曾　偉，劉慶亮，孔　強(qiáng)，張文東，胡媛媛，胡挺松，趙煥云，段博芳，邱　薇，范泉水，張應(yīng)國(guó)，宋建領(lǐng)，張富強(qiáng)＊（1.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)，云南昆明60；.云南省動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，云南昆明6001；.成都軍區(qū)疾病預(yù)防控制中心，四川成都61001；.云南省熱帶亞熱帶動(dòng)物病毒病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南昆明60；.云南省農(nóng)業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院，云南昆明6001）

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2009年-2014年云南邊境禽流感病毒H5N1亞型神經(jīng)氨酸酶基因進(jìn)化分析

曾偉1，2，3，劉慶亮1，2，3，孔強(qiáng)1，2，3，張文東2，胡媛媛5，胡挺松3，趙煥云2，
段博芳2，邱薇3，范泉水3，張應(yīng)國(guó)2，宋建領(lǐng)4，張富強(qiáng)3＊
（1.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)，云南昆明650223；2.云南省動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，云南昆明650051；3.成都軍區(qū)疾病預(yù)防控制中心，四川成都610041；4.云南省熱帶亞熱帶動(dòng)物病毒病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南昆明650224；5.云南省農(nóng)業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院，云南昆明650031）

摘 要：為了解云南邊境禽流感病毒H5N1亞型神經(jīng)氨酸酶（NA）基因變異及進(jìn)化特征，2009年-2014年期間在云南邊境采集境外家禽和野生鳥類棉拭子樣品1 500份，經(jīng)禽流感H5/N1亞型病毒特異性多重RT-PCR檢測(cè)，對(duì)陽(yáng)性樣品進(jìn)行病毒NA基因擴(kuò)增、純化、克隆和測(cè)序，并與已知毒株和參考毒株進(jìn)行序列比對(duì)及系統(tǒng)進(jìn)化分析。結(jié)果從1 500份樣品中檢出禽流感病毒H5N1亞型陽(yáng)性樣品60份；60陽(yáng)性樣品病毒HA基因測(cè)序獲得21種NA序列，可劃分為4個(gè)不同進(jìn)化分支。NA基因與HA基因呈現(xiàn)不同進(jìn)化關(guān)系；云南邊境毒株NA aa275位點(diǎn)未發(fā)生變異，因此變異毒株對(duì)神經(jīng)氨酸酶抑制劑Oseltamivir（達(dá)菲）類抗病毒藥物可能無(wú)抗性或耐藥性；2009年-2014年期間云南邊境H5N1亞型病毒NA間具有遺傳差異，NA基因進(jìn)化分支4已成為當(dāng)?shù)亓餍械膬?yōu)勢(shì)毒株。

關(guān)鍵詞：禽流感病毒；H5N1亞型；神經(jīng)氨酸酶；基因

禽流感（Avian influenza，AI）是由A型流感病毒（Influenza virus）引起的一種禽類的感染疾病綜合征。禽流感病毒（Avian influenza virus，AIV）屬于正黏病毒科（Orthomyxoviridae）A型流感病毒屬（Influenza viruse）成員［1］。神經(jīng)氨酸酶（Neuraminidase，NA）由基因組節(jié)段6所編碼，是一種唾液酸酶，可以在流感病毒感染靶細(xì)胞時(shí)，識(shí)別細(xì)胞表面病毒受體末端的唾液酸殘基，促進(jìn)病毒能夠進(jìn)入細(xì)胞［2］。NA的另一個(gè)功能是為將出芽的病毒粒子清理通道，有利于病毒粒子的成熟和釋放［3］。

1996年在廣東自鵝體內(nèi)分離獲得高致病性禽流感病毒H5N1亞型（AGSGD196）；1997年從中國(guó)香港因流感發(fā)病死亡的3歲兒童病例標(biāo)本中分離獲得H5N1亞型病毒（A/Hong Kong/156/97），首次確診人感染高致病性禽流感病例，其后在香港共發(fā)現(xiàn)18人感染，其中6人死亡，引起了國(guó)內(nèi)外的廣泛關(guān)注［4］。之后，我國(guó)科學(xué)家從豬和家禽的體內(nèi)分離得到H5N1亞型病毒，再次證實(shí)病毒已經(jīng)具備跨越種間屏障感染哺乳動(dòng)物的能力［5］。Keawcharoen J等［6］報(bào)道了2003年12月在泰國(guó)動(dòng)物園的虎和豹中檢出了高致病性禽流感病毒H5N1亞型；在隨后的2004年10月，在泰國(guó)另一個(gè)動(dòng)物園中的籠養(yǎng)虎也暴發(fā)了高致病性禽流感病毒H5N1亞型疫情，感染虎分離毒株與泰國(guó)家禽流行毒株一致，造成147頭虎死亡，并證明存在虎與虎之間的傳播［7］。禽流感病毒自然感染宿主譜廣，水禽及野生鳥類是其儲(chǔ)存宿主，可作為家禽及哺乳動(dòng)物禽流感發(fā)生、發(fā)展、分布和流行的主要傳染源［8］。2003年以來(lái)，包括我國(guó)在內(nèi)的65個(gè)國(guó)家或地區(qū)家禽/野生鳥類暴發(fā)高致病性禽流感H5N1亞型疫情，僅東南亞超過2億只家禽被撲殺，并在10個(gè)國(guó)家存在人感染病例649例，其中死亡385例，病死率超過59%（http：//www. who.int）。

雖然近年來(lái)全球H5N1亞型疫情報(bào)道呈逐年遞減趨勢(shì)，但與云南省接壤或相鄰的東南亞及南亞國(guó)家，高致病性禽流感疫情及人感染病例綿延不斷，每年均有發(fā)生，逐漸顯現(xiàn)地方流行態(tài)勢(shì)，成為全球高致病性禽流感分布流行的主要區(qū)域，難以根除［9-10］。開展云南境外高致病性禽流感H5N1亞型病原監(jiān)測(cè)及病毒NA基因測(cè)序分析，掌握我國(guó)周邊禽流感病原分布、變異和進(jìn)化特點(diǎn)，對(duì)禽流感研究及防控，防范境外流感病毒新基因型入侵有重要意義。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1毒株、樣品采集與菌株 滅活的禽流感H5N1、H9N2亞型病毒毒株為哈爾濱維科生物技術(shù)開發(fā)公司產(chǎn)品，作為檢測(cè)的陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照；采集的樣品為2009年-2014年期間云南邊境家禽和野生鳥類咽喉或泄殖腔拭子樣品1 500份（樣品采自鄰近云南邊境的5個(gè)境外集市，其中中越邊境雞、鴨咽喉或泄殖腔拭子各370份，鵝樣品30份，麻雀45份；中緬邊境雞、鴨咽喉或泄殖腔拭子各300份，孔雀60份，鷓鴣25份）。置總RNA裂解液中滅活后，低溫運(yùn)送至實(shí)驗(yàn)室；大腸埃希菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，由云南省動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心實(shí)驗(yàn)室制備、保存。

1.1.2主要試劑 總RNA提取液（TaKaRa RNAiso Reagent）、病毒RNA/DNA提取試劑盒（TaKaRa MiniBEST Viral DNA/RNA Extraction Kit Ver.3.0）、TaKaRa One Step RNA PCR Kit （AMV）、Premix Taq酶、DNA Marker DL 2 000、pMD18-T Vector、感受態(tài)細(xì)胞制備試劑為寶生物工程（大連）有限公司產(chǎn)品；DNA凝膠回收試劑盒、小量柱式質(zhì)粒純化試劑盒為愛思進(jìn)生物技術(shù)（杭州）有限公司及寶生物工程（大連）有限公司產(chǎn)品；氯仿、異丙醇采用分析純?cè)噭?/p>

1.2方法

1.2.1總RNA提取、H5/N1亞型RT-PCR及多重RT-PCR 按照試劑盒提供的操作手冊(cè)，自咽喉及泄殖腔拭子樣品病毒裂解液和滅活的禽流感H5N1、H9N2亞型病毒樣品（陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照）中提取總RNA，采用課題組已建立的H5/N1亞型特異性RT-PCR及多重RT-PCR進(jìn)行檢測(cè)［11］。

1.2.2NA基因的擴(kuò)增、純化 采用課題組已建立的方法［12］，自多重RT-PCR陽(yáng)性核酸樣品中擴(kuò)增病毒NA基因。NA引物序列如下：上游引物：5′-CACCATGAATCCAAATAAGAAGA-3′；下游引物：5′-CTACTTGTCAATGGTGAATGG-3′。反應(yīng)條件：50℃30min，94℃2min；95℃15s，42℃30s，68℃2min，35個(gè)循環(huán)；68℃10min；產(chǎn)物于4℃或-20℃保存。對(duì)RT-PCR產(chǎn)物進(jìn)行凝膠切割純化，電泳分析定量后稀釋至50ng/μL。

1.2.3重組質(zhì)粒構(gòu)建和鑒定 取1μL純化產(chǎn)物與1μL pMD18-T載體（50ng/μL）進(jìn)行連接反應(yīng)，連接產(chǎn)物10μL加入到100μL DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，涂布于0.1mg/mL Ampcilin抗性平板，37℃過夜培養(yǎng)，經(jīng)PCR對(duì)單個(gè)菌落進(jìn)行鑒定。陽(yáng)性菌落增殖培養(yǎng)后提取質(zhì)粒，送深圳華大基因科技有限公司測(cè)序。

1.2.4序列比對(duì)、同源性及系統(tǒng)進(jìn)化分析 采用DNA Man、MEGA6分子生物學(xué)軟件進(jìn)行序列比對(duì)、同源性及系統(tǒng)進(jìn)化分析。

2　結(jié)果

2.1H5/N1亞型RT-PCR及多重RT-PCR檢測(cè)

從1 500份家禽和野禽咽喉及泄殖腔拭子樣品中檢出禽流感H5N1亞型禽流感病毒陽(yáng)性樣品60份，均為家禽樣品，其中中越邊境檢出陽(yáng)性39份（雞23份、鴨16份，陽(yáng)性率分別為6.22%、4.32%），中緬邊境檢出陽(yáng)性21份（雞15份、鴨6份，陽(yáng)性率分別為5.00%、2.00%）。在130份野生鳥類樣品中未檢出陽(yáng)性。

2.2NA基因系統(tǒng)進(jìn)化分析

對(duì)60份禽流感H5N1亞型陽(yáng)性樣品病毒NA基因進(jìn)行測(cè)序，經(jīng)序列比對(duì)，確認(rèn)獲得21個(gè)不同序列（其中2009年1份、2010年6份、2011年4份、2012年3份、2013年5份、2014年2份）。將所獲得的NA序列數(shù)據(jù)與國(guó)內(nèi)外已知代表毒株序列構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，進(jìn)行NA基因進(jìn)化分析。所引用的代表毒株序列來(lái)自文獻(xiàn)和GenBank，毒株信息見表1。2009年-2014年云南邊境H5N1亞型病毒可劃分為4個(gè)不同的進(jìn)化分支，見表2。

2009年-2014年云南境外禽流感病毒H5N1亞型具有遺傳差異，云南境外毒株可能是多進(jìn)化（亞）分支毒株經(jīng)基因重排（重配）變異產(chǎn)生，進(jìn)化分支2.3.4毒株ACKBS11150110和ACKWS56600111與中國(guó)安徽（2005）分離毒株遺傳關(guān)系密切；劃分為進(jìn)化分支1；進(jìn)化分支2.3.4毒株ADKLC91950409、ADKWS21250110、ADKLC34400710、ADKDL56600411、ADKDH21250411、ACKNJ31350112及進(jìn)化分支2.3.2毒株ADKDL7175101、ACKDQ41450411與中國(guó)貴州（2009）、中國(guó)湖南（2009）分離毒株遺傳關(guān)系密切，劃分為進(jìn)化分支2；進(jìn)化分支2.3.2毒株ADKLC76800112與中國(guó)湖南（2008）、中國(guó)香港（2010）、韓國(guó)（2008）分離毒株遺傳關(guān)系密切，劃分為進(jìn)化分支3；進(jìn)化分支2.3.2毒株ADKWS76801010、ACKZT1620160411、ACKBN431112、ACKKX010513、ACKKJ140513、ACKYX590113、ACKYX250113、ACKBS150513及進(jìn)化分支2.3.4毒株ACKLC800114、ACKZT270114與中國(guó)廣西（2009）、中國(guó)河北（2010）分離毒株遺傳關(guān)系密切，可劃分為進(jìn)化分支4（圖1）。

表1　序列比對(duì)及系統(tǒng)發(fā)育分析中引用的H5N1亞型參考毒株Table 1 Reference strains of H5N1subtype viruses used in sequence alignment and phylogenetic analysis

表2　2009年-2014年云南邊境H5N1亞型病毒NA基因進(jìn)化分支表Table 2 Analysis of NA genes of avian influenza H5N1subtype viruses in the border of Yunnan province during 2009to 2014

2.3NA基因氨基酸序列比對(duì)分析

所測(cè)的21份云南邊境禽流感病毒H5N1陽(yáng)性樣品病毒NA基因推導(dǎo)其編碼的氨基酸序列，并與代表毒株進(jìn)行序列比對(duì)分析，結(jié)果顯示，所有毒株NA蛋白在5、95、386aa位點(diǎn)存在氨基酸替代，分別由Q→K、S→R/K、S→EN；另外，進(jìn)化分支1陽(yáng)性樣品病毒NA基因在396aa（I→T）位存在氨基酸替代，；進(jìn)化分支2陽(yáng)性樣品病毒NA基因8（I→M）、38（I→F）、42（N→V）、259（E→K）、346（V→I）、364 （S→G）、389（V→M）、396aa（I→T）位存在氨基酸替代，；進(jìn)化分支3陽(yáng)性樣品病毒NA基因163（V→M）、258（M→I）、346aa（V→I）位存在氨基酸替代；進(jìn)化分支4陽(yáng)性樣品病毒NA基因8（I→V）、42（N →T）、163（V→I）、192（T→I）、240（T→A）、258（M →IV）、304（V→I）、389aa（V→M）位存在氨基酸替代（表3）。

圖1　云南邊境禽流感病毒H5N1亞型NA基因系統(tǒng)發(fā)育分析Fig.1 Phylogenetic analysis based on NA genes of H5N1 viruses from boundary of Yunnan province

2.4NA潛在糖基化位點(diǎn)比對(duì)分析

H5N1亞型禽流感原型毒株（AGSGD196，Clade 0）NA蛋白存在7個(gè)潛在的糖基化位點(diǎn)，分別位于50-52、58-60、63-65、68-71、88-90、146-148、235-237 aa。云南省禽流感H5N1亞型毒株NA基因測(cè)序結(jié)果表明包含1個(gè)完整的ORF，編碼449個(gè)氨基酸。與原型毒株（AGSGD196，Clade 0）相比，在51-70aa位置缺失，因而均少了4個(gè)潛在糖基化位點(diǎn)，部分肽鏈上有2個(gè)～3個(gè)潛在的糖基化位點(diǎn)，分別位于88-90、146-148、235-237aa位點(diǎn)。NA為糖蛋白，其糖基化位點(diǎn)的數(shù)量和分布區(qū)域的改變可引起病毒抗原性、致病性等生物學(xué)特性的改變。本文所測(cè)陽(yáng)性樣品ACKWS56600111在386-388aa出現(xiàn)一個(gè)新的糖基化位點(diǎn)（NFS），ACKBS46501010、ADKLC36400710、ACKNJ31350112分別在88-90（NSS →NSA）、146-148（NGT→NGI）、235-237aa（NGS→NGP）潛在糖基化位點(diǎn)消失，ACKYX250113由于89位S→P導(dǎo)致88-90aa（NSS→NPS）潛在糖基化位點(diǎn)消失。云南邊境陽(yáng)性樣品病毒NA蛋白糖基化位點(diǎn)存在特有變異，此變異是否引起NA基因生物學(xué)功能及病毒致病性的改變有待進(jìn)一步立項(xiàng)研究。

表3　H5N1病毒NA基因氨基酸替代位點(diǎn)比對(duì)分析Table 3 Alignment of amino acid substitution sites on NA genes of H5N1viruses

3　討論

2009年-2014年云南邊境禽流感病毒H5N1亞型NA基因根據(jù)遺傳關(guān)系可劃分為4個(gè)不同的進(jìn)化分支（1～4），與HA基因系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果相比較，HA基因和NA基因進(jìn)化不同步，HA基因同一進(jìn)化分支（如2.3.2分支）毒株其NA基因可能來(lái)源于不同進(jìn)化分支（進(jìn)化分支2-4），而NA基因同一進(jìn)化分支毒株（如進(jìn)化分支4）其HA基因也可能來(lái)源不同（2.3.2分支和2.3.4分支），表明2009年-2014年云南邊境禽流感病毒H5N1亞型不同毒株間HA、NA基因存在基因重排或基因重配，呈現(xiàn)病原生物多樣性。

NA基因不同進(jìn)化分支毒株某些位點(diǎn)存在特有氨基酸替代或變異，進(jìn)而可能引起病毒NA基因抗原性或生物學(xué)功能的改變，如進(jìn)化分支2陽(yáng)性樣品病毒NA基因在364位點(diǎn)由S→G、396位點(diǎn)由I→T，該變異為HA進(jìn)化分支2.3.4特有的變異；進(jìn)化分支4陽(yáng)性樣品病毒NA基因42位點(diǎn)由N→T、aa240位點(diǎn)由T→A，改變異為HA進(jìn)化分支2.3.2特有的變異；5、95、346、386aa位點(diǎn)變異為進(jìn)化分支2特有的變異，8、163、192aa位點(diǎn)變異為進(jìn)化分支4特有的變異，可作為NA進(jìn)化分支分子序列鑒定的依據(jù)。有研究表明，NA蛋白275aa位氨基酸由組氨酸（H）→酪氨酸（Y）后，變異毒株對(duì)NA抑制劑Oseltamivir（達(dá)菲）類抗病毒藥物有抗性或耐藥性［13］，云南邊境毒株NA aa275位點(diǎn)未發(fā)生變異，說明云南邊境禽流感病毒H5N1亞型對(duì)Oseltamivir（達(dá)菲）類抗病毒藥物可能無(wú)耐藥性，Oseltamivir（達(dá)菲）暫且可作為治療藥物。

NA莖部缺失增強(qiáng)了禽流感病毒的細(xì)胞適應(yīng)性，降低了使子代病毒釋放的解凝能力，可能與現(xiàn)階段禽流感病毒H5N1亞型宿主范圍進(jìn)一步擴(kuò)大有關(guān)［14-16］，Matrosovich M等［17］發(fā)現(xiàn)，NA莖部氨基酸的缺失，可減弱禽流感病毒從細(xì)胞釋放的能力，也是禽流感病毒從野生宿主到家養(yǎng)宿主的適應(yīng)。本文獲得的21株NA基因出現(xiàn)了莖部基因的缺失，從而導(dǎo)致NA頸部氨基酸的缺失，該缺失是否會(huì)真正影響禽流感病毒感染宿主的能力及其釋放，還有待進(jìn)一步研究。

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Evolution Analysis of Neuraminidase Genes of Avian Influenza H5N1 Subtype Viruses in the Outside Borders of Yunnan Province During 2009 to 2014

ZENG Wei1，2，3，LIU Qing-liang1，2，3，KONG Qiang1，2，3，ZHANG Wen-dong2，HU Yuan-yuan5，HU Ting-song3，ZHAO Huan-yun2，DUAN Bo-fang2，QIU Wei3，F(xiàn)AN Quan-shui3，ZHANG Ying-guo2，SONG Jian-ling4，ZHANG Fu-qiang3
（1.Yunnan Agriculture University，Kunming，Yunnan，650223，China；2.Centre for Animal Disease Control and Prevention，Kunming，
Y
unnan，650051，China；3.Centre for Disease Control and Prevention，Chengdu Military Region，Chengdu，Sichuan，610041，China；4.Yunnan Key Laboratory of Tropical and Subtropical Animal Virus Diseases，Kunming，Yunnan，650224，China；5.Yunnan Vocational and Technical College of Agriculture，Kunming，Yunnan，650031，China）

Abstract：To elucidate the molecular variation and evolution characteristics of neuraminidase（NA）genes of avian influenza H5N1subtype viruses in the outside borders of Yunnan province，swab samples were collected from foreign poultry and wild birds in the region and screened by H5/N1subtype-specific multiplex RT-PCR.The NA genes of H5N1viruse from the positive samples were amplified，purified，and cloned into pMD18-T vectors for sequencing.The alignment and phylogenetic analysis were performed with sequences of the known reference strains.60positive samples were found out form 1 500samples.21different of NA sequences were obtained from HA gene from the 60positive samples and can be divided into 4 distinct clades.The NA genes and Hemagglutinin（HA）genes of H5N1viruses from the outside borders of Yunnan province showed different relationship of genetic evolution.Yunnan border strain NA aa275loci did not change，so the mutant strains may have no resistance to neuraminidase inhibitors Oseltamivir（tamiflu）-antiviral drugs.NA subtype H5N1viruses from the outside borders of Yunnan province during 2009 to 2014had genetic divergence，and clade 4strains had becomed the dominant epidemic strains in the region.

Key words：Avian influenza virus；H5N1subtype；neuraminidase；gene

作者簡(jiǎn)介：曾 偉（1989-），男，四川內(nèi)江人，碩士研究生，主要從事分子病毒學(xué)研究。＊通訊作者

基金項(xiàng)目：云南省科技計(jì)劃項(xiàng)目（2012CH002）；國(guó)家公益性行業(yè)專項(xiàng)項(xiàng)目（201103008）；軍隊(duì)科技計(jì)劃項(xiàng)目（CWS12J075、13BJYZ37、A12005）；云南省后備人才基金項(xiàng)目（2009CI061）

收稿日期：2014-12-08

中圖分類號(hào)：S852.659.5

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1007-5038（2015）07-0013-06