孫虎芝，任慧英，張　燦（青島農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，山東青島266109）

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噬菌體Bp7尾絲蛋白gp38密碼子用法及偏性分析

孫虎芝，任慧英，張燦＊
（青島農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，山東青島266109）

摘 要：為了解噬菌體Bp7尾絲蛋白gp38的密碼子使用特征，利用生物信息學(xué)方法對(duì)1株臨床分離的多價(jià)烈性噬菌體Bp7尾絲蛋白gp38與其他5株T4類噬菌體進(jìn)行密碼子用法的分析比較。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Bp7尾絲蛋白gp38與其他5株T4類噬菌體密碼子的使用模式差別大，Bp7尾絲蛋白gp38偏好于以C結(jié)尾的密碼子，而其余5株噬菌體偏好A或U結(jié)尾；除了AUG（Met）和UGG（Trp）外，還確定了Bp7尾絲蛋白gp38使用的25種高頻密碼子；通過6株噬菌體gp38的密碼子偏性比較發(fā)現(xiàn)，Bp7與任何一株噬菌體都存在較大差異；聚類分析的結(jié)果也表明，Bp7尾絲蛋白gp38與其余5株噬菌體不屬于一類?？傮w上，噬菌體Bp7尾絲蛋白gp38在密碼子使用上比較特殊，gp38基因密碼子的分析將為進(jìn)一步研究噬菌體Bp7的感染機(jī)制及擴(kuò)寬其裂解譜奠定基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：噬菌體；Bp7；尾絲蛋白gp38；密碼子

自然界中編碼氨基酸的密碼子有61種，每一種氨基酸至少對(duì)應(yīng)1種密碼子，最多對(duì)應(yīng)6種密碼子，說明密碼子存在簡(jiǎn)并性。對(duì)于不同的生物來說，當(dāng)多種密碼子對(duì)應(yīng)同一種氨基酸時(shí)，編碼同一種氨基酸的密碼子的使用頻率也不同，從而造成密碼子的偏性［1-2］。密碼子的偏性在一定程度上與物種有關(guān)，有時(shí)候還能反映出物種間基因進(jìn)化的規(guī)律。

T4類噬菌體通過其尾絲吸附到宿主菌表面受體，進(jìn)而侵染宿主，尾絲蛋白gp37以三聚體形式吸附到宿主表面受體是侵染宿主的第1步，gp38作為伴侶分子，在gp37蛋白形成三聚體過程中起作用［3］。噬菌體Bp7是一株多價(jià)烈性噬菌體，屬于T4類噬菌體，能夠侵染大腸埃希菌，對(duì)雞致病性大腸埃希菌的寬噬率達(dá)46%［4-5］。前期研究發(fā)現(xiàn)，噬菌體Bp7尾絲蛋白gp38多克隆抗體也能明顯抑制噬菌體的增殖，說明gp38與gp37一樣，也參與宿主菌受體的結(jié)合，表明gp38不僅僅是gp37的伴侶分子，還參與Bp7的宿主識(shí)別過程，這與T4噬菌體gp38的作用不同［6］。鑒于噬菌體Bp7與T4噬菌體的尾絲蛋白gp38功能的差異，本文選擇5株T4類噬菌體，對(duì)Bp7尾絲蛋白gp38的密碼子使用偏性進(jìn)行分析，以期為gp38的分子改造并進(jìn)一步拓寬噬菌體Bp7的宿主譜提供依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料

多價(jià)噬菌體Bp7（HQ829472）由青島農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)微生物實(shí)驗(yàn)室分離并保存，T4類噬菌體JS98 （NC-010105）、JS10（NC-012741）、IME08（NC-014260）、T4（NC-000866）及RB51（FJ-839693.1）的全基因序列從NCBI中獲得，各株噬菌體尾絲蛋白gp38基因序列從全序列中獲得。

1.2方法

利用軟件Codonw1.4.4以及cusp來對(duì)密碼子的各項(xiàng)指標(biāo)進(jìn)行分析，對(duì)于密碼子的偏性來說一般需要對(duì)密碼子的適應(yīng)指數(shù)（CAI）、偏愛指數(shù)（CBI）、有效的密碼子數(shù)（ENC）以及使用的相對(duì)頻率（RSCU）進(jìn)行分析［7-8］。利用軟件cusp分析gp38基因序列中的GC含量、密碼子中第3位堿基的GC含量（GC3s）以及密碼子第1、2位上G+C%含量（GC12），對(duì)于分析的數(shù)據(jù)運(yùn)用Excel進(jìn)行作圖分析。

應(yīng)用MegAlign軟件進(jìn)行6株噬菌體gp38基因進(jìn)行氨基酸序列分析，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。同時(shí)運(yùn)用SPSS軟件進(jìn)行密碼子偏性的聚類分析，對(duì)兩個(gè)結(jié)果進(jìn)行比較。

2　結(jié)果

2.1噬菌體尾絲蛋白gp38基因密碼子偏性指標(biāo)確定

通過RSCU值確定密碼子偏性［9-10］。RSCU值代表了密碼子的使用頻率偏性，偏性較高的密碼子RSCU＞1，偏性低的密碼子RSCU＜1。通過計(jì)算RSCU值，分析噬菌體Bp7與其余5株T4類噬菌體的尾絲蛋白gp38基因的密碼子用法（圖1）。6株噬菌體gp38密碼子使用情況相差較大，且所偏愛的密碼子也不相同。Bp7尾絲蛋白gp38中28個(gè)密碼子RSCU值大于1，多以C結(jié)尾，而其余5株噬菌體中，多以A或U結(jié)尾。Bp7尾絲蛋白gp38以UAA，UAG和UGA作為終止密碼子，而其余5株噬菌體只使用終止密碼子UAA或UAG。

通過密碼子使用頻率（Fraction）反映密碼子使用的高頻與低頻。根據(jù)得到的Fraction值，利用高頻密碼子分析法進(jìn)行分析［11］。通過密碼子使用頻率分析發(fā)現(xiàn)，除AUG（M）和UGG（W）外，確定了25種密碼子為高頻密碼子。此外，gp38基因中GGG、CUA、UCA、ACU、ACA、GCU、GCA、GUG的使用頻率極低，其中CUA、UCA、GCA和GGG更是未被使用（圖1）。將Bp7與其他5株噬菌體比較，CCU（P）使用頻率明顯低于其他5株噬菌體，UGC（C）使用頻率明顯高于JS10、JS98、T4和RB51，與IME08基本一致。

2.26株噬菌體gp38基因密碼子頻率比較

圖1　噬菌體尾絲蛋白gp38基因密碼子使用模式分析Fig.1 Analysis of condon usage model of gp38between 6T4-like phages

分別對(duì)Bp7-gp38（264codons）、IME08-gp38 （264codons）、JS10-gp38（258codons）、JS98-gp38 （263codons）、T4-gp38（138codons）和IME08-gp38（258codons）密碼子的Frequency（1/1 000）值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)并進(jìn)行比較（圖2）。密碼子頻率的比值在0.5 ～2.0之間時(shí)，密碼子偏性相近。Bp7-gp38基因與其他5株噬菌體gp38基因密碼子頻率比較結(jié)果顯示，噬菌體Bp7-gp38基因與其余5株噬菌體密碼子使用偏性相差甚遠(yuǎn)，并且Bp7與其余5株噬菌體的比值小于0.5或大于2.0的有許多種，而剩余的5株噬菌體中除T4外，其余4株噬菌體密碼子使用偏性基本一致，可見噬菌體Bp7尾絲蛋白gp38比較特殊。

圖2　噬菌體gp38基因密碼子頻率比較Fig.2 Frequency comparison of codons in gp38gene of phage Bp7

2.3CAI、CBI、ENC、GC3s、GC、GC12計(jì)算及相關(guān)性分析

通過Codonw 1.4.4分析6株噬菌體gp38基因的CAI、CBI、ENC、GC3s及GC數(shù)值，結(jié)果見表1。CAI、CBI值均偏小，表明6株噬菌體gp38基因在密碼子的使用特性上并不存在顯著的偏愛性。由圖3可見，6株噬菌體ENC值均較高（均大于45），表明gp38基因密碼子的偏愛性較低。6株噬菌體gp38基因GC含量在34.1%以上，而第3位堿基中G+ C%含量大部分低于基因的GC含量，但是Bp7的gp38基因卻相反，第3位堿基中G+C%（58.2%）的含量卻高于基因的GC（50.4%）含量。

各指數(shù)之間相關(guān)性分析結(jié)果見圖3。圖3A為6株噬菌體gp38基因密碼子ENC-GC3s相關(guān)分析。由圖3可見，6株噬菌體與趨勢(shì)線之間的關(guān)系，雖然Bp7尾絲蛋白gp38的GC3s值稍大（0.504），ENC值也相對(duì)稍高（49.52），但仍靠近于趨勢(shì)線，說明gp38基因密碼子的偏好可能受堿基組成的影響。圖3B為gp38基因中性繪圖分析（GC12-GC3s）。GC12和GC3s的變化范圍均很小，回歸系數(shù)為負(fù)值，表明GC12和GC3s的變異模式不同。由圖3可知，5株噬菌體IME08、JS10、T4、RB51和JS98相近，與Bp7有差異。

表1　六株噬菌體gp38基因密碼子CAI、CBI、ENC、GC3s、GC及GC12Table 1 CAI，CBI，ENC，GC3s，GC and GC12of gp38codon of 6phages

2.46株噬菌體gp38基因進(jìn)化樹的構(gòu)建及其密碼子聚類分析

利用MegAlign對(duì)6株噬菌體gp38氨基酸序列分析，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)生樹（圖4）。進(jìn)化樹分析結(jié)果顯示Bp7與RB51親緣關(guān)系最近，與其他噬菌體親緣關(guān)系遠(yuǎn)，二者單獨(dú)一個(gè)分支；Bp7與T4親緣關(guān)系最遠(yuǎn)。對(duì)6株噬菌體gp38基因根據(jù)RSCU值進(jìn)行聚類分析（圖5）。聚類分析結(jié)果顯示JS10與JS98聚成一類，而IME08與T4聚成一類，Bp7單獨(dú)一類。密碼子聚類分析針對(duì)的是密碼子，采用的是層次聚類算法決定集群組之間的距離，而系統(tǒng)發(fā)育樹分析針對(duì)的是單個(gè)堿基，采用鄰接法構(gòu)建進(jìn)化樹。從整體上看，噬菌體Bp7尾絲蛋白gp38進(jìn)化分析和聚類分析結(jié)果基本一致，與其他5株噬菌體差異較大。

圖3　六株噬菌體gp38基因密碼子ENC、GC3s及GC12數(shù)據(jù)相關(guān)性分析Fig.3 Analysis of ENC，GC3sand GC12of gp38codon of 6phages

圖4　六株噬菌體gp38基因核苷酸序列系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.4 Polygenetic tree of gene gp38of six phages

圖5　六株噬菌體gp38基因密碼子聚類分析Fig.5 Cluster analysis of gp38codons of six phages

3　討論

T4類噬菌體吸附宿主菌的特異性由靠近尾部的長(zhǎng)尾絲蛋白序列決定，長(zhǎng)尾絲纖維與宿主菌表面受體之間特定的相互作用，導(dǎo)致噬菌體吸附的快速與高效。研究發(fā)現(xiàn)T4噬菌體尾絲蛋白gp37位于噬菌體長(zhǎng)尾絲末端，以三聚體形式識(shí)別宿主菌表面受體；而gp38在不同的噬菌體中有不同的功能：在T4噬菌體中，gp38作為伴侶分子，能夠幫助尾絲形成正確的空間結(jié)構(gòu)從而識(shí)別靶位點(diǎn)，它是gp37能形成三聚體的前提；而在T2噬菌體中g(shù)p38作為長(zhǎng)尾絲的組成部分，參與宿主菌的識(shí)別過程［12］。本實(shí)驗(yàn)室分離得到噬菌體Bp7，經(jīng)鑒定為T4類噬菌體，但是其尾絲蛋白gp38與T4噬菌體進(jìn)化關(guān)系較遠(yuǎn)［13］。試驗(yàn)證明噬菌體Bp7尾絲蛋白gp38參與宿主識(shí)別過程［14］，因此推測(cè)其具有類似T2噬菌體gp38的作用，在噬菌體Bp7中位于長(zhǎng)尾絲蛋白的末端，參與受體的識(shí)別［15］。為進(jìn)一步研究噬菌體侵染細(xì)菌的機(jī)制，對(duì)Bp7尾絲蛋白gp38進(jìn)行密碼子用法分析。

相對(duì)同義密碼子用法（RSCU）能比較直觀的反映出密碼子的使用偏性［16］。通過分析發(fā)現(xiàn)Bp7尾絲蛋白gp38密碼子CUG為一種高頻密碼子，除了IME08外，其余4株噬菌體未曾使用過密碼子CUG。密碼子AGG在Bp7和JS10中為一種高頻密碼子，而在其余4株噬菌體中曾未使用。噬菌體Bp7尾絲蛋白gp38基因有18種高頻密碼子，其中編碼疏水性氨基酸的密碼子相對(duì)較多。Bp7尾絲蛋白gp38基因中有13種密碼子的使用頻率極低（圖1），其中TCA、GCA、CTA和GGG更是未被使用。通過對(duì)終止密碼子的分析發(fā)現(xiàn)，噬菌體Bp7尾絲蛋白對(duì)終止密碼子UAA、UAG和UGA都使用過，而其余5株噬菌體只是用終止密碼子UAA或UAG。密碼子的使用偏性是指一種密碼子的使用頻率明顯高于編碼同一種氨基酸的其他密碼子。對(duì)于不同的生物來說，密碼子的偏性也是有所差異的，對(duì)于同源性很高的物種來說，其密碼子的偏性也不盡相同。密碼子的偏好性在一定程度上能夠揭示有關(guān)物種間或某一物種的基因家族間的基因進(jìn)化規(guī)律［17］。目前對(duì)密碼子的偏性分析，在分子進(jìn)化、翻譯調(diào)控等研究領(lǐng)域，對(duì)不同物種的密碼子使用偏性有大量研究［18］。噬菌體Bp7尾絲蛋白gp37偏愛以A或U結(jié)尾［19］，本文分析結(jié)果表明，Bp7尾絲蛋白gp38基因偏愛C結(jié)尾，對(duì)A、G和U結(jié)尾的密碼子使用頻率差不多，而其余5株噬菌體偏愛A或U結(jié)尾?？傊?，Bp7尾絲蛋白gp38密碼子特征與其他噬菌體密碼子差異大，有必要進(jìn)一步深入研究gp38在噬菌體Bp7中的作用。

對(duì)于同一密碼子的使用頻率的影響因素有許多，例如GC的含量及施加于基因序列上的突變的壓力［20］。病毒侵染宿主也與其兩者之間的密碼子有關(guān)，密碼子的偏性也與二者之間的進(jìn)化有關(guān)。噬菌體侵染宿主菌時(shí)，其轉(zhuǎn)錄及翻譯系統(tǒng)的適應(yīng)程度也與這種差異有關(guān)，病毒密碼子使用頻率和宿主之間的差異是病毒在宿主中生存的重要調(diào)控機(jī)制之一［21］，差異越小，病毒對(duì)其宿主的適應(yīng)性就越好。評(píng)價(jià)密碼子偏性的指標(biāo)包括許多種，本文利用了CAI、CBI、ENC、GC3s和GC含量來反映密碼子的偏性，由結(jié)果可以看出，這些指標(biāo)的變化范圍都比較小。CAI和CBI是兩項(xiàng)重要的檢測(cè)指標(biāo)，可以直接反映密碼子的偏性情況，也與外源基因的表達(dá)水平有一定的相關(guān)性［22-23］。ENC值也可以反映基因密碼子的偏性，ENC值越大，其偏性越低，對(duì)應(yīng)的內(nèi)源基因往往表達(dá)量也越低［24-25］，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Bp7尾絲蛋白gp38的ENC值最大，因此可以看出Bp7尾絲蛋白gp38的偏性比較低，可以推斷其內(nèi)源基因的表達(dá)可能也比較低。

噬菌體Bp7與另外5株T4類噬菌體gp38基因密碼子進(jìn)行偏愛性比較發(fā)現(xiàn)差異性較大。同時(shí)對(duì)噬菌體Bp7尾絲蛋白gp38進(jìn)化分析顯示，Bp7與RB51親緣關(guān)系最高，與其余4株噬菌體分屬2個(gè)分支；聚類分析的結(jié)果顯示Bp7獨(dú)立于其他5株噬菌體，單獨(dú)一類，這說明Bp7在進(jìn)化上和密碼子使用上都比較特殊。通過進(jìn)化樹與聚類分析，說明物種間的親緣關(guān)系越近，密碼子的偏愛性差異越??；親緣關(guān)系越遠(yuǎn)，密碼子偏愛性的差異越大?？傊删wBp7尾絲蛋白gp38密碼子的偏性比較特殊，這可能與gp38自身的作用有一定聯(lián)系，想充分確定這一現(xiàn)象，需要進(jìn)一步進(jìn)行侵菌試驗(yàn)研究。

通過對(duì)Bp7尾絲蛋白gp38密碼子的分析，發(fā)現(xiàn)Bp7尾絲蛋白gp38在密碼子使用及密碼子偏性中與其余5株T4類噬菌體都存在較大的差異，并且這一點(diǎn)在進(jìn)化樹與聚類分析中也很明確，可見噬菌體Bp7尾絲蛋白gp38是比較特殊，分析結(jié)果為探討B(tài)p7尾絲蛋白gp38在宿主菌侵染過程中的作用提供幫助。

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Analysis of Codon Usage and Bias in Tail Fiber gp38 of Phage Bp7

SUN Hu-zhi，REN Hui-ying，ZHANG Can
（College of Animal Science and Technology，Qingdao Agricultural University，Qingdao，Shangdong，266109，China）

Abstract：In order to understand the characters of code usage in gene gp38of phage Bp7，polyvalent coliphage Bp7was isolated and identified as T4-like phage，the codon usage in gene gp38of phage Bp7was analyzed by bioinformatics softwares.The results showed as follows，the patterns of codon usage in gene gp38 of phage Bp7and other 5T4-like phages were obviously different.In gene gp38of phage Bp7，C end codon was commonly used，and A or U end codons were used in remaining 5phage strains；25kinds of high-frequency codons were identified except AUG（Met）and UGG（Trp）.The bias comparison among gp38of phage Bp7and other 5phages showed that Bp7was different with other phage strains；Cluster analysis results showed that gene gp38of phage Bp7and the rest 5phage strains do not belong to same cluster.Gene gp38of phage Bp7on codon usage was special，the results of analysis of gp38codons will benefit to understand the invasion mechanism of phage Bp7and broaden the host range of phage Bp7.

Key words：phage；Bp7；tail fiber gp38；codon

作者簡(jiǎn)介：孫虎芝（1991-），男，山東乳山人，碩士研究生，主要從事獸醫(yī)微生物與免疫學(xué)研究。＊通訊作者

基金項(xiàng)目：山東省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（ZR2013CQ024，ZR2009DM009）

收稿日期：2015-01-11

中圖分類號(hào)：Q78；S854.5

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1007-5038（2015）07-0037-06