邱先帥，張　浩，肖熹玉，任常寶，唐兆新，＊（.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，廣東廣州5064；.肇慶大華農(nóng)生物藥品有限公司，廣東肇慶5638）

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N-乙酰半胱氨酸對(duì)犬細(xì)小病毒誘導(dǎo)的MDCK細(xì)胞凋亡及活性氧的影響

邱先帥1，張浩1，肖熹玉1，任常寶2，唐兆新1，2＊
（1.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，廣東廣州510642；2.肇慶大華農(nóng)生物藥品有限公司，廣東肇慶526238）

摘 要：為探討N-乙酰半胱氨酸（25μg/mL）對(duì)犬細(xì)小病毒侵染MDCK細(xì)胞的保護(hù)作用，采用噻唑蘭比色法來(lái)檢測(cè)NAC對(duì)染毒MDCK細(xì)胞增殖率的影響，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)NAC對(duì)染毒MDCK細(xì)胞凋亡率及活性氧ROS水平。結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，染毒組細(xì)胞增殖顯著下降（P＜0.05），而NAC組細(xì)胞增殖顯著高于攻毒組（P＜0.05）；染毒組細(xì)胞凋亡率顯著上升，胞內(nèi)ROS水平顯著升高（P＜0.05），呈時(shí)間-效應(yīng)關(guān)系，但NAC組明顯減輕上述情況。NAC可通過(guò)降低ROS的產(chǎn)生從而改善染毒的MDCK細(xì)胞凋亡，對(duì)細(xì)胞起到保護(hù)作用。

關(guān)鍵詞：犬細(xì)小病毒；N-乙酰半胱氨酸；增殖率；細(xì)胞凋亡；活性氧

近年來(lái)，寵物犬的數(shù)量逐年遞增，對(duì)犬細(xì)小病毒的防治還是以弱毒苗免疫為主，但其效果越來(lái)越差，給犬細(xì)小病毒的防治帶來(lái)一定壓力［1］。犬細(xì)小病毒（Canine parvovirus，CPV）是細(xì)小病毒科，細(xì)小病毒屬的單鏈DNA病毒，以出血性腸炎、脫水和心肌炎等為主要癥狀，該病首次在美國(guó)發(fā)現(xiàn)，是目前影響?zhàn)B犬業(yè)和寵物業(yè)健康發(fā)展的重要疫病之一，發(fā)病率高達(dá)100%［2-4］。體外研究表明，CPV 能在體外培養(yǎng)的犬細(xì)胞和貓細(xì)胞中感染，如犬腎細(xì)胞（MDCK）。犬細(xì)小病毒侵入細(xì)胞后，利用細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)進(jìn)行自身復(fù)制，刺激宿主細(xì)胞，使細(xì)胞內(nèi)活性氧含量增加，過(guò)量的活性氧對(duì)細(xì)胞內(nèi)線粒體造成結(jié)構(gòu)和功能性的氧化損傷，激發(fā)細(xì)胞凋亡程序，從而引起細(xì)胞凋亡［5］。N-乙酰半胱氨酸（N-acetylcysteine，NAC）是一種抗氧化劑，作為半胱氨酸的衍生物，具有較強(qiáng)的抗氧化功能、干擾自由基生成、抗細(xì)胞凋亡等作用［6-7］，從而起到保護(hù)細(xì)胞作用。本研究通過(guò)建立犬細(xì)小病毒侵染MDCK細(xì)胞模型，觀察NAC對(duì)病毒引起的細(xì)胞凋亡的抑制作用。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1細(xì)胞和病毒 犬細(xì)小病毒由肇慶大華農(nóng)生物藥業(yè)有限公司保存，MDCK細(xì)胞為肇慶大華農(nóng)生物藥業(yè)有限公司產(chǎn)品。

1.1.2試劑及相關(guān)材料 DMEM培養(yǎng)基、2.5g/L胰酶-EDTA溶液為GIBCO公司產(chǎn)品；胎牛血清為Hyclone公司產(chǎn)品；噻唑蘭、維生素C、N-乙酰半胱氨酸為Sigma公司產(chǎn)品；活性氧試劑盒為凱基生物公司產(chǎn)品；Annexin V-FITC/PI試劑盒為美國(guó)BD公司產(chǎn)品。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)及攻毒 用含100mL/L胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，在37℃、體積分?jǐn)?shù)為5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)MDCK細(xì)胞，待細(xì)胞長(zhǎng)滿單層后，用2.5g/L胰蛋白酶進(jìn)行消化，鏡下觀察，細(xì)胞收縮變圓后棄去胰酶，加入培養(yǎng)液輕輕吹打細(xì)胞，1∶6進(jìn)行傳代，傳3代穩(wěn)定后進(jìn)行試驗(yàn)。試驗(yàn)分組：正常對(duì)照組，以DMEM+100mL/L FBS完全培養(yǎng)液培養(yǎng)；病毒組，按培養(yǎng)液量的100g/L將犬細(xì)小病毒接種于細(xì)胞；試驗(yàn)組，以10%接毒量培養(yǎng)24h后換2%維持液事先配好的25μg/mL NAC繼續(xù)培養(yǎng)。

1.2.2細(xì)胞增殖測(cè)定 常規(guī)消化MDCK細(xì)胞，通過(guò)細(xì)胞計(jì)數(shù)調(diào)至細(xì)胞數(shù)為1×106個(gè)/mL，同步接毒接入96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔100μL，24h長(zhǎng)滿單層后，棄去孔內(nèi)培養(yǎng)液，細(xì)胞對(duì)照組和病毒組加100μL 2%維持液、試驗(yàn)組加100μL NAC，每個(gè)組重復(fù)4孔，分別培養(yǎng)24、48h后，加入20μL/孔MTT試劑，孵育4h后棄去，加入150μL/孔二甲基亞砜充分溶解，于490nm波長(zhǎng)處測(cè)定OD值。

1.2.3MDCK細(xì)胞凋亡率的測(cè)定 將MDCK細(xì)胞常規(guī)消化接種于6孔板（1×106個(gè)/mL），同步接毒培養(yǎng)24h后，進(jìn)行試驗(yàn)分組，分別于24h、48h消化收集細(xì)胞于離心管中，4℃、1 500r/min離心5min，用4℃PBS洗兩次后，按Annexin V-FITC/ PI試劑盒說(shuō)明書(shū)，將細(xì)胞重懸于500μL 1×Binding buffer，加入5μL的FITC和5μL的PI輕輕混勻，于室溫避光孵育15min，經(jīng)流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)。1.2.4 MDCK細(xì)胞活性氧含量的測(cè)定 常規(guī)方法消化收集細(xì)胞于離心管內(nèi)，4℃、1 500r/min離心5min。按照1∶1 000用無(wú)血清培養(yǎng)液稀釋DCFH-DA，使終濃度為10μmol/L。去除離心管內(nèi)細(xì)胞培養(yǎng)液，加入1mL稀釋好的DCFH-DA，37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育20min，用無(wú)血清細(xì)胞培養(yǎng)液洗滌細(xì)胞3次，以充分去除未進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的DCFHDA，流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

1.2.5統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 數(shù)據(jù)用-x±SD表示，用SPSS統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行單因素方差分析。

2　結(jié)果

2.1NAC對(duì)攻毒的MDCK細(xì)胞增殖的影響

如圖1所示，犬細(xì)小病毒分別染毒24h、48h后，病毒組細(xì)胞的OD值顯著小于對(duì)照組細(xì)胞（P＜0.05），且呈時(shí)間-效應(yīng)關(guān)系，說(shuō)明染毒后病毒明顯抑制MDCK細(xì)胞增殖，而添加NAC組的細(xì)胞與染毒組相比，OD值顯著增高（P＜0.05），抑制作用明顯改善。

圖1　不同試驗(yàn)組對(duì)MDCK細(xì)胞增殖的影響Fig.1 The effects of different level groups on MDCK cell proliferation

2.2NAC對(duì)攻毒的MDCK細(xì)胞凋亡率測(cè)定

如表1所示，24h后，與對(duì)照組相比，病毒組凋亡率明顯高于對(duì)照組（P＜0.05），說(shuō)明犬細(xì)小病毒引起MDCK細(xì)胞凋亡，而NAC試驗(yàn)組明顯低于病毒組（P＜0.05），顯著抑制了細(xì)胞的凋亡，從而起到保護(hù)細(xì)胞作用；同樣，48h也是如此。各處理組細(xì)胞隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，凋亡率均明顯增加，且呈一定時(shí)間-效應(yīng)關(guān)系。

表1　不同試驗(yàn)組對(duì)MDCK細(xì)胞凋亡測(cè)定的影響Table 1 The effects of different level groups on MDCK cell apoptosis assay　%

2.3NAC對(duì)攻毒的MDCK細(xì)胞內(nèi)ROS水平影響

如表2所示，各處理組的MDCK細(xì)胞均隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，胞內(nèi)活性氧水平均逐漸升高，呈一定時(shí)間—效應(yīng)關(guān)系。各時(shí)間段內(nèi)，病毒組MDCK細(xì)胞內(nèi)ROS水平明顯高于對(duì)照組（P＜0.05），而NAC試驗(yàn)組細(xì)胞內(nèi)ROS水平和病毒組相比，細(xì)胞ROS水平明顯降低（P＜0.05），說(shuō)明NAC抑制病毒引起的細(xì)胞內(nèi)活性氧升高。

表2　不同試驗(yàn)組對(duì)MDCK細(xì)胞內(nèi)ROS測(cè)定的影響Table 2 The effects of different level groups on MDCK cell ROS assay　%

3　討論

細(xì)胞凋亡是細(xì)胞本身自我調(diào)節(jié)的、由基因控制、自發(fā)性的一種程序性死亡，它可以由自身產(chǎn)生，也可以由一系列生理或病理的刺激誘導(dǎo)產(chǎn)生［8］，其中病毒感染是誘導(dǎo)因素之一。它和壞死性死亡是截然不同的兩種死亡形式。本試驗(yàn)用MTT對(duì)病毒組細(xì)胞進(jìn)行存活率測(cè)定發(fā)現(xiàn)，攻毒細(xì)胞的OD值顯著小于對(duì)照組，存活率明顯下降，此時(shí)細(xì)胞損傷包括細(xì)胞凋亡、細(xì)胞死亡、自噬式死亡等，細(xì)胞凋亡只是其中一種形式，而NAC試驗(yàn)組的OD值明顯比攻毒組高，說(shuō)明NAC對(duì)病毒組細(xì)胞的死亡有一定改善。研究表明，越來(lái)越多的病毒感染可以使宿主細(xì)胞產(chǎn)生凋亡［9］。杜林林等［10］發(fā)現(xiàn)，犬細(xì)小病毒能誘導(dǎo)腸黏膜細(xì)胞凋亡及復(fù)方苦芩對(duì)其抑制作用。本試驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，病毒組細(xì)胞隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，凋亡率逐漸升高，與對(duì)照組相比呈顯著性差異（P＜0.05），說(shuō)明犬細(xì)小病毒能夠明顯誘導(dǎo)MDCK細(xì)胞凋亡，而25μg/mL NAC試驗(yàn)組的細(xì)胞凋亡率明顯比病毒組高（P＜0.05），提示一定濃度的NAC具有拮抗病毒誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用。

有關(guān)病毒引起細(xì)胞凋亡機(jī)制的觀點(diǎn)很多，而且在不同的細(xì)胞中，引起的細(xì)胞凋亡不完全一致［11］。線粒體途徑是細(xì)胞凋亡的一個(gè)重要途徑，線粒體是細(xì)胞活動(dòng)最為重要的一個(gè)細(xì)胞器，它包含了一些與細(xì)胞凋亡密切相關(guān)的物質(zhì)，如活性氧自由基（reactive oxygen species，ROS）、細(xì)胞色素C等。過(guò)多的ROS會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞DNA損傷、線粒體廣泛性氧化損傷及影響信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，從而引起細(xì)胞凋亡［12］。本試驗(yàn)結(jié)果表明，24h和48h時(shí)，各病毒組與對(duì)照組相比，細(xì)胞內(nèi)ROS水平顯著升高（P＜0.05），且呈現(xiàn)時(shí)間-效應(yīng)關(guān)系，而NAC試驗(yàn)組則有明顯的抑制ROS升高作用。試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)細(xì)胞凋亡率與細(xì)胞內(nèi)ROS水平呈正相關(guān)，提示犬細(xì)小病毒導(dǎo)致MDCK細(xì)胞凋亡過(guò)程中ROS發(fā)揮了一定作用。

NAC是一種合成抗氧化劑，它是細(xì)胞內(nèi)還原性谷胱甘肽的前體，促進(jìn)谷胱甘肽的合成。NAC具有抗凋亡作用，能夠清除細(xì)胞內(nèi)活性氧自由基，從而干擾凋亡的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)［13］，越來(lái)越多研究［14-16］表明，NAC可抑制多種因素導(dǎo)致的細(xì)胞凋亡，如NAC可明顯抑制由過(guò)氧化氫誘導(dǎo)的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞凋亡，減弱由鎘導(dǎo)致大鼠大腦皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞凋亡及ROS水平，對(duì)活性氧誘導(dǎo)的耳蝸毛細(xì)胞凋亡也有明顯的抑制作用。本試驗(yàn)研究表明，NAC可使犬細(xì)小病毒致MDCK細(xì)胞存活率有升高趨勢(shì)，且差異性顯著，也能夠明顯降低細(xì)胞凋亡率及ROS水平，說(shuō)明NAC可以有效清除犬細(xì)小病毒導(dǎo)致的細(xì)胞內(nèi)過(guò)多的ROS，從一定程度上可以阻止細(xì)胞凋亡的發(fā)生，但其分子機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

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Effects of N-acetylcysteine on Canine Parvovirus Induced Apoptosis and Reactive Oxygen Species of MDCK Cells

QIU Xian-shuai1，ZHANG Hao1，XIAO Xi-yu1，REN Chang-bao2，TANG Zhao-xin1，2
（1.College of Veterinary Medicine，South China Agriculture University，Guangzhou，Guangdong，510642，China；2.Zhaoqing Dahuanong Biology Medcine Co.，Ltd，Zhaoqing，Guangdong，526238，China）

Abstract：To explore the protective effect of N-acetylcysteine（25μg/mL）on canine parvovirus infection in MDCK cells，the proliferation rate of NAC on the infected MDCK cells was measured by MTT assay.The apoptosis rate and reactive oxygen species were detected by flow cytometry.The results showed that the cell proliferation rate of infected group decreased significantly（P＜0.05），compared with the control group，but the rate of NAC group was significantly higher than that of the infected group（P＜0.05）；The apoptotic rate and intracellular ROS levels of infected group was significantly increased（P＜0.05）with a certain time-effect relationship，but the NAC group significantly reduced this situation.Conclusion：NAC obviously protects MDCK cells against canine parvovirus induced apoptosis by reducing ROS.

Key words：Canine parvovirus；N-acetylcysteine；viability；apoptosis；reactive oxygen species

作者簡(jiǎn)介：邱先帥（1988-），女，河南新鄉(xiāng)人，碩士研究生，主要從事獸醫(yī)內(nèi)科學(xué)研究。＊通訊作者

收稿日期：2014-12-24

中圖分類號(hào)：S852.3

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1007-5038（2015）07-0018-04