馮立娟+焦其慶+尹燕雷

摘要：以泰山紅石榴果實為試驗材料，利用逆轉(zhuǎn)錄PCR（RT-PCR）技術擴增出980 bp大小的中間片段，用 3′cDNA 末端快速擴增PCR（RACE PCR）獲得DHQ/SDH基因的3′端，拼接后獲得1 585 bp的cDNA片段。結果表明，該基因含有1 265 bp編碼序列（CDS），編碼421個氨基酸，其氨基酸序列與蘋果（注冊號：XP_008370537.1）、葡萄（注冊號：XP_002270232.1）、白梨（注冊號：XP_009335660.1）的同源性分別為82%、84%、82%；蛋白質(zhì)理論分子質(zhì)量為 133 682.2 u，等電點為5.01，含量最豐富的氨基酸是丙氨酸（Ala）、半胱氨酸（Cys）、甘氨酸（Gly）、蘇氨酸（Thr），具有DHQase I、SDH（AroE）2個保守結構域，為親水性蛋白；二級結構主要由無規(guī)則卷曲（31.12%）、α-螺旋（30.17%）、伸展鏈（24.94%）和β-轉(zhuǎn)角（13.78%）組成；GenBank登錄號為KU133479。

關鍵詞：石榴；DHQ/SDH基因；克隆；序列分析

中圖分類號： S665.401；Q785 文獻標志碼： A 文章編號：1002-1302（2017）01-0026-04

石榴（Punica granatum L.）是一種重要的功能性水果，富含類黃酮、酚酸和鞣花單寧等可溶性酚類物質(zhì)，市場發(fā)展前景廣闊[1]。沒食子酸是石榴果實中重要的酚類物質(zhì)，具有抗腫瘤[2]、抗氧化[3]、抗炎抗菌[4-5]等諸多功效，生物學效應廣泛[6]。莽草酸途徑在植物次生代謝途徑中起到中心作用，可為其他次生代謝途徑提供底物。研究表明，沒食子酸主要通過莽草酸途徑生成的3-脫氫莽草酸代謝生成[7-8]。

脫氫奎尼酸脫氫酶（3-dehydroquinate dehydratase，簡稱DHQ）、莽草酸脫氫酶（shikimate dehydrogenase，簡稱SDH）分別催化莽草酸途徑中的第3、第4步反應，在大多數(shù)微生物中，DHQ、SDH是單功能的，但是在植物中，DHQ、SDH可以融合，形成具有2種功能的酶[9]。3-脫氫奎尼酸脫氫酶（EC4.2.1.10）/莽草酸脫氫酶（EC1.1.1.25）雙功能酶（bifunctional 3-dehydroquinate dehydratase/shikimate dehydrogenase，簡稱DHQ/SDH）能催化3-脫氫奎尼酸脫水生成3-脫氫莽草酸，也能催化3-脫氫莽草酸、莽草酸之間的可逆還原反應，是沒食子酸代謝途徑中的關鍵調(diào)控酶[10]。編碼SDH結構基因aroE的克隆、表達分析和功能鑒定在結核桿菌[11-12]、谷氨酸棒桿菌[13]中已有報道。DHQ/SDH基因cDNA的片段或全長序列已在豌豆[14]、煙草[15]、番茄[16]等植物中被克隆出來，通過全基因組測序推測蘋果、葡萄、白梨、桃等果樹DHD/SDH基因的片段或全長已在GenBank上注冊，但是關于石榴中DHQ/SDH基因的克隆及序列分析等方面的研究在國內(nèi)外尚未見報道。因此，本研究以山東省主栽石榴品種泰山紅為試驗材料，利用逆轉(zhuǎn)錄PCR（RT-PCR）技術克隆DHQ/SDH基因，對其進行生物信息學分析，從而為揭示石榴果實中沒食子酸代謝的分子機制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗于2015年6—9月在山東省果樹研究所進行。以泰山紅石榴果實為試驗材料，將其定植于山東省果樹研究所石榴種質(zhì)資源圃。于幼果期（果實直徑2～3 cm）采集石榴果實，洗凈擦干后，用削皮刀取果皮，在液氮中速凍后放入 -80 ℃ 冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 試驗方法

1.2.1 總RNA提取和cDNA第1鏈的合成 采用RNA Prep Pure Plant Kit[DP441，天根生化科技（北京）有限公司]提取石榴果皮的總RNA，用瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的完整性，用NanoDrop紫外分光光度計測量吸光度，計算RNA純度，即D260 nm/D280 nm值。

以RNA溶液為模板，Oligo（dT）18為引物，根據(jù)cDNA第1鏈合成試劑盒說明書反轉(zhuǎn)錄成cDNA第1鏈（K1622，Thermo Scientific）。

1.2.2 基因中間片段的克隆 根據(jù)已知物種同源序列的保守片段設計兼并引物，進行PCR擴增。預計擴增片段大小為1 000 bp，上游引物DHQ/SDH 1：5′-GCVATGGAGYTVGGRGCTGATT-3′；下游引物DHQ/SDH 2：5′-GTTGTRTTBGCRAGDAYCATVCC-3′。50 μL PCR反應體系：25 μL 2×Ex Taq buffer，1 μL dNTP（10 mmol/L），各1.5 μL上、下游引物，5 μL cDNA，1.0 μL Ex Taq酶，15 μL滅菌蒸餾水。反應步驟：94 ℃ 2 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，35個循環(huán)；72 ℃ 10 min。PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，將目的片段克隆至pMD18-T載體后送生工生物工程（上海）股份有限公司測序，獲得中間片段序列。

1.2.3 3′cDNA末端快速擴增PCR（RACE PCR）獲得基因的3′端序列 根據(jù)獲得的中間片段序列設計2對特異引物，使用SMARTerTM RACE cDNA Amplification Kit（634923，Clontech）試劑盒獲得該基因的3′端序列。

基因特異引物：3′ DHQ/SDH1，5′-TGGTAAACTGTTTGTCGTCATGGGTGC-3′；3′ DHQ/SDH2，5′-GCCAATCGCACATATGACAAAGCCAAA-3′。下游引物為通用引物（UPM）：5′-CTAATACGACTCACTATAGGGCAAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT-3′。首先用引物3′ DHQ/SDH1、UPM進行第1輪擴增，以得到的PCR產(chǎn)物為模板，再用引物3′ DHQ/SDH2、UPM進行第2輪PCR擴增。50 μL PCR反應體系：25 μL 2×Ex Taq buffer，1 μL dNTP（10 mmol/L），各1.5 μL上、下游引物，5 μL cDNA，1.0 μL Ex Taq酶，15 μL滅菌蒸餾水。反應步驟：94 ℃ 2 min；94 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，35個循環(huán)；72 ℃ 10 min。PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，將目的片段克隆至pMD18-T載體上，送生工生物工程（上海）股份有限公司測序，獲得基因的3′端序列。

1.2.4 DHQ/SDH基因的生物信息學分析 分別利用NCBI的BLASTn、BLASTp進行核苷酸、氨基酸序列相似性分析，利用DNAMAN軟件進行多序列比對，DHQ/SDH基因編碼蛋白的理化性質(zhì)采用ProtParam預測，疏水性/親水性采用ProtScale進行預測，利用ExPaSy工具中的SOPMA軟件編碼蛋白的二級結構。

2 結果與分析

2.1 石榴果皮DHQ/SDH基因保守片段的克隆

用天根生化科技（北京）有限公司的RNA Prep Pure Plant Kit提取石榴果皮RNA，以反轉(zhuǎn)錄cDNA為模板，利用設計的兼并引物DHQ/SDH-1、DHQ/SDH-2進行PCR擴增，獲得980 bp大小的DHQ/SDH基因的中間片段（圖1）。Blast比對分析表明，該片段與蘋果（Malus domestica）、葡萄（Vitis vinifera）、白梨（Pyrus bretschneideri）、梅花（Prunus mume）等植物的DHQ/SDH基因有較高的同源性，確認為石榴DHQ/SDH基因保守序列。

2.2 石榴果皮DHQ/SDH基因3′端序列的克隆

根據(jù)獲得的保守序列設計2對特異引物，3′RACE擴增得到701 bp的片段（圖1）。根據(jù)測序結果將保守序列、3′端片段拼接后得到1 585 bp的cDNA片段，該基因含有1 265 bp的編碼序列（CDS），編碼421個氨基酸（圖2），編碼的蛋白具有DHQase I、SDH（AroE）2個保守結構域（圖3）。BLAST分析表明，該基因片段的核苷酸序列與蘋果、葡萄、白梨、桃（Prunus persica）和歐洲大葉楊（Populus trichocarpa）等植物的相似性達到了80%以上。

經(jīng)比對，該基因編碼的氨基酸序列與蘋果（注冊號：XP_008370537.1）、葡萄（注冊號：XP_002270232.1）、白梨（注冊號：XP_009335660.1）、碧桃（注冊號：XP_007207367.1）、梅花（注冊號：XP_008246555.1）、胡楊（Populus euphratica，注冊號：XP_011024056.1）、麻瘋樹（Jatropha curcas，注冊號：XP_012089148.1）、可可（Theobroma cacao，注冊號：XP_007030110.1）和巨桉（Eucalyptus grandis，注冊號：XP_010025117.1）等物種的同源性在80%以上（圖4），表明克隆到的片段為石榴果皮DHQ/SDH基因，GenBank登錄號為KU133479。

2.3 DHQ/SDH基因的生物信息學分析

2.3.1 DHQ/SDH基因編碼蛋白的理化性質(zhì)、疏/親水性分析 利用ExPASy Proteomics Server提供的在線工具Protparam對DHQ/SDH基因編碼蛋白的理化性質(zhì)進行預測，推測該蛋白的分子式為C4970H8326N1616O2088S298，相對分子質(zhì)量為 133 682.2 u，等電點（pI值）為5.01，含量最豐富的氨基酸是丙氨酸（Ala）、半胱氨酸（Cys）、甘氨酸（Gly）、蘇氨酸（Thr），帶正電荷（Asp+Glu）、負電荷（Arg+Lys）的氨基酸數(shù)均為0。該蛋白的不穩(wěn)定系數(shù)為40.76，脂肪系數(shù)為30.82，親水性系數(shù)為0.725。

利用在線分析軟件ProtScale的Kyte andDoolittle算法對DHQ/SDH基因進行疏水/親水性分析表明，DHQ/SDH蛋白存在明顯的疏水區(qū)、親水區(qū)，其中第268位氨基酸疏水/親水值最高，為2.022，第300位氨基酸最低，為-2.556，為親水性蛋白。

2.3.2 DHQ/SDH基因編碼蛋白的二級結構分析 利用SOPMA軟件預測石榴DHQ/SDH基因編碼蛋白二級結構表明，有127個氨基酸參與形成α-螺旋（alpha helix），占總氨基酸數(shù)的30.17%；有58個氨基酸參與形成β-轉(zhuǎn)角（beta turn），占總氨基酸數(shù)的13.78%；有105個氨基酸參與形成延伸鏈（extended strand），占總氨基酸數(shù)的24.94%；有131個氨基酸參與形成無規(guī)則卷曲（random coil），占總氨基酸數(shù)的 31.12%。結果表明，DHQ/SDH基因編碼蛋白的二級結構中含有豐富的α-螺旋、無規(guī)則卷曲結構。

3 討論與結論

DHQ/SDH雙功能酶的優(yōu)點就是在莽草酸途徑中通過限制中間物在競爭途徑中的質(zhì)量而提高代謝物流通的效率[9]。蘋果、白梨、葡萄等果樹上DHQ/SDH基因序列主要通過全基因組測序預測得到，本研究首次利用RT-PCR技術從石榴果皮中分離得到DHQ/SDH基因3′端cDNA序列，是國際上果樹DHQ/SDH基因克隆的一大突破。

氨基酸序列分析表明，石榴DHQ/SDH基因與葡萄、蘋果、白梨的同源性分別為84%、82%、82%，推測石榴 DHQ/SDH 具有其他植物中DHQ/SDH的生物學功能，為進一步揭示DHQ/SDH的功能奠定了理論基礎。DHQ/SDH基因具有DHQase I、SDH （AroE）2個保守結構域，DHQase I具有T細胞免疫球蛋白黏蛋白（T cell imrnunoglobulin domain and mucin domain，簡稱TIM）磷酸結合超家族保守結構域，莽草酸脫氫酶基因AroE蛋白具有shikimate_dh_N、NADB_Rossmann超家族保守結構域，這與Han等在異形水綿上的研究結果[17]一致。

擬南芥只有1種DHQ/SDH基因型[18]，煙草有NtDHQ/SDH1、NtDHQ/SDH2 2種基因型，二者中的任何1個受到RNA干擾（RNAi）的抑制，就能改變脫氫奎尼酸和莽草酸代謝途徑的穩(wěn)定水平[15]。本研究從泰山紅石榴果皮中分離得到1種DHQ/SDH基因型，是否還有其他類型DHQ/SDH基因存在還須繼續(xù)選擇不同石榴品種進行深入研究。

DHQ/SDH的結構與功能研究主要在擬南芥、煙草等模式植物上，隨著分子生物學技術的發(fā)展，不同植物DHQ/SDH基因的功能研究將不斷深入。由于石榴果皮富含酚類、鞣質(zhì)、糖、酸等物質(zhì)，提取高純度、完整的RNA難度較大，本試驗目前提取的RNA純度不能滿足5′RACE的需要，下一步將改進試驗方案，克隆得到DHQ/SDH基因全長cDNA序列。本研究比較不同石榴品種發(fā)育期果實中DHQ/SDH基因的表達與沒食子酸含量的相關關系，為從分子水平揭示石榴果實沒食子酸的代謝機制提供了一定的理論依據(jù)。

參考文獻：

[1]Zhao X E，Yuan Z H，F(xiàn)eng L J，et al. Cloning and expression of anthocyanin biosynthetic genes in red and white pomegranate[J]. Journal of Plant Research，2015，128（4）：687-696.

[2]Schuck A G，Weisburg J H，Esan H，et al. Cytotoxic and proapoptotic activities of gallic acid to human oral cancer HSC-2 cells[J]. Oxidants and Antioxidants in Medical Science，2013，2（4）：265-274.

[3]Qiu X B，Takemura G，Koshiji M，et al. Gallic acid induces vascular smooth muscle cell death via hydroxyl radical production[J]. Heart and Vessels，2000，15（2）：90-99.

[4]Zaidi-Yahiaoui R，Zaidi F，Bessai A A. Influence of gallic and tannic acids on enzymatic activity and growth of Pectobacterium chrysanthemi（Dickeya chrysanthemi bv. chrysanthemi）[J]. African Journal of Biotechnology，2008，7（4）：482-486.

[5]Khalil R S. Influence of gallic acid and catechin polyphenols on probiotic properties of Streptococcus thermophilus CHCC 3534 strain[J]. World Journal of Microbiology and Biotechnology，2010，26（11）：2069-2079.

[6]馮立娟，尹燕雷，招雪晴，等. 石榴沒食子酸代謝與保健功能研究進展[J]. 果樹學報，2014，31（4）：710-716.

[7]Werner R A，Rossmann A，Schwarz C，et al. Biosynthesis of gallic acid in Rhus typhina：discrimination between alternative pathways from natural oxygen isotope abundance[J]. Phytochemistry，2004，65（20）：2809-2813.

[8]Ossipov V，Salminen J P，Ossipova S，et al. Gallic acid and hydrolysable tannins are formed in birch leaves from an intermediate compound of the shikimate pathway[J]. Biochemical Systematics and Ecology，2003，31（1）：3-16.

[9]Singh S A，Christendat D. The DHQ-dehydroshikimate-SDH-shikimate-NADP（H） complex：insights into metabolite transfer in the shikimate pathway[J]. Crystal Growth & Design，2007，7（11）：2153-2160.

[10]Singh S A，Christendat D. Structure of arabidopsis dehydroquinate dehydratase-shikimate dehydrogenase and implications for metabolic channeling in the shikimate pathway[J]. Biochemistry，2006，45（25）：7787-7796.

[11]Magalhes M B，Pereira C P，Basso L A，et al. Cloning and expression of functional shikimate dehydrogenase （EC 1.1.1.25） from Mycobacterium tuberculosis H37Rv[J]. Protein Expression and Purification，2002，26（1）：59-64.

[12]Zhang X L，Zhang S B，Hao F，et al. Expression，purification and properties of shikimate dehydrogenase from Mycobacterium tuberculosis[J]. Journal of Biochemistry and Molecular Biology，2005，38（5）：624-631.

[13]Kubota T，Tanaka Y，Hiraga K，et al. Characterization of shikimate dehydrogenase homologues of Corynebacterium glutamicum[J]. Applied Microbiology and Biotechnology，2013，97（18）：8139-8149.

[14]Deka R K，Anton I A，Dunbar B，et al. The characterisation of the shikimate pathway enzyme dehydroquinase from Pisum sativum[J]. FEBS Letters，1994，349（3）：397-402.

[15]Ding L，Hofius D，Hajirezaei M R，et al. Functional analysis of the essential bifunctional tobacco enzyme 3-dehydroquinate dehydratase/shikimate dehydrogenase in transgenic tobacco plants[J]. Journal of Experimental Botany，2007，58（8）：2053-2067.

[16]Bischoff M，Schaller A，Bieri F，et al. Molecular characterization of tomato 3-dehydroquinate dehydratase-shikimate：NADP oxidoreductase[J]. Plant Physiology，2001，125（4）：1891-1900.

[17]Han J W，Lee K P，Yoon M，et al. Cold stress regulation of a bi-functional 3-dehydroquinate dehydratase/shikimate dehydrogenase （DHQ/SDH）-like gene in the freshwater green alga Spirogyra varians[J]. Botanica Marina，2009，52（2）：178-185.

[18]Tzin V，Galili G. New insights into the shikimate and aromatic amino acids biosynthesis pathways in plants[J]. Molecular Plant，2010，3（6）：956-972.張世勇，王明華，鐘立強，等. 斑點叉尾MSTN基因4個SNP位點及其與生長性狀的相關性[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學，2017，45（1）：30-33.