宋凱杰，李傳峰，陳宗艷，孟春春，黃云秀，3，李丹丹，劉光清，張淼濤（1.西北農(nóng)林科技大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，陜西楊凌71100；.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所，上海0041；3廣西大學(xué)動物科技學(xué)院，廣西南寧530004）

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鴨Toll樣受體3基因克隆及序列分析

宋凱杰1，2，李傳峰2，陳宗艷2，孟春春2，黃云秀2，3，李丹丹1，2，劉光清2，張淼濤1＊
（1.西北農(nóng)林科技大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，陜西楊凌712100；2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所，上海200241；3廣西大學(xué)動物科技學(xué)院，廣西南寧530004）

摘 要：為研究鴨Toll樣受體3（TLR3）的結(jié)構(gòu)及功能，根據(jù)GenBank中已公布的番鴨TLR3 （JQ910167.1）基因設(shè)計引物，采用RT-PCR從北京鴨外周血單個核細胞中克隆出北京鴨TLR3，命名為duTLR3。利用生物信息學(xué)技術(shù)預(yù)測其結(jié)構(gòu)及功能，研究表明，duTLR3基因開放閱讀框為2 688bp，編碼895個氨基酸，富含17.0%亮氨酸；該分子屬于Ⅰ型跨膜受體，由胞外區(qū)（1-695aa）、跨膜區(qū)（696-718aa）和胞內(nèi)區(qū)（719-895aa）3部分組成，N端含有一個信號肽序列，胞外富含18個亮氨酸重復(fù)序列（LRR），胞內(nèi)含有Toll/IL-1R同源區(qū)結(jié)構(gòu)域。核苷酸序列同源性分析顯示，duTLR3與金定鴨TLR3親緣關(guān)系最接近達到99.6%；與番鴨、鵝、原雞、斑胸草雀的親緣關(guān)系次之，并同屬于禽類分支上；與番鴨、鵝、原雞、斑胸草雀、人、獼猴、狒狒、小鼠、大鼠、豬、牛、羊、貓親緣關(guān)系漸遠；與草魚和鯉魚親緣關(guān)系最遠。北京鴨體內(nèi)組織分布結(jié)果顯示，duTLR3為組成性表達。本研究成功克隆了北京鴨TLR3基因，預(yù)測分析并證實了duTLR3具有典型的TLR家族結(jié)構(gòu)特征，為后期探究TLR3如何識別病毒的RNA及引起下游信號級聯(lián)反應(yīng)奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：北京鴨；TLR3；分子克??；序列分析；結(jié)構(gòu)預(yù)測

Toll樣受體（Toll-like receptors，TLRs）是一類進化上保守的Ⅰ型跨膜受體，包括富含亮氨酸（leucine rich repeats，LRRs）的胞外區(qū)、跨膜區(qū)和胞內(nèi)TIR區(qū)（Toll/interleukin-1receptor）［1］。作為先天性免疫在防御微生物感染的第一道防線，TLRs在檢測病原相關(guān)分子模式（pathogen-associated molecular patterns，PAMPs）方面起重要作用，最終激活適應(yīng)性免疫應(yīng)答。目前，許多畜禽的TLRs基因已被克隆并研究，如牛、羊、雞、鵝、草魚等。番鴨TLR3表達于脾臟、法氏囊、肝、腎、腦、肌肉、心、腸和皮膚［2］。鴨Toll樣受體3（Toll-like receptor 3，TLR3）主要識別病毒dsRNA和人工合成dsRNA類似物聚肌胞苷酸［Poly（I∶C）］，通過結(jié)合TICAM-1（TIR-containing adapter molecule）分子，傳導(dǎo)下游信號，從而激活NFκB和IFN-β啟動子，促使細胞釋放細胞因子如IFN-α、IFN-β和IL-6、IL-12等，激活機體的抗病毒應(yīng)答。

近幾年來，人、鼠Toll樣受體研究取得了重大進展［3］，相比哺乳動物，禽類Toll樣受體研究較為緩慢，特別是鴨Toll樣受體的相關(guān)研究甚少［4］。本研究首次從北京鴨外周血單個核細胞（Peripheral blood mononuclear cells，PBMCs）中克隆出TLR3，并命名為duTLR3，并運用生物信息學(xué)方法分析預(yù)測duTLR3的結(jié)構(gòu)和功能，為深入研究TLR3與PAMPs作用機制奠定理論基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1材料

Trans5α感受態(tài)細胞、pEASY-Blunt5Zero載體為TransGen公司產(chǎn)品；北京鴨（櫻桃谷肉鴨）購自江蘇某鴨廠；Trizol試劑為Invitrogen公司產(chǎn)品；Ex Taq酶為TaKaRa公司產(chǎn)品；M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶、T4連接酶為Promega公司產(chǎn)品；2×Pfu高保真酶為Tiangen公司產(chǎn)品；瓊脂糖凝膠回收試劑盒為BioTake公司產(chǎn)品；鴨外周血淋巴細胞分離液為北京Solarbio Science﹠Technology公司產(chǎn)品。

1.2方法

1.2.1鴨PBMCs的分離 選取4周齡健康肉鴨，以食指和中指按住頭的一側(cè)，用酒精棉球消毒右側(cè)頸靜脈的部位，以拇指輕壓頸根部以使靜脈充血，右手持注射器刺入靜脈取血3mL，加25g/L檸檬酸鈉溶液0.3mL，小心加于3mL的細胞分離液之液面上，以2 000r/min離心（半徑15cm水平轉(zhuǎn)子）15min，此時離心管中由上至下細胞分為4層。第1層為血漿層，第2層為環(huán)狀乳白色淋巴細胞，第3層為透明分離液層，第4層為紅細胞層。收集第2層細胞于15mL離心管中，加入PBS溶液10mL，充分混勻后，2 000r/min室溫離心20min。棄上清，沉淀再次重懸于10mL PBS溶液，2 000r/min室溫離心20min，如此重復(fù)操作2次，棄上清，所得沉淀即為PBMCs。

1.2.2RNA提取及RT-PCR擴增 取分離的PBMCs，根據(jù)Promega公司Trizol試劑使用說明，提取細胞總RNA，值-20℃保存。根據(jù)GenBank中登錄的TLR3序列（JQ910167.1），應(yīng)用Primer 5.0進行引物設(shè)計，由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成引物（表1）。以O(shè)ligo dT和隨機引物進行反轉(zhuǎn)錄，獲得cDNA。以cDNA為模板進行PCR擴增，TLR3-P1F和TLR3-P1R為引物，反應(yīng)條件為P1：94℃3min；94℃30s，50℃30s，72℃90s，35個循環(huán)；72℃10min。TLR3-P2F和TLR3-P2 R為引物，P2：94℃3min；94℃30s，55℃30s，72 ℃80s，35個循環(huán)；72℃10min。融合PCR以P1、P2的PCR產(chǎn)物為模板進行PCR擴增，反應(yīng)條件為：94℃3min；94℃30s，52℃30s，72℃3min，35個循環(huán)；72℃10min。PCR反應(yīng)結(jié)束后，10g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增產(chǎn)物。

表1　RT-PCR引物Table 1 Primers used in RT-PCR

1.2.3目的基因的克隆和測序 按照凝膠試劑回收試劑盒說明書回收目的片段，與pEASY-Blunt 5 Zero載體連接，轉(zhuǎn)化至TransGen5α感受態(tài)細胞中，涂布平板，37℃過夜培養(yǎng)。挑取單個菌落，于含氨芐青霉素抗性的培養(yǎng)基（LB）中37℃過夜，提取質(zhì)粒，經(jīng)PCR初步鑒定出陽性克隆后，交由上海美吉生物公司測序。

1.2.4duTLR3序列的分析及結(jié)構(gòu)預(yù)測 將基因測序結(jié)果與GenBank中登錄的相關(guān)序列進行Blast，用DNA Star分析基因序列同源性后利用MEGA 6.0分析其遺傳演化關(guān)系，同時應(yīng)用SMART軟件預(yù)測其結(jié)構(gòu)域，采用TMHMM Server v 2.0分析其跨膜區(qū)，用SignalP 4.1Server軟件分析其信號肽。

1.2.5duTLR3在北京鴨體內(nèi)的組織表達譜 采集2周齡健康北京鴨的肝、心、脾、肺、腎、食道、氣管、腺胃、肌胃、胰腺、十二指腸、空腸、盲腸、法氏囊、胸腺、哈氏腺、腦、皮膚、肌肉以及骨髓等組織及臟器，液氮條件下研磨后，Trizol法提取組織總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，反轉(zhuǎn)錄體系為：RNA（1μg），反轉(zhuǎn)錄酶M-MLV 1μL，5×Reaction buffer 5μL，核酶抑制劑RRI 1μL，dNTP mix（10mmol/L）1μL，隨機引物2μL，補足無核酶水至25μL體系。渦旋混合后37℃水浴條件下，反應(yīng)1h，85℃、15min滅活反轉(zhuǎn)錄酶。以上述各組織的cDNA為模板，進行PCR反應(yīng)，體系為：cDNA 2μL，TLR3保守區(qū)引物對idTLR3F/R（10μM）各1μL，2×Ex Taq Mix 10μL，ddH2O 6μL，共20μL，反應(yīng)條件為：94℃3min；94℃30s，55℃30s，72℃30s，35個循環(huán)；72℃5min。同時設(shè)立內(nèi)參對照，內(nèi)參引物對β-actin F/R，反應(yīng)條件和體系同上。PCR反應(yīng)結(jié)束后，10g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增產(chǎn)物，并回收目的片段，送測序公司鑒定。

2　結(jié)果

2.1PBMCs總RNA提取結(jié)果

RNA電泳結(jié)果顯示為3條帶（圖1），證明RNA提取較完整。

圖1　外周血單個核細胞總RNA電泳Fig.1 Electrophoresis of total RNA in PBMC

2.2DuTLR3不同基因片段RT-PCR擴增結(jié)果

由于duTLR3基因較長，采用RT-PCR一次性擴增全長基因難度較大，所以分兩段擴增。PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果與預(yù)期大小相一致（圖2）。

圖2　duTLR3不同基因片段PCR擴增結(jié)果Fig.2 PCR amplification of different fragments of duTLR3

2.3duTLR3基因克隆初步鑒定結(jié)果

將OverLap PCR產(chǎn)物連接至pEASY-Blunt 5 Zero載體，菌液PCR鑒定。得到的外源片段大小與OverLap PCR擴增所得到的目的片段大小一致（圖3），證明目的基因已經(jīng)成功克隆至pEASYBlunt T5Zero載體中。

2.4duTLR3基因測序結(jié)果分析

得到的測序結(jié)果與GenBank中登錄的TLR3相關(guān)序列進行Blast比較，與綠頭鴨（KC292270.1）的TLR3同源性最高（99.6%），確定其為TLR3。其開放閱讀框（ORF）為2688bp，編碼895個氨基酸。

2.5duTLR3基本理化性質(zhì)分析

擴增得到的duTLR3基因編碼區(qū)全長為2 688bp（GenBank登錄號：KM434239），并通過http：//web.expasy.org/protparam在線軟件對其進行基本理化性質(zhì)分析。結(jié)果顯示，duTLR3編碼895個氨基酸，分子質(zhì)量為102.28ku，理論等電點為8.2。氨基酸組成中，正電荷殘基為85個，負電荷殘基為80個，整個蛋白帶正電荷。蛋白不穩(wěn)定系數(shù)為42.42，提示該蛋白可能為不穩(wěn)定蛋白。

圖3　pEASY-T5-duTLR3重組質(zhì)粒菌液PCR鑒定Fig.3 PCR identification of pEASY-T5-duTLR3recombinant plasmid

2.6duTLR3基因編碼產(chǎn)物的親水性、疏水性、柔韌性及抗原性預(yù)測

用DNA Star軟件子程序Prostean對duTLR3基因編碼產(chǎn)物的親、疏水性，柔韌性及抗原性進行預(yù)測，由圖4可知，duTLR3基因親水性殘基所占比例大于疏水性殘基，因此推測其編碼蛋白整體表現(xiàn)為親水性，柔韌性區(qū)域分布相對均勻?？乖砦粎^(qū)域較大，兩段相對較為密集，中間次之；與柔韌性區(qū)域出現(xiàn)較多重疊區(qū)，這些區(qū)域易于變性，便于抗原、抗體自由結(jié)合，可能是抗原位點的結(jié)合區(qū)。

2.7duTLR3蛋白二級結(jié)構(gòu)、跨膜區(qū)、結(jié)構(gòu)域及信號肽預(yù)測

圖4　北京鴨TLR3基因親水性、柔韌性及抗原性的預(yù)測結(jié)果Fig.4 Prediction of hydrophilicity，flexibility，surface probability and antigenicity of TLR3protein in Peking duck

用在線軟件SSPro 4.0（http：//download.igb. uci.edu/sspro4.html）預(yù)測蛋白的二級結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)無規(guī)則卷曲占62.5%，α螺旋占21.0%，β折疊占16.5%（圖5）；SMART軟件（http：//smart.emblheidelberg.de/）預(yù)測其結(jié)構(gòu)域，發(fā)現(xiàn)含有18個LRR，1個LRRNT、1個LRRCT、1個TIR區(qū)，1個跨膜區(qū)，1個信號肽區(qū)（圖6）；應(yīng)用TMHMM Server v.2.0（http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）分析其跨膜區(qū)，由胞外區(qū)（1-695aa）、跨膜區(qū)（696-718aa）和胞內(nèi)區(qū)（719-896aa）3部分組成（圖7）。用SignalP 4.1Server軟件（http：//www.cbs. dtu.dk/services/SignalP/）預(yù)測其信號肽，結(jié)果發(fā)現(xiàn)信號肽位于N端1-26氨基酸（圖8）。因此，鴨的TLR3蛋白為跨膜蛋白，這與目前已知TLR家族的所共成員一致。

2.8duTLR3基因及其編碼氨基酸同源性分析

運用DNA Star軟件分別與人、獼猴、狒狒、小鼠、大鼠、豬、牛、羊、雞、鵝、番鴨、斑胸草雀、貓、草魚、鯉魚基因序列進行同源性分析，結(jié)果顯示duTLR3與其他鴨的序列同源性達98%～99.6%，與鵝的同源性達96.8%，與雞的同源性達89.5%，與斑胸草雀的同源性為87.6%，與牛、羊、豬、人、獼猴、狒狒、小鼠、大鼠、貓的同源性分別為66.4%、67.0%、67.1%、67.6%、66.9%、67.4%、64.3%、64.1%、67.4%，與草魚和鯉魚的同源性最低，為54.8%、54.3%同樣對其推導(dǎo)的氨基酸序列進行同源性分析，結(jié)果顯示鴨物種相比較，同源性很高，其中與綠頭鴨的同源性高達99.6%，只在239、462、685、709aa共4處存在突變；與番鴨和鵝的同源性次之，為97.1%、92.1%；與雞的同源性為86.4%；與斑胸草雀的同源性為83.2%；與人、獼猴、狒狒、小鼠、大鼠、豬、牛、羊、貓同源性分別為62.3%、61.5%、62.4%、60.0%、54.8%、53.5%、61.7%、77.4%、62.3%；與草魚和鯉魚的氨基酸同源性最低為48.5%、47.4%（表2）。

圖5　北京鴨TLR3蛋白分子二級結(jié)構(gòu)預(yù)測Fig.5 Prediction of secondary structure of TLR3protein in Peking duck

圖6　北京鴨TLR3蛋白分子結(jié)構(gòu)域預(yù)測Fig.6 Prediction of molecular structural domain of TLR3protein in Peking duck

圖7　北京鴨TLR3蛋白跨膜區(qū)預(yù)測Fig.7 Prediction of transmembrane helices of TLR3protein in Peking duck

圖8　北京鴨TLR3蛋白信號肽位置預(yù)測Fig.8 Prediction of signal peptide cleavage sites in amino acid sequences fromPeking duck TLR3protein

表2　鴨與其他物種TLR3基因（右上）和氨基酸序列（左下）同源比對Table 2 Homology comparison of TLR3nucleotide sequences（up right）and amino acid sequences（down left）in duck and other vertebrates

2.9duTLR3基因遺傳進化樹的構(gòu)建

應(yīng)用MEGA 6.0軟件Neighbor-Joining法重復(fù)1 000次，將獲得的17條TLR3基因序列構(gòu)建Bootstrap驗證的系統(tǒng)遺傳進化樹，其基因遺傳進化樹結(jié)果顯示，北京鴨與番鴨、綠頭鴨的親緣關(guān)系最近，并與雞、鵝、斑胸草雀處于禽類節(jié)支，人、獼猴、狒狒、小鼠、大鼠、豬、牛、羊、貓等哺乳動物構(gòu)成一個分支，草魚和鯉魚形成一個遺傳距離較遠的魚類分支（圖9）。

2.10duTLR3在北京鴨體內(nèi)組織分布

結(jié)果見圖10。取各組織的PCR產(chǎn)物，以β-actin為內(nèi)參對照，核酸電泳檢測發(fā)現(xiàn)，duTLR3組成性表達，廣泛分布各個組織臟器，其中在胸腺、哈氏腺、骨髓、腦、皮膚、肌肉等高豐度度表達；在肝、心、脾、肺、腎、食道和氣管適度表達；在腺胃、肌胃、胰腺、十二指腸、空腸、盲腸和法氏囊低豐度表達（圖10）。

圖9　鴨TLR3（KM434239）與其他物種間的基因序列遺傳進化樹Fig.9 Phylogentic trees between Peking duck and different species based on nucleotide sequences of TLR3（KM434239）

圖10　北京鴨duTLR3組織分布圖Fig.10 Tissue distribution of duTLR3in Peking duck

3　討論

TLRs是天然免疫識別受體家族一員，能夠識別PAMPs，引起抗微生物免疫應(yīng)答。TLRs通過識別脂多糖（LPS）、脂肽、鞭毛蛋白、dsRNA或CpG DNA基序等PAMPs在激發(fā)宿主免疫應(yīng)答中發(fā)揮重要作用［5］。TLRs表達于特定的細胞區(qū)室，TLR1、TLR2、TLR4、TLR5、TLR6和TLR11（僅小鼠）表達于細胞表面，而TLR3、TLR7、TLR8和TLR9表達于細胞內(nèi)囊泡中，如內(nèi)體膜和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜［6］。TLR3識別dsRNA，受體活化后激活NF-kB啟動子和引起Ⅰ型干擾素的產(chǎn)生。

目前，對人、鼠的TLRs研究較深入，家禽的TLRs分子結(jié)構(gòu)及功能研究較少，對雞的Toll樣受體功能研究發(fā)現(xiàn)，chTLR表達量與一些體病原感染有關(guān)［7-9］。比較而言，鴨的TLRs研究還未引起關(guān)注。近年來一些家禽的TLRs逐漸被克隆，雞TLR3、鵝TLR3及鴨TLR2、鴨TLR4的克隆相繼有文獻報道［10-13］，但是對鴨的TLR3功能研究很少。鴨科（Anatidae）總共有44屬（Anas），其中北京鴨位列于鴨屬（Anas）的綠頭鴨（Anas platyrhynchos）家族，而番鴨位列于棲鴨屬（Cairina）的疣鼻棲鴨（Cairina moschata）家族，番鴨的TLR3已經(jīng)被克隆出來，且健康番鴨攻禽流感病毒H5N1亞型后，腦組織TLR3的表達量顯著提高［2］。

本研究首次從北京鴨外周血單個核細胞中成功克隆出TLR3，大小為2 688bp，含一個完整的開放閱讀框（ORF），共編碼895氨基酸。鴨組織表達譜分析表明，duTLR3組成性表達，廣泛分布與機體的各個組織器官。利用生物信息學(xué)相關(guān)軟件對所得序列進行了分析，發(fā)現(xiàn)北京鴨、金定鴨和番鴨等鴨物種內(nèi)，核苷酸序列與氨基酸序列高度保守，推導(dǎo)氨基酸序列與金定鴨序列同源性99.6%，僅有4個氨基酸差異，主要位于胞外區(qū)和跨膜區(qū)，胞內(nèi)區(qū)嚴格保守，與番鴨氨基酸序列同源性為97.1%，有26個氨基酸突變，其中25個突變處于胞外區(qū)，1個突變位于TLR區(qū)，這可能與胞內(nèi)區(qū)起信號轉(zhuǎn)導(dǎo)功能而胞外區(qū)負責識別PAMPs有關(guān)。進化樹分析表明TLR3隨物種差異不同處于不同分支上，且哺乳動物、禽類、魚類3個分支明顯，說明TLR3具有較大的種屬特異性，而且同物種內(nèi)TLR3也有一定差異，這提示TLR3在病原識別、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及引起機體免疫應(yīng)答中具有生物多樣性，TLRs的多態(tài)性可能對宿主抗病原的應(yīng)答有深遠影響，且與對疾病的抗性和易感性相關(guān)［14-15］，因此亟待深入開展對鴨TLR3結(jié)構(gòu)與功能的研究。本研究對于揭示dsRNA病毒的感染機理、病毒跨物種傳播機制及疾病防控等方面有重要理論價值。

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Cloning and Sequence Analysis of TLR3 Gene in Peking Duck

SONG Kai-jie1，2，LI Chuan-feng2，CHEN Zong-yan2，MENG Chun-chun2，HUANG Yun-xiu2，3，LI Dan-dan1，2，LIU Guang-qing2，ZHANG Miao-tao1
（1.College of Veterinary Medcine，Northwest A&F University，Yangling，Shaanxi，712100，China；2.Shanghai Veterinary
Research Institute，Chinaese Academy of Argricular Science，Shanghai，200241，China；3.College of Animal Sciences and Technology，Guangxi University，Nanning，Guangxi，530004，China）

Abstract：To research the structure and function of TLR3in Peking duck，according to the published Cairina moschata TLR3gene sequence in the GenBank（JQ910167.1），the primers were designed.Peking duck TLR3（named duTLR3）gene was cloned from peripheral blood mononuclear cell of duck by using RT-PCR，and the structure and function were predicted by utilizing bioinformatics technology.The results of sequence analysis showed that the length of cloned TLR3cDNA is 2688bp，including a complete open reading frame（ORF），it encodes a peptide of 895amino acids，which is rich of 17.0%leucine.Toll-like receptor 3（duTLR3）is typeⅠtransmembrane receptor，consisting of an extracellular domain（1-695aa），a transmembrane domain（696-718aa）and an intracellular domain（719-895aa）.Furthermore there is a signal peptide in its N terminal besides its extracellular region with 18 leucine rich repeats（LRR）while its intracellular region has a Toll/interleukin-1receptor（TIR）domain.Nucleotide sequence homology analysis showed that Peking duck has higher homology with Anas latyrhynchos（XM-005008981.1）up to 99.6%，the homology of nucleotide sequence of duTLR3with those of Cairina moschata，Anser anser，Gallus，Taeniopygia guttata，is much higher than that of Homo sapiens.Macaca mulatta，Papio Anubis，Mus musculus，Rattus norvegicus，Sus scrofa，Bos taurus，Ovis aries，F(xiàn)elis catus，Ctenopharyngodon idella and Cyprinus carpio being the lower homology than duTLR3.duTLR3is constitutively expressed in all tissues of Peking duck.The results showed that duTLR3gene was cloned successfully and was predicted with characteristics of typical structure of TLR family.It laied a solid foundation on researching about how TLR3recognizes virus and activates downstream signaling cascades.

Key words：TLR3of Peking duck；molecular Cloning；sequence analysis；structure prediction

作者簡介：宋凱杰（1987-），男，河北邢臺人，碩士研究生，主要從事動物病毒分子生物學(xué)研究。＊通訊作者

基金項目：公益性農(nóng)業(yè)科研專項項目（201003012）；上海市科委創(chuàng)新計劃項目（13391901602）

收稿日期：2014-12-18

中圖分類號：Q78；S858.32

文獻標識碼：A

文章編號：1007-5038（2015）07-0022-07