沈佳佳　黃瑛　祁煒罡　談晶花　張代富

(上海市浦東新區(qū)人民醫(yī)院心內(nèi)科，上?！?01200)

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白藜蘆醇通過促進(jìn)自噬減輕糖尿病大鼠心肌缺血再灌注損傷的實(shí)驗(yàn)研究

沈佳佳△黃瑛△祁煒罡談晶花張代富

(上海市浦東新區(qū)人民醫(yī)院心內(nèi)科，上海201200)

摘要目的：探討白藜蘆醇減輕糖尿病大鼠心肌缺血再灌注損傷的保護(hù)機(jī)制及其對心肌細(xì)胞自噬的影響。方法：用鏈脲佐菌素(Streptozotocin，STZ)誘導(dǎo)建立糖尿病大鼠模型，選取35只糖尿病造模成功大鼠，隨機(jī)分為假手術(shù)組、白藜蘆醇未手術(shù)組、缺血再灌注損傷模型組、白藜蘆醇治療組、白藜蘆醇+胰島素聯(lián)合治療組，每組各7只。通過結(jié)扎-放松左冠狀動脈制備缺血再灌注損傷模型。通過亞甲藍(lán)染色觀察心肌梗死面積變化；在透射電鏡下觀察自噬泡；采用蛋白質(zhì)印跡(Western blotting)法檢測微管相關(guān)蛋白1輕鏈3(microtubule-associated protein 1 light chain 3，LC3)Ⅰ和Ⅱ、自噬相關(guān)基因5(autophagy related gene 5，Atg5)、Beclin-1的表達(dá)水平及腺苷酸活化蛋白激酶(AMP-activated protein kinase，AMPK)和雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)的表達(dá)及磷酸化水平。結(jié)果：白藜蘆醇治療組與白藜蘆醇+胰島素聯(lián)合治療組心肌梗死面積顯著小于缺血再灌注損傷模型組(P<0.05)。電鏡結(jié)果顯示，白藜蘆醇治療與白藜蘆醇+胰島素聯(lián)合治療可促進(jìn)糖尿病大鼠缺血再灌注損傷心肌細(xì)胞的自噬，改善心肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)。缺血再灌注損傷模型組大鼠心肌細(xì)胞中LC3-Ⅱ、Atg5、Beclin-1表達(dá)水平較假手術(shù)組顯著降低(P<0.05)，而LC3-Ⅰ表達(dá)水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；白藜蘆醇治療組及白藜蘆醇+胰島素聯(lián)合治療組Atg5、Beclin-1表達(dá)水平均顯著高于缺血再灌注損傷模型組，且白藜蘆醇+胰島素聯(lián)合治療組Beclin-1表達(dá)水平高于白藜蘆醇治療組(P<0.05)；各組之間mTOR、AMPK表達(dá)水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，但白藜蘆醇治療組及白藜蘆醇+胰島素聯(lián)合治療組AMPK磷酸化水平顯著高于缺血再灌注損傷模型組，而mTOR磷酸化水平則顯著低于缺血再灌注損傷模型組(P<0.05)。結(jié)論：白藜蘆醇可能通過激活A(yù)MPK、抑制mTOR通路，上調(diào)LC3-Ⅱ、Atg5、Beclin-1的表達(dá)，促進(jìn)自噬，抑制缺血再灌注損傷，減少心肌梗死面積，從而保護(hù)糖尿病大鼠心肌細(xì)胞。

關(guān)鍵詞白藜蘆醇；糖尿病模型；缺血再灌注損傷模型；自噬；大鼠

糖尿病是心血管疾病的獨(dú)立危險(xiǎn)因子，超過50%的糖尿病患者死于血管并發(fā)癥[1]。目前，關(guān)于強(qiáng)化血糖控制對糖尿病大血管并發(fā)癥的影響，各研究[2-4]結(jié)果不一，這是因?yàn)樘悄虿『喜⒀懿∽儤O具復(fù)雜性，與高血糖、高血壓、高血脂、血液高凝狀態(tài)、炎性反應(yīng)等多種因素均有關(guān)，所以單純控制血糖并不能從根本上降低血管事件的發(fā)生率。

白藜蘆醇是一種非黃酮類的酚類物質(zhì)，天然的白藜蘆醇在很多植物中存在，這是植物為了抵御病菌入侵而產(chǎn)生的一種抗毒素。流行病學(xué)研究[5]發(fā)現(xiàn)，法國人常食牛排、奶酪等高膽固醇食品，但是其心血管病發(fā)病率僅為美國人的1/3，這歸因于美法兩國飲食習(xí)慣不同，法國人葡萄酒攝入量高。葡萄酒中所含大量的白藜蘆醇可能對心血管病具有保護(hù)作用。白藜蘆醇有抗癌、抗心血管疾病、抗糖尿病等作用。最近研究[6-7]發(fā)現(xiàn)，小劑量白藜蘆醇能調(diào)節(jié)自噬，增強(qiáng)細(xì)胞存活信號，幫助細(xì)胞在損傷中復(fù)原，從而保護(hù)心肌。本研究旨在明確白藜蘆醇對糖尿病大鼠缺血再灌注損傷(ischemia-reperfusion injury，I/R)的保護(hù)機(jī)制及其對心肌細(xì)胞自噬的影響，并探討其內(nèi)在機(jī)制，以期為臨床研究提供依據(jù)。

1資料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動物及糖尿病模型的制備選取6～8周齡、體質(zhì)量160～200 g的雄性SD大鼠45只(購自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動物有限公司)，飼養(yǎng)在(26±2)℃空調(diào)房內(nèi)，濕度60%～80%，2～3 d換1次墊料，分籠飼養(yǎng)，給予符合上海市衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)的飲用水，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周。實(shí)驗(yàn)前1 d禁食、不禁水，禁食時間不少于14 h。實(shí)驗(yàn)當(dāng)天，將鏈脲佐菌素(Streptozotocin，STZ；美國Sigma公司)用0.1 mol/L、pH 4.2 的檸檬酸鈉緩沖液在冰浴中溶解，根據(jù)大鼠的體質(zhì)量單次腹腔注射STZ溶液65 mg/kg。全部大鼠注射STZ溶液后，繼續(xù)禁食1 h，然后喂飼料，保持飲水充足。給藥后10 d內(nèi)，動物逐漸消瘦，狀態(tài)變差，精神萎靡，皮毛聳立，出現(xiàn)多飲、多食、多尿等1型糖尿病的表現(xiàn)，空腹血糖值>16.7 mmol/L。10 d后造模成功，造模成功率超過80%。

1.2實(shí)驗(yàn)動物分組及處理選取35只糖尿病造模成功大鼠，每日監(jiān)測血糖。將這35只大鼠隨機(jī)分為5組，每組7只，分別為假手術(shù)組(sham組，不給藥，模擬手術(shù)狀態(tài)，但不結(jié)扎冠狀動脈)、白藜蘆醇未手術(shù)組[Resveratrol組，白藜蘆醇(購自上海恒遠(yuǎn)生物技術(shù)公司)2.5 mg/(kg·d)，飼養(yǎng)10 d，模擬手術(shù)狀態(tài)，但不結(jié)扎冠狀動脈]、缺血再灌注損傷模型組(I/R組，不給藥，手術(shù)結(jié)扎冠狀動脈30 min，再灌注120 min)、白藜蘆醇治療組[I/R+Resveratrol組，白藜蘆醇2.5 mg/(kg·d)，飼養(yǎng)10 d，手術(shù)結(jié)扎冠狀動脈]、白藜蘆醇+胰島素聯(lián)合治療組[I/RI+Resveratrol組，白藜蘆醇2.5 mg/(kg·d)，飼養(yǎng)10 d，皮下注射胰島素4 U/d，手術(shù)結(jié)扎冠狀動脈30 min，再灌注120 min]。白藜蘆醇的給藥方法為：溶于0.9%氯化鈉液后灌胃。手術(shù)結(jié)扎冠狀動脈30 min后，取心肌組織、切片，用0.9%氯化鈉液沖洗干凈后在0.3%亞甲藍(lán)染液中浸泡20 min，再用0.9%氯化鈉液沖洗。染色后正常組織呈藍(lán)色，梗死部位呈白色。用圖形分析軟件計(jì)算梗死面積。應(yīng)用透射電鏡觀察各組梗死區(qū)、非梗死區(qū)、梗死邊緣區(qū)的自噬泡。具體參考文獻(xiàn)[8]。

1.3蛋白質(zhì)印跡(Western blotting)法檢測自噬相關(guān)蛋白的表達(dá)與腺苷酸活化蛋白激酶(AMP-activated protein kinase，AMPK)、雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)的表達(dá)及其磷酸化水平各組取等量總蛋白行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，濕轉(zhuǎn)(電流400 mA，2 h)至聚偏氟乙烯膜，將膜浸入封閉液[在Tris-鹽酸緩沖液(TBST)中加入脫脂奶粉，至最終的質(zhì)量體積濃度為5%]，室溫下振蕩1 h。加入稀釋好的一抗抗體[微管相關(guān)蛋白1輕鏈3(microtubule-associated protein 1 light chain 3, LC3)-Ⅰ與LC3-Ⅱ抗體，均為1∶1000，購自德國Merck Millipore公司；自噬相關(guān)基因5(autophagy related gene 5, Atg5)抗體，1∶1000，購自英國Abcam公司；Beclin抗體，1∶1000，購自英國Abcam公司；AMPK、mTOR及其磷酸化抗體稀釋度均為1∶1000，購自美國Santa Cruz公司]， 4 ℃過夜。TBST洗膜3次(每次5 min)。加入稀釋好的二抗抗體(1∶5000)，室溫1 h振蕩孵育。在電化學(xué)發(fā)光分析儀上進(jìn)行電化學(xué)發(fā)光，于暗室壓X光底片曝光，顯影、定影，水洗膠片并晾干后保存。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，組間比較采用單因素方差分析。以P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1白藜蘆醇對糖尿病大鼠心肌梗死面積的影響相對于I/R組，I/R+Resveratrol組與I/RI+Resveratrol組大鼠的心肌梗死面積均縮小(P<0.05)，見圖1。

2.2白藜蘆醇對糖尿病大鼠I/R中自噬泡的影響透射電鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，sham組與Resveratrol組心肌細(xì)胞核膜完整，核質(zhì)分布均勻，染色較淡，呈細(xì)粒分散狀，胞漿內(nèi)線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等細(xì)胞器結(jié)構(gòu)完整，線粒體嵴清楚，存在少量自噬泡。而I/R組心肌細(xì)胞收縮，染色質(zhì)縮合成塊狀，有的線粒體輕度腫脹、部分空泡化，無自噬泡存在；I/R+Resveratrol組心肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)較I/R組得到改善，核質(zhì)內(nèi)部分細(xì)胞器結(jié)構(gòu)少量修復(fù)，可見少量自噬泡存在；I/RI+Resveratrol組心肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)較I/R組改善明顯，線粒體等細(xì)胞器膜結(jié)構(gòu)清晰，亦可見少量自噬泡存在。見圖2。

與I/R組比較，*P<0.05

圖1各組大鼠心肌梗死面積的比較

圖2　透射電鏡下觀察心肌細(xì)胞的自噬泡 (標(biāo)尺=0.5 μm；箭頭指示為自噬泡)

2.3白藜蘆醇對糖尿病大鼠I/R中自噬相關(guān)蛋白的表達(dá)以及mTOR、AMPK的表達(dá)和磷酸化的影響與Sham組比較，I/R組大鼠心肌細(xì)胞中LC3-Ⅱ、Atg5、Beclin-1表達(dá)水平明顯降低(P<0.05)，LC3-Ⅰ的表達(dá)水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；I/R+Resveratrol組及I/RI+Resveratrol組Atg5、Beclin-1表達(dá)水平顯著高于I/R組，且I/RI+Resveratrol組Beclin-1表達(dá)水平高于I/R+Resveratrol組。此外，各組間mTOR、AMPK表達(dá)水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，I/R+Resveratrol組及I/RI+Resveratrol組p-AMPK表達(dá)水平顯著高于I/R組，而p-mTOR表達(dá)水平則顯著低于I/R組。見圖3。

與Sham組比較，*P<0.05；與I/R組比較，#P<0.05

圖3各組大鼠心肌組織中自噬相關(guān)蛋白的表達(dá)及AMPK、mTOR的表達(dá)及其磷酸化水平的檢測

[內(nèi)參照為甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)]

3討論

自噬是指細(xì)胞通過單層或雙層膜包裹細(xì)胞質(zhì)中的大分子物質(zhì)(比如蛋白質(zhì)、RNA、糖原等)和一些細(xì)胞的內(nèi)源性底物(包括由于生理或病理原因引起的衰老、破損的細(xì)胞器)而形成自噬體，再轉(zhuǎn)運(yùn)到溶酶體形成自噬溶酶體進(jìn)而被降解利用的過程。在應(yīng)激、營養(yǎng)缺乏、低氧狀態(tài)下，自噬降解的分子和細(xì)胞器可為細(xì)胞內(nèi)提供能量和合成蛋白質(zhì)的氨基酸，是營養(yǎng)缺乏狀態(tài)下的一種保護(hù)機(jī)制。近期研究[6-7]發(fā)現(xiàn)，白藜蘆醇能調(diào)節(jié)自噬，增強(qiáng)細(xì)胞存活信號，幫助細(xì)胞在損傷中復(fù)原，從而保護(hù)心肌。本研究結(jié)果顯示，I/R+Resveratrol組及I/RI+Resveratrol組心肌梗死面積都較I/R組顯著減小。電鏡結(jié)果也顯示，I/R+Resveratrol組及I/RI+Resveratrol組心肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)較I/R組改善，核質(zhì)內(nèi)部分細(xì)胞器結(jié)構(gòu)得到修復(fù)，2組心肌細(xì)胞內(nèi)均可見少量自噬泡。這表明，白藜蘆醇能上調(diào)自噬，減輕糖尿病大鼠I/R，減少心肌梗死面積，保護(hù)心肌。

自噬的啟動依賴于一系列自噬相關(guān)基因(Atg)的參與，目前發(fā)現(xiàn)的Atg有30余種[9]。自噬誘發(fā)后，Atg5可促使自噬體膜的形成和延長，形成自噬體結(jié)構(gòu)[10]。在自噬的整個過程中，自噬體的形成是關(guān)鍵。Beclin 1是一個關(guān)鍵的自噬調(diào)控分子，能與VPS34形成復(fù)合物，引發(fā)自噬相關(guān)蛋白在兩大泛素系統(tǒng)中的募集并結(jié)合于前自噬結(jié)構(gòu)(pre-autophagosomal structure，PAS)膜上，促使PAS膜呈“C”型延伸，包裹待降解的細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞器等，形成自噬體結(jié)構(gòu)[11]。另外，LC3能與Atg一起，促進(jìn)自噬體成熟。本研究發(fā)現(xiàn)，I/R+Resveratrol組及I/RI+Resveratrol組的Atg5、Beclin-1含量均顯著高于I/R組；白藜蘆醇治療能增加糖尿病大鼠IR時的Atg5、Beclin-1含量，促進(jìn)自噬體形成、上調(diào)自噬。此外，白藜蘆醇和胰島素聯(lián)合治療較單用白藜蘆醇能進(jìn)一步上調(diào)Beclin-1的表達(dá)。

AMPK是一種Ser/Thr蛋白激酶，為異源三聚體蛋白，由1個催化亞基α和2個調(diào)節(jié)亞基β、γ組成，是能量代謝和自噬、凋亡調(diào)控中的重要分子[12]。當(dāng)細(xì)胞內(nèi)ATP水平較低時，AMP和ADP直接結(jié)合γ亞基，構(gòu)象改變，使AMPK磷酸化[13-14]。本研究發(fā)現(xiàn)，I/R+Resveratrol組及I/RI+Resveratrol組p-AMPK表達(dá)水平顯著高于I/R組，而p-mTOR表達(dá)水平則顯著降低；這表明，在I/R時，白藜蘆醇可活化糖尿病大鼠的AMPK通路、抑制mTOR通路。這與國外其他研究[15-17]結(jié)果一致。

綜上所述，白藜蘆醇可能通過激活A(yù)MPK通路和抑制mTOR通路，上調(diào)LC3-Ⅱ、Atg5、Beclin-1的表達(dá)，促進(jìn)自噬，從而減輕糖尿病大鼠I/R。然而，其內(nèi)在調(diào)控機(jī)制仍有待進(jìn)一步探究。

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Resveratrol Reduces Cardiac Ischemia-Reperfusion Injury of Diabetic Rats by Promoting Autophagy in Experimental Study

SHENJiajia△HUANGYing△QIWeigangTANJinghuaZHANGDaifu

DepartmentofCardiology,ShanghaiPudongNewAreaPeople’sHospital,Shanghai201200,China

AbstractObjective： To investigate the protective mechanism of resveratrol in reducing cardiac ischemia-reperfusion injury (I/R) of diabetic rats and its effect on autophagy of cardiomyocytes.Methods： Streptozotocin(STZ)-induced diabetic rat model was constructed and 35 diabetic model rats were randomly divided into five groups, the sham group, the resveratrol non-surgery group, the I/R group, the resveratrol treatment group, and the resveratrol+insulin group, with 7 rats in each. Then I/R model was built by ligating-relaxing the left coronary. The change of myocardial infarction size was observed by methylene blue staining. Autophagic vacuoles were observed with transmission electron microscope(TEM). The expression of microtubule-associated protein 1 light chain 3(LC3)-Ⅰ and Ⅱ, autophagy related gene 5(Atg5), Beclin-1, as well as the expression and phosphorylation levels of AMP-activated protein kinase(AMPK) and mammalian target of rapamycin(mTOR), were detected by Western blotting.Results： The infarction size in resveratrol treatment group and resveratrol+insulin group was significantly smaller than that in I/R group(P<0.05).TEM showed that in resveratrol treatment group and resveratrol+insulin group, autophagy of cardiomyocytes could be promoted and the structure of cardiomyocytes could be improved, when I/R of occurred. The expression levels of LC3-Ⅱ,Atg5,Beclin-1 in I/R group were significantly lower than those in sham group(P<0.05),whereas the change of expression levels of LC3-Ⅰ had no significant difference(P>0.05). Meanwhile, the expression levels of Atg5 and Beclin-1 in resveratrol treatment group and resveratrol+insulin group were significantly higher than those in I/R group, and the expression level of Beclin-1 in resveratrol+insulin group was higher than that in resveratrol treatment group(P<0.05). There was no significant difference in the expression level of AMPK and mTOR among the 5 groups(P>0.05). However, the expression level of p-AMPK was significantly higher in resveratrol treatment group and resveratrol+insulin group than that in I/R group, and the expression level of p-mTOR was significantly lower in resveratrol treatment group and resveratrol+insulin group than that in I/R group (P<0.05).Conclusions： Resveratrol may protect cardiomyocytes of diabetic rats by activating AMPK pathway, inhibiting mTOR pathway, increasing the expression of LC3-Ⅱ,Atg5 and Beclin-1, promoting autophagy, suppressing I/R, and reducing infarction size.

Key WordsResveratrol；Diabetic model；Ischemia-reperfusion injury model；Autophagy；Rats

中圖分類號R587.1

文獻(xiàn)標(biāo)識碼A

通訊作者張代富，E-mail：zdf@medmail.com.cn

基本項(xiàng)目：上海市衛(wèi)生局青年科研項(xiàng)目(編號：20124Y200)

△沈佳佳和黃瑛對本文有同等貢獻(xiàn)，為共同第一作者

·論著·