍵基因在C.ljungdahlii中同源表達，成功構(gòu)建了基于合成氣原料的生物丁醇轉(zhuǎn)化平臺。

1.3 CO2光合作用

微藻類是生活在海洋或淡水中的一類光合微生物，包括硅藻（chromalveolata）、藍藻（cyanobacteria）及其他單細胞藻類（如chlorophyta等），其光合作用速率和效率比陸地植物高得多，生物燃料產(chǎn)量可達1.2 L/m2[20]。ATSUMI S等[21]通過改變生物合成途徑結(jié)合KivD（2-酮異戊酸脫羧酶基因）和YqhD（乙醇脫氫酶基因）合成異丁醇。枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）乙酰乳酸合酶基因（AlsS）和大腸桿菌纈氨酸生物合成酶基因（IlvC、IlvD）在Synechococcus elongatusPCC 7942中過量表達，使工程菌6 d的異丁醇產(chǎn)量為450 mg/L[21]，超過了目前Cyanobacteria產(chǎn)氫氣和乙醇的產(chǎn)量。ATSUMI S等[21]還在類似的研究中驗證了二磷酸酮糖羧化酶的過量表達能提高中間產(chǎn)物異丁醛的量（1.1 g/L），結(jié)果同時表明代謝途徑的改變，使得光合作用速率得到提高。MACHADO I M等[22]也試圖構(gòu)建S.elongatus生產(chǎn)其他燃料和化工原料，并已取得了顯著成效。利用Cyanobacteria合成正丁醇則較為困難，LAN E I等[23]將AtoB、Hbd、Crt、Ter、和AdhE2等基因在S.elongatusPCC 7942中成功表達，重建S.Elongatus正丁醇代謝途徑，然而正丁醇產(chǎn)量依舊很低，發(fā)酵液中恒溫培養(yǎng)7 d的丁醇產(chǎn)量僅為14.5 mg/L。ETHAN I L等[24]將梭菌屬丁醇代謝途徑導(dǎo)入S.elongatusPCC 7942，通過添加多聚組氨酸附加物提高了Ter酶的表達，而Ter是利用煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamide adenine dinucleotide，NADH）驅(qū)動還原的重要酶，因此提高了丁醇合成的效率，亦表明了發(fā)酵過程中氧的移除是提高丁醇發(fā)酵的重要因素。BOND-WATTS B B等[25]發(fā)現(xiàn)S.elongatus在光合作用下產(chǎn)丁醇的代謝途徑中存在能量差（通過底物濃度1 mmol/L，pH值7，離子強度1 mmol/L的平衡裝置測定[26]），認為這是導(dǎo)致丁醇代謝困難的主要原因，為平衡此能量差，代謝過程中乙酰輔酶A的濃度必須大于雙乙酰輔酶A，SHEN C R等[27]通過在大腸桿菌中積累細胞內(nèi)乙酰輔酶A和NADH解決了能量差的問題，結(jié)果表明NADH的積累驅(qū)動下一步代謝過程合成正丁醇，但由于S.elongatus中乙酰輔酶A和NADH的濃度受限，此過程在S.elongatus中非常難以構(gòu)建。LAN E I等[28]利用ATP的能量維持兩分子乙酰輔酶A縮合的熱力學(xué)上的能量平衡，繞開了乙酰輔酶A和NADH濃度作為驅(qū)動力用于正丁醇合成這個瓶頸，在光合作用下正丁醇產(chǎn)量為30 mg/L。CHENG H H等[29]利用微藻類的光合作用產(chǎn)物，又通過C.acetobutylicum發(fā)酵，最終得到3.86 g/L的丁醇，此法有效的將藻類的光合作用吸收CO2同微生物發(fā)酵產(chǎn)溶劑相結(jié)合，避開了對微藻的工程改造。

1.4 CO2電子流

光反應(yīng)可以通過利用人造太陽能電池將光能轉(zhuǎn)化成電能，而作為替代物，光反應(yīng)和暗反應(yīng)（CO2的固定和生物燃料的生產(chǎn)）被分離開，然后電能在黑暗中直接或者通過電子媒介驅(qū)動CO2的固定[30-31]，CO2能夠轉(zhuǎn)化為燃料和化學(xué)能而不需要直接的光合作用，這也是一種將電能儲存在液體燃料中的有效方法[31]，由此電能轉(zhuǎn)化為化學(xué)能儲存在生物燃料中。利用傳統(tǒng)技術(shù)，電能首先必須轉(zhuǎn)換成簡單的電子載體，如H2，然后化能自養(yǎng)型生物利用儲存在H2中的能量固定CO2和合成生物燃料。但因H2在水中的低溶解性及存在安全隱患，對于微生物來說，H2不是理想的電子源，而作為替代物的甲酸具有高溶解性，并可以通過電解CO2和H2O得到[32]。此外，甲酸也能夠被一些微生物通過甲酸脫氫酶代謝產(chǎn)生NADH和CO2[32]。羅爾斯通氏菌（Ralstonia eutropha）是一種能固定CO2并利用甲酸作為能量來源的化能自養(yǎng)微生物，LI H等[31]通過一個完整的電能驅(qū)動生物燃料生產(chǎn)程序，利用R.eutropha生產(chǎn)異丁醇和3-甲基丁醇，將電能轉(zhuǎn)化為以生物燃料為載體的化學(xué)能。聚羥基丁酸酯是R.eutropha的碳儲存庫，將參與異丁醇代謝的相關(guān)基因（alsS，ilvCD，kivD和yqhD）重組于R.eutropha中，使異丁醇生產(chǎn)途徑取代原有的代謝過程。為構(gòu)建一個以電能為能量輸入的綜合程序，需構(gòu)建一個清除超氧陰離子O2-和NO的生物反應(yīng)器，該反應(yīng)器在特定媒介能夠鑒別甲酸副產(chǎn)品并抑制細胞生長。此綜合流程能夠使異丁醇產(chǎn)量達到100mg/L，3-甲基丁醇產(chǎn)量為50mg/L[31]。通過直接供應(yīng)甲酸，R.eutropha的改造菌株在發(fā)酵罐中培養(yǎng)130h，異丁醇產(chǎn)量達到846 mg/L，3-甲基丁醇產(chǎn)量達到570 mg/L[31]。

1.5 廢棄蛋白質(zhì)類

隨著人口的增長及社會發(fā)展，富含氮磷鉀的動物垃圾和糞便如何處理成了一個巨大的難題，回收利用廢棄蛋白質(zhì)用于生物燃料生產(chǎn)可以成為解決該問題的有效方法。然而，微生物一般利用脂類或糖類轉(zhuǎn)化生物燃料，若以蛋白質(zhì)作為碳源轉(zhuǎn)化生產(chǎn)生物燃料，需要對野生菌株代謝途徑進行改造。HUO Y X等[33]定向改造大腸桿菌后，以蛋白質(zhì)為唯一碳源，高級醇產(chǎn)量406 mg/L，包括異丁醇、2-甲基丁醇、3-甲基丁醇等；進一步破壞氨同化作用途徑中關(guān)鍵基因gdhA和glnA，leuDH，avtA，ilvE，ilvA和sdaB過量表達，此工程改造是使氨基酸代謝得以平衡，最終工程菌利用氨基酸生產(chǎn)高級醇的產(chǎn)量為4 g/L，最大理論產(chǎn)率達到55.7%[33]。其研究同時也證明了以預(yù)先處理過的海藻和細菌生物質(zhì)能為原料生產(chǎn)高級醇，產(chǎn)量為3 g/L。CHOIA K Y等[34]通過滅活B.subtilis中的支鏈氨基酸代謝途徑及敲除脂肪酰轉(zhuǎn)移酶手段，弱化了菌株酮酸脫氫酶和乙醇脫氫酶活性，改造后的菌株可以發(fā)酵多肽生產(chǎn)丁醇、異丁醇等生物燃料。以廢棄蛋白質(zhì)合成高級醇仍是一個相對不成熟的技術(shù)，需要繼續(xù)研究探討商業(yè)化的可行性。

2 提高可替代原料發(fā)酵產(chǎn)丁醇的策略

2.1 發(fā)酵工藝的改進

2.1.1 兩段式發(fā)酵法

兩段式發(fā)酵法是在傳統(tǒng)發(fā)酵的基礎(chǔ)上進一步發(fā)展的一種丁醇發(fā)酵方法，第一步是用厭氧梭菌將底物通過代謝轉(zhuǎn)化為丁酸，第二步將第一步得到的丁酸為底物發(fā)酵生成丁醇。發(fā)酵過程的產(chǎn)酸和產(chǎn)溶劑兩個過程分別在兩個發(fā)酵罐中獨立完成，有效地降低丁醇的毒性，保證發(fā)酵穩(wěn)定連續(xù)的進行。ANGENENT L等[35]將玉米發(fā)酵乙醇的副產(chǎn)物玉米纖維回收后放入沼氣池，與數(shù)千種不同的微生物混合發(fā)酵，將其轉(zhuǎn)化為丁酸，再利用丁酸進行丁醇發(fā)酵，使得丁醇產(chǎn)率大大提高。

2.1.2 固定化發(fā)酵法

固定化發(fā)酵技術(shù)是將微生物固定在載體上進行富集，利用細胞內(nèi)酶來實現(xiàn)酶催化反應(yīng)的，其本身是多酶體系。與傳統(tǒng)發(fā)酵法相比，其具有反應(yīng)速度快，產(chǎn)率高；重復(fù)利用性好，糧耗和能耗少；設(shè)備投資少，控制方便等優(yōu)點。EFREMENKO E等[36]對微藻類進行預(yù)處理，然后將菌株C.acetobutylicumB-1787固定于聚乙烯醇（poly vinyl alcohol，PVA）水凝膠（一種固定細胞的載體）厭氧發(fā)酵，取得了較高的溶劑產(chǎn)率及醇轉(zhuǎn)化率。

2.1.3 四步發(fā)酵法

四步發(fā)酵法由QURESI N等[37]研究開發(fā)，即將生物丁醇生產(chǎn)過程中預(yù)處理、水解、發(fā)酵和回收4個步驟整合，酶和細菌將同時完成各自的任務(wù)。與其他方法相比，生物丁醇的生產(chǎn)能力將比傳統(tǒng)的葡萄糖發(fā)酵方法提高兩倍。

2.1.4 同步糖化發(fā)酵法

同步糖化發(fā)酵法（simulataneous saccharification and fermentation，SSF）是指將糖化和發(fā)酵這兩個不同的工藝過程在同一個生物反應(yīng)器中同時進行。纖維原料水解產(chǎn)物葡萄糖對纖維素酶存在反饋抑制，將纖維素酶對纖維素的水解和產(chǎn)丁醇菌發(fā)酵生成丁醇的過程在同一容器內(nèi)連續(xù)進行，使酶水解產(chǎn)物源源不斷的被產(chǎn)丁醇菌利用，消除了葡萄糖對酶的抑制作用。其優(yōu)點包括[13]：（1）通過轉(zhuǎn)化抑制纖維素酶活性的糖，提高了水解速度，降低了酶的用量；（2）葡萄糖被提前利用產(chǎn)丁醇，反應(yīng)時間較短，丁醇產(chǎn)率高；（3）酶解與發(fā)酵在同一生物反應(yīng)器中進行，降低設(shè)備成本。

2.2 提取工藝的優(yōu)化[38-39]

2.2.1 吸附法

吸附是一種選擇性地從發(fā)酵液中分離丁醇的節(jié)能的方法。在該技術(shù)中，丁醇被吸附到合適的吸附劑表面上，并隨后通過升溫或使用置換器解吸附以產(chǎn)生濃縮丁醇溶液。吸附劑的選擇要考慮吸附率、吸附容量、解吸附的難易程度、所需產(chǎn)物的選擇性和吸附劑成本等。WIEHN M等[40]應(yīng)用膨脹床吸附從ABE發(fā)酵液中吸附分離溶劑，吸附劑為大孔疏水性合成樹脂，經(jīng)過38.5 h得總?cè)軇?0.7 g/L，其中正丁醇27.2 g/L，和傳統(tǒng)的分批發(fā)酵相比，總?cè)軇┊a(chǎn)率提高了2.3倍，正丁醇產(chǎn)率提高2.2倍，運用此技術(shù)丁醇回收率達到81%。LIU D等[41]利用一種生物膜反應(yīng)器結(jié)合KA-I大孔吸附樹脂交聯(lián)聚苯乙烯結(jié)構(gòu)從發(fā)酵液中回收丁醇，溶劑生產(chǎn)率為1.5 g/（L·h），溶劑產(chǎn)量為0.33 g/g，同時也表明KA-I樹脂共吸附大大提高了發(fā)酵性能。

2.2.2 氣提法

氣提是指選擇性去除發(fā)酵液中揮發(fā)性組分的一種分離方法[42]。利用發(fā)酵產(chǎn)氣或者噴射入惰性氣體為載氣，使其在動力作用下進入發(fā)酵體系并帶走有機溶劑，然后冷凝回收，而循環(huán)氣體再次進入反應(yīng)器作為載氣使用，從而達到分離目的。此法經(jīng)濟合理，但會受氣泡大小、流速、消泡劑等因素的影響。SETLHAKU M等[42]用氮氣為載氣的氣提裝置研究C.acetobutylicumATCC 824菌株發(fā)酵性能，在發(fā)酵溫度35 ℃，ABE蒸汽冷凝溫度-2 ℃，氣體循環(huán)速率為4.8～6.6 L/min的條件下，3次分批補料發(fā)酵溶劑含量達到72.9 g/L。

2.2.3 液-液萃取

液-液萃取是利用萃取劑提取溶解在一定溶劑混合液中特定物質(zhì)的分離方法。采用萃取和發(fā)酵相結(jié)合，將代謝產(chǎn)物從發(fā)酵液中萃取分離出來，減輕或消除產(chǎn)物抑制，從而提高丁醇產(chǎn)率。優(yōu)良的萃取劑是高效提取的關(guān)鍵。KURKIJARVI A等[43]以汽油為萃取劑，采用雙抽提對ABE發(fā)酵液進行萃取，此法為兩列萃取柱，第一列萃取出抑制微生物生長的ABE溶劑，第二列則對有毒溶劑萃取以使發(fā)酵液利于菌株生長，并使未利用的發(fā)酵液得到重新利用，固定和過濾能有效的避免菌種進入萃取柱，過程中代謝物的混合物也被用于汽油添加劑。該研究亦表明乙基叔丁基醚和甲基叔丁基醚為萃取丁醇最有效的萃取劑。

2.2.4 反滲透

反滲透是一種普遍應(yīng)用于水的淡化和飲用水凈化的技術(shù)，同樣此技術(shù)也可用于產(chǎn)物的分離。在分離丁醇中聚酰胺膜被認為是最好的半透膜。DILTZ R A等[44]利用反滲透法處理厭氧發(fā)酵液，用乙醇、丁醇、丁酸、乳酸、乙二酸和乙酸6種化合物為實驗品，其中丁酸、乳酸和丁醇在5 515.8 kPa下反滲效率高于99%，而乙酸，乙醇和乙二酸反滲效率為79%～92%，與單一成分反滲透相比，以發(fā)酵液為進料能提高有機成分的滯留量。

2.2.5 膜蒸餾

膜蒸餾是一種利用微孔疏水膜在不同溫度下進行溶液分離的過程。膜蒸餾過程類似于常規(guī)蒸餾，需要對發(fā)酵液加熱，以獲得欲分離物的汽化熱度。膜蒸餾基于蒸汽/液體平衡[45]。

2.2.6 滲透蒸發(fā)

滲透蒸發(fā)是一種利用膜分離技術(shù)分離液體混合物的方法。此法根據(jù)液體混合物中組分溶解與擴散性能不同，在膜兩側(cè)組分的蒸汽分壓差作用下，對液體混合物進行部分蒸發(fā)，從而達到分離的目的。滲透蒸發(fā)技術(shù)的關(guān)鍵是選擇合適的膜，以期達到最佳的分離效果。SHIN C等[46]在利用C.acetobutylicum發(fā)酵分離丁醇中，以十二烷基硫酸鈉凝膠膜（sodium dodecyl sulfate，SDS）和二甲基硅氧烷（polydimethylsiloxane，PDMS）作對比，結(jié)果發(fā)現(xiàn)前者明顯優(yōu)于后者，速率由0.45 g/（L·h）提高到0.66 g/（L·h），最高達到0.94 g/（L·h）。KUJAWA J等[47]通過對丁醇水溶液滲透蒸發(fā)提取，探究了氧化鋁和氧化鈦陶瓷膜的表面疏水性能，對膜表面修飾，使膜改性，改性后的膜由親水性變?yōu)槭杷?，改性膜能選擇性地從丁醇水溶液中分離丁醇（分離系數(shù)為2）。

2.3 工程菌株的改良

利用基因工程和代謝工程技術(shù)，解除代謝過程中可能存在的產(chǎn)物或者中間產(chǎn)物的抑制，提高菌種對丁醇的耐受性，強化丁醇生產(chǎn)中的關(guān)鍵酶，切斷丙酮、乙醇的生成代謝途徑，提高丁醇在溶劑中的比例。菌株改良途徑可分為以下3個水平：

第一為單基因水平，即酶蛋白的表達，對生物元件（包括酶蛋白和啟動子等）特性的理解還不夠深入，重組蛋白表達的技術(shù)如基因拷貝數(shù)的修飾，密碼子的優(yōu)化，啟動子的選擇，核糖體的結(jié)合位點等都是異源途徑的功能性表達的重要考慮因素。BOKINSKY G等[48]將纖維素酶、半纖維素酶、木聚糖酶、β-糖苷水解酶、木糖酶等相關(guān)基因?qū)氪竽c桿菌中并成功表達，發(fā)酵秸稈處理液丁醇產(chǎn)量達到28 mg/L。成功實現(xiàn)利用基因工程技術(shù)改造菌株E.coil合成生物丁醇。

第二為通路水平，即通過減少毒副作用途徑來優(yōu)化過程，破壞競爭過程，提高底物和輔助因子的有效性。TING C N W等[49]經(jīng)特定篩選得到一菌株屎腸球菌（Enterococcus faeciumIB1），此菌為兼性厭氧型，并在厭氧條件下產(chǎn)丁醇等溶劑，丁醇耐受性高達2.5%～3%，異丁醇耐受性高達3%，乙醇耐受性高達10%，從而有效降低了丁醇生產(chǎn)過程的毒副作用。此外，要提高異源途徑的性能，驅(qū)動力也是不可或缺的，脫羧反應(yīng)、產(chǎn)物的分離和反應(yīng)不可逆等驅(qū)動力有利于產(chǎn)物的形成。

第三為系統(tǒng)水平，也是最深層次的菌株改良過程，需要系統(tǒng)分析的高通量技術(shù)，用于確定不明顯的競爭途徑和超表達的相關(guān)酶的“組學(xué)”技術(shù)和芯片模型。基因組重建模型已經(jīng)在許多工業(yè)微生物中得到開發(fā)，GAO X F等[50]采用基因組改組技術(shù)，以高鏈霉素、2-脫氧-D-葡萄糖和丁醇抗性突變株為親本，經(jīng)兩輪的原生質(zhì)體融合，經(jīng)特定篩選獲得一株高產(chǎn)丁醇菌株F2-GA，溶劑產(chǎn)量提高34.28%，丁醇產(chǎn)量為14.15 g/L，占總?cè)軇┊a(chǎn)量的63.71%。

3 展望

隨著石油資源的不斷減少和環(huán)境問題的日趨惡化，纖維素材料、合成氣、CO2、廢棄蛋白質(zhì)等可替代原料發(fā)酵產(chǎn)生物丁醇受到更加廣泛的關(guān)注與應(yīng)用。這些廢棄資源的利用能有效地解決能源、環(huán)境問題和廢物管理問題。然而可替代資源先進的燃料生產(chǎn)開發(fā)還處在一個探索階段，除了木質(zhì)纖維素外，其它資源尚未得到廣泛研究。在進行可替代原料生產(chǎn)丁醇研究過程中，現(xiàn)有用于研究菌種的生物丁醇合成能力低下、溶劑耐受力弱，可以考慮發(fā)掘新型生產(chǎn)菌株，尋找耐性更強的菌株，綜合應(yīng)用應(yīng)用基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白組學(xué)、代謝組學(xué)及生物信息學(xué)等先進分子生物學(xué)技術(shù)手段，構(gòu)建發(fā)酵時間短，溶劑耐受力強，丁醇產(chǎn)量高的菌株；同時進一步開發(fā)經(jīng)濟適用的原材料預(yù)處理工藝、改善發(fā)酵方式、優(yōu)化溶劑提取工藝，降低成本。相信隨著丁醇高新技術(shù)研發(fā)的突破與應(yīng)用，在不久的將來可再生的替代原料生物發(fā)酵產(chǎn)丁醇發(fā)酵會得到更全面發(fā)展。

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