王浩　何義舟　羅哲

(復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院麻醉科，上?！?00032)

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·論著·

丙酮酸乙酯對肝細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷的保護(hù)作用及其機(jī)制研究

王浩何義舟羅哲

(復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院麻醉科，上海200032)

摘要目的：探討丙酮酸乙酯在肝細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷中的作用及機(jī)制。方法：通過對人肝細(xì)胞系L-02進(jìn)行缺氧/復(fù)氧處理各1 h建立氧化應(yīng)激損傷模型。將L-02根據(jù)干預(yù)措施分為對照組(Control組)、乳酸鈉林格液組(LR組)、丙酮酸乙酯組(EP組)。應(yīng)用日本日立公司7020 全自動分析儀檢測細(xì)胞培養(yǎng)上清液中天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(aspartate aminotransferase，AST)和丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(alanine aminotransferase，ALT)濃度；采用Hoechst 33342/碘化丙啶雙標(biāo)記熒光染色以及原位缺口末端標(biāo)記法(TUNEL)檢測各組細(xì)胞的凋亡和壞死情況；采用蛋白質(zhì)印跡(Western blotting)法檢測各組caspase-9、caspase-3與多聚二磷酸腺苷核糖聚合酶(PARP)蛋白的表達(dá)；采用熒光素發(fā)光法測量各組肝細(xì)胞內(nèi)ATP濃度。結(jié)果：EP組細(xì)胞培養(yǎng)上清液中AST和ALT濃度均低于Control組和LR組(P<0.05)；EP組壞死細(xì)胞比例低于Control組和LR組(P<0.05)，但凋亡細(xì)胞比例高于Control組和LR組(P<0.05)。EP組活化形式的caspase-9、caspase-3與PARP蛋白表達(dá)水平高于Control組和LR組(P<0.05)。EP組細(xì)胞內(nèi)ATP濃度顯著高于Control組和LR組(P<0.05)。結(jié)論：EP對肝細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷有保護(hù)作用，能減少壞死細(xì)胞數(shù)量，增加凋亡細(xì)胞數(shù)量，改變壞死及凋亡細(xì)胞比例。EP的細(xì)胞保護(hù)作用機(jī)制可能在于改善能量代謝，提高細(xì)胞內(nèi)ATP濃度，激活“凋亡/壞死共同通路”，激活凋亡過程。

關(guān)鍵詞氧化應(yīng)激損傷；壞死；凋亡；丙酮酸乙酯

肝臟的缺血再灌注損傷(ischemia-reperfusion injury，IRI)的致病機(jī)制主要有：Kupffer細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞的活化、氧自由基富集、鈣超載、炎性介質(zhì)活性增加和線粒體功能失常等[1-6]。目前對IRI的主要干預(yù)措施是采用自由基清除劑、血紅素氧化酶、缺血預(yù)處理與后處理、熱休克蛋白等。然而，大多數(shù)干預(yù)措施尚處于實(shí)驗(yàn)階段，可供臨床應(yīng)用的IRI預(yù)防和治療措施有限。

丙酮酸既是糖酵解的終末產(chǎn)物，又是三羧酸循環(huán)(tricarboxylic acid cycle，TCA)的起始底物，還具備清除細(xì)胞內(nèi)活化氧自由基(reactive oxygen species，ROS)H2O2和OH-的作用[3]。然而，丙酮酸水溶液極其不穩(wěn)定，易生成副丙酮酸(parapyruvate)，該物質(zhì)是TCA的抑制劑，從而影響了丙酮酸在臨床上的應(yīng)用。酯化后的丙酮酸，即丙酮酸乙酯(ethyl pyruvate，EP)，克服了丙酮酸水溶液不穩(wěn)定的缺點(diǎn)，還具備丙酮酸的抗氧化作用，成為近年來研究較多的細(xì)胞保護(hù)物質(zhì)[4]。多項(xiàng)研究[5-6]指出，EP在出血性休克、膿毒血癥、燒傷、急性胰腺炎、放射性損傷和腦IRI等損傷中發(fā)揮細(xì)胞保護(hù)作用。研究[7-8]證實(shí)，EP可通過多環(huán)節(jié)、多通路發(fā)揮細(xì)胞保護(hù)作用，主要包括抑制氧化還原反應(yīng)、清除氧自由基和抑制核因子κB(nuclear factor κB，NF-κB)或JAK/STAT等相關(guān)的炎性反應(yīng)通路。EP作為新一代晶體復(fù)蘇液體中陰離子的重要組成成分，替代了臨床常用的乳酸鈉林格液。但目前研究尚未驗(yàn)證EP對肝細(xì)胞的保護(hù)作用。因此，本研究將EP應(yīng)用于肝臟L-02細(xì)胞缺氧/復(fù)氧損傷模型中，研究EP對肝臟氧化應(yīng)激損傷的保護(hù)作用及可能的機(jī)制。

1資料與方法

1.1材料無糖及含糖RPMI-1640培養(yǎng)液(含糖RPMI-1640培養(yǎng)液與無糖培養(yǎng)液按1∶80體積比混勻得低糖培養(yǎng)液)、0.25%胰蛋白酶購自美國Invitrogen公司；特級胎牛血清購自美國Hyclone公司；缺氧裝置購自美國Billups-Rothenberg 公司；“95% N2+5% CO2”混合氣體與“95% O2+5% CO2”混合氣體購自中國科學(xué)院上海有機(jī)化學(xué)研究所；EP、Hoechst33342(HO)與碘化丙啶(propidium iodide，PI)購自美國Sigma公司；原位缺口末端標(biāo)記法(TUNEL)凋亡檢測試劑盒購自瑞士羅氏公司；caspase-3、caspase-9、多聚二磷酸腺苷核糖聚合酶(PARP)抗體購自美國CST公司；ATP檢測試劑盒與丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(alanine aminotransferase，ALT)/天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(aspartate aminotransferase，AST)檢測試劑盒購自江蘇南京建成生物工程研究所。

1.2細(xì)胞培養(yǎng)與處理人肝細(xì)胞系L-02由復(fù)旦大學(xué)肝癌研究所提供。用添加胎牛血清的 RPMI-1640 培養(yǎng)液在37 ℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%、95%濕度條件下培養(yǎng)。

缺氧/復(fù)氧模型的建立：將細(xì)胞置入無血清低糖RPMI-1640培養(yǎng)液，并放入缺氧裝置，充入95% N2+5% CO2混合氣體，經(jīng)出氣口水封管溢出，使容器內(nèi)保持缺氧狀態(tài)，5 min后關(guān)閉進(jìn)出口，使容器內(nèi)氧濃度<0.5%。再將容器放入37 ℃恒溫箱中，缺氧1 h。然后更換含血清含糖RPMI-1640培養(yǎng)液，以 5 L/min 流量在進(jìn)氣口通入95% O2+5% CO2混合氣體，予復(fù)氧處理1 h。

分組：根據(jù)干預(yù)措施分為空白對照組(Control組)、乳酸鈉林格液組(LR組)、EP組，每組3個復(fù)孔。Control組：更換無血清低糖RPMI-1640培養(yǎng)液時不給予任何干預(yù)；EP組：更換無血清低糖RPMI-1640培養(yǎng)液時加入EP，終濃度為2 mmol/L；LR組：更換無血清低糖 RPMI-1640 培養(yǎng)液時加入等同EP組EP體積的乳酸鈉林格液。造模后收取各組細(xì)胞進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。

1.3HO/PI雙標(biāo)記熒光染色檢測細(xì)胞壞死胰蛋白酶消化細(xì)胞后，加入1 mg/mL Hoechst33342染色液20 μL，終濃度為10 μg/mL，37 ℃反應(yīng) 10 min；繼續(xù)加入1 mg/mL PI染色液20 μL，終濃度為10 μg/mL，4 ℃反應(yīng)20 min；將上述細(xì)胞懸液滴加在載玻片上，涂抹均勻后于熒光顯微鏡(日本 Olympus公司)下觀察并拍照。

1.4TUNEL法檢測細(xì)胞凋亡細(xì)胞凋亡檢測操作流程按照TUNEL試劑盒說明書進(jìn)行。

1.5蛋白質(zhì)印跡(Western blotting)法檢測caspase-9、caspase-3、PARP蛋白的表達(dá)裂解細(xì)胞總蛋白后經(jīng)12%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離、轉(zhuǎn)膜。5%脫脂牛奶封閉1 h，加入caspase-9、caspase-3與PARP多克隆抗體(1∶1000稀釋)，一抗4 ℃孵育過夜。加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠或兔IgG 抗體(1∶2000稀釋)后室溫孵育1 h。采用電化學(xué)發(fā)光法進(jìn)行化學(xué)發(fā)光并用X光膠片記錄條帶，通過灰度分析條帶的光密度。

1.6ALT和AST濃度測定取細(xì)胞培養(yǎng)上清液1 mL，1000 r/min離心10 min，吸取上清液；取50 μL上清液，用HITACHI 7020 全自動分析儀(日本日立公司)檢測ALT和AST的濃度。

1.7ATP濃度的檢測收取1×106細(xì)胞，4000 r/min 離心10 min，取上清液并測定ATP的濃度，具體操作步驟參考試劑盒說明書。

2結(jié)果

2.13組肝細(xì)胞缺氧/復(fù)氧后細(xì)胞培養(yǎng)上清液中AST、ALT氨酶濃度的比較EP組細(xì)胞培養(yǎng)上清液中AST和ALT濃度均低于LR組和Control組(P<0.05)，見圖1。

2.23組肝細(xì)胞缺氧/復(fù)氧后壞死及凋亡細(xì)胞比例的變化EP組“HO+/PI-”活細(xì)胞比例高于Control組與LR組(P<0.05)；EP組“HO+/PI+”壞死細(xì)胞比例低于Control組與LR組(P<0.05)，見圖2A；EP組TUNEL+的凋亡細(xì)胞比例高于Control組與LR組(P<0.05)，見圖2B。

與Control組及LR組比較，*P<0.05

A：HO/PI雙染色法，與Control組及LR組比較，*P<0.05；B：TUNEL法

A：Western blotting(內(nèi)參照GAPDH：甘油醛-3-磷酸脫氫酶)；B：活化形式的caspase-3、caspase-9與PARP條帶的相對灰度值；與Control組及LR組比較，*P<0.05

圖33組肝細(xì)胞缺氧/復(fù)氧后凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)水平的比較

2.43組肝細(xì)胞缺氧/復(fù)氧后肝細(xì)胞內(nèi)ATP濃度的比較EP組細(xì)胞內(nèi)ATP濃度為(3.48±0.5)μmol/g，顯著高于Control組與LR組[分別為(1.78±0.3)μmol/g和(1.73±0.4)μmol/g]，P<0.05。

3討論

Sims等[9]首先將丙酮酸的酯化衍生物EP應(yīng)用于腸系膜IRI的動物模型中，發(fā)現(xiàn)EP可以緩解小腸黏膜結(jié)構(gòu)和功能的損傷，而且優(yōu)于等當(dāng)量的丙酮酸鈉溶液。本研究在肝臟L-02細(xì)胞體外缺氧/復(fù)氧損傷模型中發(fā)現(xiàn)，EP干預(yù)后可導(dǎo)致細(xì)胞上清液中AST和ALT濃度明顯下降，提示EP對于肝臟細(xì)胞缺氧/復(fù)氧損傷有保護(hù)作用。EP的細(xì)胞保護(hù)作用機(jī)制主要包括自由基清除作用和抗炎作用[10]。EP的自由基清除作用與其α-酮羧基的結(jié)構(gòu)有關(guān)，在對EP的早期研究(如失血性休克、急性腎功能衰竭或腸系膜IRI的模型研究)中均強(qiáng)調(diào)了自由基清除作用；而且近期一項(xiàng)研究[11]報(bào)道稱，在IRI的動物模型實(shí)驗(yàn)中，EP較其他含α-酮羧基的物質(zhì)具有更顯著的細(xì)胞保護(hù)作用，這與其親脂特性有關(guān)。Yang等[6]最早在出血性休克的動物模型中證實(shí)了EP的抗炎作用，它能夠降低NF-κB等炎性因子的表達(dá)。隨后的研究[12]證實(shí)了EP可以下調(diào)各種炎性信號分子的表達(dá)，包括JNK和MAPK等。自由基被認(rèn)為是炎性反應(yīng)第二信號，調(diào)節(jié)下游的炎性介質(zhì)，包括NF-κB、腫瘤壞死因子等。進(jìn)一步的研究[13-14]提示，EP通過作用于NF-κB的p65亞基而調(diào)節(jié)NF-κB的作用，降低相關(guān)炎性因子的水平。因此，EP的自由基清除特性也是其抗炎作用的重要機(jī)制。

本研究發(fā)現(xiàn)，EP干預(yù)的肝臟L-02細(xì)胞缺氧/復(fù)氧損傷表現(xiàn)為壞死細(xì)胞數(shù)量下降、凋亡細(xì)胞數(shù)量增加，凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)增加。雖然凋亡和壞死都屬細(xì)胞死亡，但不同的細(xì)胞死亡方式對其結(jié)局有著不同的意義。一項(xiàng)有關(guān)肺癌細(xì)胞的體外研究[15]提示，無糖狀況下，EP可以減少細(xì)胞壞死，同時刺激凋亡通路，使細(xì)胞凋亡增多，與本研究結(jié)果相一致。

根據(jù)“壞死/凋亡學(xué)說”，細(xì)胞內(nèi)ATP濃度決定細(xì)胞以何種方式死亡。ATP是細(xì)胞發(fā)生凋亡的必要的能量物質(zhì)，當(dāng)ATP明顯缺失時，凋亡通路將被抑制，而轉(zhuǎn)向壞死。當(dāng)細(xì)胞內(nèi)ATP達(dá)到正常值的10%～15%時，即可激活caspase-9和caspase-3依賴的凋亡通路[2]。有研究[16]提示，應(yīng)用果糖提高IRI肝細(xì)胞內(nèi)ATP水平后，能減少細(xì)胞死亡，增加凋亡。本研究也發(fā)現(xiàn)，EP組肝細(xì)胞內(nèi)的ATP濃度高于對照組和LR組。EP可自由進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，并分解為丙酮酸，在后者轉(zhuǎn)變?yōu)槿樗岬耐瑫r，使得NADH轉(zhuǎn)化為NAD+，進(jìn)而提高NAD+/NADH比例水平，有助于糖酵解；EP作為ATP生成的前體物質(zhì)，可促進(jìn)TCA，提高細(xì)胞內(nèi)ATP水平。目前在胰島細(xì)胞、心肌細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞等的研究[17-19]中，均證實(shí)了EP可以提高細(xì)胞內(nèi)ATP的濃度。

綜上所述，本研究通過體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)EP對肝臟L-02細(xì)胞缺氧/復(fù)氧損傷有保護(hù)作用。EP可能通過提高細(xì)胞內(nèi)ATP的濃度而影響“凋亡/壞死共同通路”，激活凋亡過程、減少壞死細(xì)胞，進(jìn)而降低內(nèi)源性損傷物質(zhì)的表達(dá)，減輕炎性反應(yīng)，起到細(xì)胞保護(hù)作用。

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Mechanism of Protection of Ethyl Pyruvate against Oxidative Stress Injury in Hepatocytes

WANGHaoHEYizhouLUOZhe

DepartmentofAnesthesiology,ZhongshanHospital,FudanUniversity,Shanghai200032,China

AbstractObjective： To investigate the protective effect of ethyl pyruvate on oxidative stress injury in hepatocytes and its underlying molecular mechanism. Methods： Hypoxia/reoxygenation-induced oxidative stress injury model was performed with 1 h hypoxia followed by 1 h reoxygenation.According to the different interventions, L-02 hepatocytes were divided into control group(Con group),lactate Ringer’s group(LR group) and ethyl pyruvate group(EP group). The concentrations of aspartate aminotransferase(AST) and alanine aminotransferase(ALT) in supernatants of cell culture medium were measured by Hitachi 7020 Automatic Analyzer (Hitachi, Tokyo, Japan). The percentages of necrotic cells and apoptotic cells were examined by Hoechst 33342/propidium iodide (PI) and TdT-mediated dUTP nick end labeling(TUNEL) staining. The expression levels of caspase-9, caspase-3 and poly (ADP-ribose) polymerase (PARP) were determined by Western blotting.The concentrations of ATP in hepatocytes were measured by using luciferase luminescence method. Results： The concentrations of AST and ALT in EP group were lower than that in Con group and LR group(P<0.05). The percentage of necrotic cells was lower and the percentage of apoptotic cells was higher in EP group than those in Con group and LR group(P<0.05). The expression levels of cleaved caspase-9, caspase-3 and PARP in EP group were higher than that in Con group and LR group(P<0.05). The concentration of ATP in EP group was higher than that in Con group and LR group(P<0.05). Conclusions： Ethyl pyruvate can decrease the percentage of necrotic cells but increased the percentage of apoptotic cells in hepatocytes insulted by hypoxia/reoxygenation.Ethyl pyruvate may protect hepatocytes against oxidative stress injury through up-regulating the intracellular ATP levels and consequently skewing the necrosis-apoptosis pathway.

Key WordsOxidative stress injury；Necrosis；Apoptosis；Ethyl pyruvate

中圖分類號R363

文獻(xiàn)標(biāo)識碼A