何美琳，張煥容，2＊，王　棟（.西南民族大學生命科學與技術(shù)學院，四川成都6004；2.動物醫(yī)學四川省高等學校重點實驗室，四川成都6004）

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豬戊型肝炎病毒ORF3基因的克隆與原核表達

何美琳1，張煥容1，2＊，王棟1
（1.西南民族大學生命科學與技術(shù)學院，四川成都610041；2.動物醫(yī)學四川省高等學校重點實驗室，四川成都610041）

摘 要：為了表達豬源戊型肝炎病毒衣殼蛋白，并對其反應原性進行研究，采用RT-PCR方法擴增豬戊型肝炎病毒（SHEV）ORF3完整基因，將擴增產(chǎn)物插入pMD19-T載體，再亞克隆至原核表達載體pET-32a （+），構(gòu)建了pET-32a（+）-ORF3表達載體，轉(zhuǎn)入E.coli BL21（DE3），IPTG誘導表達，同時對誘導表達條件進行篩選，并用SDS-PAGE和免疫印跡等方法分析鑒定表達產(chǎn)物。結(jié)果表明，成功擴增到345bp的目的基因片段，表達載體pET-32a（+）-ORF3轉(zhuǎn)入E.coli BL21（DE3），經(jīng)IPTG誘導，成功表達了ORF3基因編碼的蛋白，當IPTG濃度為1mmol/L，誘導時間為6h時，該基因在E.coli BL21（DE3）中表達量最高。表達產(chǎn)物的分子質(zhì)量約為29.6ku，與預期目的蛋白分子質(zhì)量相符。表達的蛋白既有包涵體形式，也有可溶性形式。經(jīng)Western blot檢測，表達的目的蛋白能與SHEV陽性血清發(fā)生特異性反應。

關鍵詞：豬戊型肝炎病毒；ORF3基因；表達

戊型肝炎（Hepatitis E，HE）是由戊型肝炎病毒（Hepatitis E virus，HEV）感染引起的經(jīng)腸道傳播的急性病毒性肝炎，主要通過糞便經(jīng)口傳播。人群感染后病死率在0.5%～3%之間，孕婦感染后病情較重，病死率高達15%～25%。戊型肝炎的暴發(fā)流行主要發(fā)生在亞洲和非洲一些衛(wèi)生條件較差的發(fā)展中國家，散發(fā)病例見于世界各地［1-2］。Meng X J等［3］證實美國豬群中存在HEV抗體，并檢測到豬HEV RNA，發(fā)現(xiàn)其與人HEV具有極高的同源性，并可感染黑猩猩和恒河猴，從而首次證實了HEV種間傳播的可能性。隨后，越來越多的證據(jù)表明豬戊型肝炎是一種人畜共患病，凸現(xiàn)出豬戊型肝炎的公共衛(wèi)生學意義。目前基因Ⅳ型HEV在我國豬群中普遍流行［4］。臨床上檢測HEV抗體及HEV疫苗的研制多是圍繞ORF2和ORF3而設計［5］。由于HEV組織培養(yǎng)困難，難以研制減毒或滅活疫苗，因此，利用基因工程技術(shù)制備重組抗原，研制多肽疫苗成為戊型肝炎研究的熱點［6］。本試驗對豬戊型肝炎病毒ORF3基因片段進行了克隆及原核表達，并對其抗原性進行了初步鑒定，以期獲得可以作為診斷用的重組蛋白，為進一步建立診斷方法提供依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1含豬HEV核酸的糞便樣品、血清、載體和宿主菌株 含豬Ⅳ型HEV核酸的糞便樣品和陽性血清由愛荷華州立大學獸醫(yī)診斷與動物生產(chǎn)系Tanja教授惠贈；2011年-2013年間采自四川地區(qū)20個規(guī)?；i場的豬糞便樣品270份，pMD19-T載體為寶生物工程（大連）有限公司產(chǎn)品；感受態(tài)細胞、E.coli DH5ɑ、pET-32a（+）和E.coli BL21（DE3）均由西南民族大學生命科學與技術(shù)學院動物醫(yī)學實驗室保存。

1.1.2主要試劑 Trizol為Invitrogen公司產(chǎn)品；DNA Marker DL 2 000和DL 15 000為天根生化科技（北京）有限公司產(chǎn)品；反轉(zhuǎn)錄試劑盒為寶生物工程（大連）有限公司產(chǎn)品；EX-Taq DNA聚合酶、dNTP為TaKaRa公司產(chǎn)品；AXY prepTM DNA膠回收試劑盒、AXY prepTM小量質(zhì)粒提取試劑盒為Axygen公司產(chǎn)品；限制性內(nèi)切酶BamHⅠ和EcoRⅠ為Promega公司產(chǎn)品。

1.2方法

1.2.1引物設計與合成 根據(jù)GenBank中登錄的豬戊型肝炎ORF3基因序列（登錄號：AY594199.1），利用Primer 5.0軟件設計一對特異性引物，上游引物F1（BamHⅠ）：5′-CGCGGATCCATGGAGATGCCACCATGCGCT-3′，下游引物R1（EcoRⅠ）：5′-CCGGAATTCTCAACGGCGAAGCCCCAGCT-3′，引物由上海生工生物工程技術(shù)服務有限公司合成。

1.2.2病毒RNA的提取與ORF3基因的擴增

取豬糞樣懸液，12 000r/min離心5min，取上清液，根據(jù)Invitrogen公司的Trizol說明書提取樣本總RNA。將提取的總RNA按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。反轉(zhuǎn)錄后得到的cDNA置于-20℃保存。以提取的cDNA為模板進行PCR擴增。PCR反應總體系為25μL：cDNA 2.0μL，上、下游引物各1μL，10×PCR buffer 2.5μL，25mmol/L MgCl22μL，2.5mmol/L dNTP 2μL，EXTaq DNA聚合酶（5U/μL）0.15μL，ddH2O調(diào)整總體積至25μL。PCR反應程序為：95℃5min；95℃30s，53℃30s，72℃30s，共35個循環(huán)；72℃10 min，16℃反應結(jié)束。PCR擴增產(chǎn)物用20g/L瓊脂糖凝膠電泳觀察。

1.2.3PCR產(chǎn)物的純化與克隆 按AXY prepTMDNA膠回收試劑盒說明回收目的片段，并取5μL回收產(chǎn)物經(jīng)20g/L的瓊脂糖凝膠電泳檢測回收效果。將目的片段按照TaKaRa公司的pMD19-T Vector Kit說明進行連接。連接產(chǎn)物按常規(guī)方法轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細胞E.coli DH5ɑ培養(yǎng)，挑取單菌落進行菌落PCR鑒定。陽性克隆增菌培養(yǎng)后按常規(guī)堿裂解法提取質(zhì)粒，用BamHⅠ和EcoRⅠ雙酶切鑒定，鑒定正確的陽性克隆菌液送上海生工生物工程技術(shù)服務有限公司測序，測序正確的質(zhì)粒命名為pMD19-T-ORF3。

1.2.4重組表達質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定 用BamHⅠ和EcoRⅠ酶切pMD19-T-ORF3質(zhì)粒以及表達載體pET-32a（+），回收目的片段，在T4DNA連接酶的作用下進行連接構(gòu)建重組蛋白表達質(zhì)粒pET-32a（+）-ORF3，連接產(chǎn)物，轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細胞E.coli BL21（DE3）。挑選單個白色菌落接種于含Amp （100μg/mL）的LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜，經(jīng)菌液PCR和酶切鑒定為陽性者，將菌液按1∶100的比例接種于新鮮的含相同濃度抗生素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃、180r/min振蕩培養(yǎng)至OD 600nm值達0.6～0.7，取2mL菌液作為誘導前對照，向其余菌液中加入IPTG至終濃度為1mmol/L，37℃，振蕩培養(yǎng)，分別收取2、4、6、8、10h及過夜誘導菌液各2mL，8 000r/min離心20min，收集菌體沉淀進行SDS-PAGE檢測。

1.2.5表達產(chǎn)物的SDS-PAGE檢測 將各時間點收集的菌體重懸于200μL PBS中吹散混勻，各取20μL分別加入5μL 5×SDS上樣緩沖液，沸水浴5min，取10μL上清于濃度120g/L的聚丙烯酰胺凝膠進行SDS-PAGE檢測。電泳結(jié)果用凝膠成像系統(tǒng)采集圖像保存。

1.2.6重組蛋白表達形式的鑒定 根據(jù)1.2.5結(jié)果選取表達量高的時間點進行目的蛋白的大量誘導表達，菌液以8 000r/min離心20min，收集菌體沉淀，用PBS重懸并洗滌2次，菌體重懸于適量PBS，冰浴條件下進行。

1.2.7重組ORF3蛋白的純化 配制120g/L的分離膠，向膠板里緩慢加入4mL分離膠，加入1mL的去離子水，待膠凝固后倒掉去離子水，加入4%的濃縮膠200μL，不插梳子，待膠凝固后加入800μL的經(jīng)上樣緩沖液處理過的樣品，另按常規(guī)方法配膠，加入標準分子量蛋白做參考，按常規(guī)方法電泳，電泳結(jié)束后將膠置0.25mol/L的KCl溶液中在脫色，搖床上搖1h，可見在30ku左右位置出現(xiàn)一條白色條帶，將白色條帶切下置蒸餾水中在脫色搖床上搖20min脫去KCL，將切下來的膠研磨碎再加上適量PBS，反復凍融3次后，8 000r/min離心10min，取上清。

1.2.8重組蛋白的Western blot檢測 取純化后的重組蛋白進行SDS-PAGE電泳后，將凝膠上的相應條帶轉(zhuǎn)印至PVDF膜上，電轉(zhuǎn)后的PVDF膜置于50g/L的脫脂奶粉中，4℃封閉過夜，然后轉(zhuǎn)入用TBST按1∶200倍稀釋的豬HEV陽性血清中，37℃溫育2h，用TBST液洗膜3次。再轉(zhuǎn)入用TBST液按1∶2 000稀釋的HRP標記的羊抗豬IgG中，37℃溫育2h，TBST洗滌液洗膜3次。按照Bio-Rad公司Immun-StarTMWestern C Chemiluminescent Kit說明書顯色，于VersaDoc成像系統(tǒng)中觀察結(jié)果。

2　結(jié)果

2.1RT-PCR擴增結(jié)果

用設計的引物從豬糞便樣品中擴增出長度約350bp的片段，與預期片段大小一致（圖1）。

圖1　ORF3基因的PCR擴增產(chǎn)物Fig.1 PCR products of ORF3gene

2.2克隆質(zhì)粒酶切鑒定結(jié)果

重組質(zhì)粒經(jīng)BamHⅠ和EcoRⅠ雙酶切，得到與預期大小一致的載體片段和目的片段，說明豬HEV ORF3基因片段成功插入pMD19-T載體中（圖2）。

圖2　重組質(zhì)粒的酶切鑒定Fig.2 Identification of recombinant plasmid by enzyme digestion

2.3目的蛋白誘導表達最佳時間的篩選

重組表達菌在IPTG濃度1mmol/L時誘導表達，不同時間點收集表達產(chǎn)物經(jīng)SDS-PAGE分析，結(jié)果2、4、6、8、10h和過夜誘導獲得大小約為29.6ku的目的蛋白，當誘導時間為6h時，目的蛋白表達量最高（圖3）。

圖3　ORF3基因在E.coli BL21（DE3）中的表達Fig.3 Expression of ORF3gene in E.coliBL21（DE3）

2.4重組蛋白表達形式的鑒定

超聲破碎離心后的菌體上清和沉淀經(jīng)SDSPAGE檢測顯示，ORF3重組蛋白既以包涵體形式存在，又以可溶性蛋白形式存在（圖4）。

圖4　超聲破碎后ORF3重組蛋白Fig.4 ORF3recombinant protein disintegrated by ultrasonication

2.5ORF3重組蛋白Western blot檢測

Western blot檢測結(jié)果表明，表達的重組ORF3蛋白能夠與豬HEV陽性血清特異性結(jié)合，在約29.6ku處出現(xiàn)條帶，與預期一致（圖5）。說明表達的重組蛋白可被豬HEV陽性血清識別，具有良好的抗原性。

圖5　ORF3重組蛋白的Western blot鑒定Fig.5 Western blot analysis of ORF3recombinant protein

3　討論

長期以來，國內(nèi)外對戊型肝炎病毒的研究主要集中在ORF1和ORF2及其編碼蛋白的功能上。但對ORF3的研究表明，ORF3編碼蛋白至少含有4個線性抗原表位［7］。由于ORF3在細胞信號轉(zhuǎn)導、病毒顆粒裝配和機體免疫方面可能發(fā)揮重要作用，其蛋白表達受到更多的關注。杜麗等［8］分析了pORF3蛋白對于靶細胞MAPK磷酸化的影響，提出MAPK家族中的p-ERK1和p-ERK2表達水平的升高與靶細胞的增殖相關。Guegan J P等［9］研究表明生長因子可通過MEK1/2-ERK1/2通路的激活促進細胞增殖。王晶晶等［10］研究表明，Ⅳ型ORF3蛋白可抑制TNF-α介導的p65核轉(zhuǎn)移。Dong C等［11］發(fā)現(xiàn)HEV ORF3蛋白能結(jié)合STATl，抑制IFN-α誘導的STATl磷酸化，導致抗病毒基因PKR、2，5-OAS和MxA表達受到抑制，逃避宿主的攻擊。有學者認為，利用不同型HEV pORF3作診斷試劑，不但可以檢測戊型肝炎病毒基因型，還可以用于診斷急性戊肝［12］。

本研究對Ⅳ型戊型肝炎病毒的ORF3基因進行原核表達，并對其抗原性進行了初步鑒定，旨在獲得可以作為診斷抗原用的重組蛋白。盡管關于豬戊型肝炎病毒ORF2方面的原核表達研究相對成熟［13］，但對ORF3相關蛋白表達的研究卻不多。本研究成功構(gòu)建了豬HEV原核表達重組質(zhì)粒pET32a（+）-ORF3，當IPTG濃度為1mmol/L，誘導時間為6h時，目的蛋白在E.coli BL21（DE3）中表達量最高。誘導表達后對菌液進行超聲破碎，再用SDS-PAGE電泳檢測重組菌裂解上清液和沉淀中融合蛋白的存在形式。結(jié)果表明，目的蛋白在上清液和沉淀中均大量存在，經(jīng)Western blot檢測，表達的目的蛋白能與豬HEV陽性血清發(fā)生特異性反應。由于該蛋白可以可溶性形式存在，從而避免了包涵體復性工藝造成的制備成本上升［14］。同時由于該蛋白也可以包涵體形式存在，避免了表達菌內(nèi)蛋白水解酶的作用，這會使最后純化蛋白的難度下降。表達蛋白良好的抗原性適合作為抗原建立豬戊型肝炎病毒抗體的檢測方法。該重組蛋白為進一步建立HEV血清學診斷方法奠定了基礎，具有重要的現(xiàn)實意義。

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Cloning and Prokaryotic Expression of Swine Hepatitis E Virus ORF3 Gene

HE Mei-lin1，ZHANG Huan-rong1，2，WANG Dong1
（1.College of Life Science and Technology，Southwest University for Nationalities，Chengdu，Sichuan，610041，China；2.Key Laboratory of Medicine of Universities in Sichuan，Chengdu，Sichuan，610041，China）

Abstract：To express recombinant swine hepatitis E virus capsid protein in prokaryotic cells and analyze the reactogenieity of expressed product.The full-length of Swine Hepatitis E Virus（SHEV）ORF3gene was amplified by reverse transcript polymerase chain reaction（RT-PCR）and inserted into vector pMD19-T，then subcloned into prokaryotic expression vector pET-32a（+）.The pET-32a（+）-ORF3was transformed into E.coli BL21（DE3）for expression with the induction of IPTG，at the same time，the time of expression under the induction of IPTG was optimized.The expression product was identified by SDS-PAGE and Western blot.The result showed that the successfully amplified target gene was about 345bp.The protein encoded by ORF3gene was successfully expressed by IPTG induction.The highest expressed protein in E. coli BL21（DE3）was induced with 1mmol/L IPTG for 6h.The relative molecular mass of expressed product was about 29.6ku，consistent with the expected target protein.The expressed protein not only existed in the form of inclusion body but also in the form of soluble protein.Western blot showed that the expressed fusion protein can specifically reacted with SHEV positive serum.

Key words：Swine hepatitis E virus；ORF3gene；expression

作者簡介：何美琳（1990-），女，湖北黃梅人，碩士，主要從事動物傳染病學研究。＊通訊作者

基金項目：四川省科技計劃項目應用基礎計劃（2011JY0034）

收稿日期：2014-12-24

中圖分類號：S855.3；Q786

文獻標識碼：A

文章編號：1007-5038（2015）07-0033-05