楊莉等

摘要：以阿勒泰羊?yàn)檠芯繉?duì)象，對(duì)脂肪酸合成酶（FAS）基因、脂蛋白酯酶（LPL）部分編碼區(qū)的cDNA進(jìn)行克隆、測(cè)序，與GenBank中已收錄的其他11種動(dòng)物的FAS、LPL基因序列進(jìn)行同源性分析，并構(gòu)建分子進(jìn)化樹(shù)。結(jié)果顯示，所克隆的FAS、LPL基因與綿羊的基因序列同源性最高，分別為99.61%、100.00%；FAS基因與虎鯨同源性最低，為46.24%；LPL基因與羅非魚(yú)的序列同源性最低，為56.28%。結(jié)果均正確地反映了物種間的進(jìn)化關(guān)系，序列分析結(jié)果為人們進(jìn)一步對(duì)阿勒泰羊脂肪的相關(guān)研究、肉質(zhì)性狀的研究及育種提供了理論基礎(chǔ)，同時(shí)也為阿勒泰羊FAS、LPL基因的生物學(xué)功能、遺傳進(jìn)化研究提供了分子依據(jù)。

關(guān)鍵詞：硬脂酰輔酶A去飽和酶；脂肪酸合成酶；脂蛋白酯酶；序列分析；阿勒泰羊

中圖分類號(hào)： S811.3；Q785文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A文章編號(hào)：1002-1302（2015）09-0043-03

新疆阿勒泰地區(qū)位于中國(guó)西北邊陲，冬季長(zhǎng)達(dá)半年，許多優(yōu)良綿羊品種無(wú)法適應(yīng)阿勒泰地區(qū)異常寒冷的氣候條件，而阿勒泰羊以其全身肌肉豐滿、體型肥碩、尾根附近沉積大量脂肪、耐粗飼、抗寒性強(qiáng)等特點(diǎn)，能夠適應(yīng)阿勒泰地區(qū)異常寒冷的氣候條件，成為當(dāng)?shù)氐膬?yōu)良類群[1]。脂肪酸的合成是由脂肪酸合成酶（fatty acid synthase，F(xiàn)AS）催化乙酰輔酶A和丙二酸單酰輔酶A合成甘油三脂（TAG）[2]，F(xiàn)AS表達(dá)水平的高低能夠直接影響甘油三脂在體內(nèi)的沉積[3]，因此FAS是脂肪酸合成代謝的關(guān)鍵酶。Hsu等分離得到人脂肪酸合成酶代謝調(diào)控基因，發(fā)現(xiàn)人的脂肪酸合成酶基因位于17q25[4]。Kameda等對(duì)鵝脂肪酸合成酶代謝調(diào)控基因作了研究，發(fā)現(xiàn)脂肪酸合成酶代謝調(diào)控基因全序列長(zhǎng)度大約有 50 kb，同時(shí)現(xiàn)已知牛的基因位于19q22、雞的基因位于18號(hào)染色體上[5]。脂蛋白酯酶（lipoprotein lipase，LPL）是機(jī)體脂質(zhì)和脂蛋白代謝的關(guān)鍵酶，是分解循環(huán)脂蛋白中乳糜微粒和極低密度脂蛋白中的甘油三酯，釋放出脂肪酸和甘油的限速酶[6]，作為影響脂肪沉積的一個(gè)重要遺傳標(biāo)記，研究LPL表達(dá)水平對(duì)加快肉品質(zhì)改進(jìn)速度具有重要的意義。本研究對(duì)阿勒泰羊的FAS、LPL基因部分片段進(jìn)行了克隆、測(cè)序，并與已報(bào)道的其他物種的相應(yīng)基因進(jìn)行序列分析，以期在分子水平的基礎(chǔ)上為家畜的改良育種提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料與試劑

選擇新疆福海縣5只健康成年的阿勒泰羊，采集阿勒泰羊頸部肌間脂肪、胸部肌間脂肪、腹部肌間脂肪、腿部肌間脂肪、尾部脂肪、肝臟等6個(gè)部位的組織，立即放入液氮罐速凍，轉(zhuǎn)入-80 ℃冰箱中保存。

TRIzol、DEPC、DNA marker、Taq PCR Master Mix，購(gòu)自天根生物科技服務(wù)有限公司；PrimeScript@RT reagent kit反轉(zhuǎn)錄試劑盒（批號(hào)：RR047A），購(gòu)自TaKaRa公司（批號(hào)：DRR420A）；DNA凝膠回收試劑盒（批號(hào)：DP209-02）、胰蛋白胨、瓊脂粉、瓊脂糖、三氯甲烷、異丙醇、無(wú)水乙醇，購(gòu)自北京華美生物工程公司；感受態(tài)細(xì)胞E.coli DH5α由石河子大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院傳染病實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1目的基因引物設(shè)計(jì)以GenBank中已發(fā)布的綿羊FAS基因（登錄號(hào)：NM_001009254.1）、LPL基因（登錄號(hào)：NM_001009394.1 ）為模版，用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)引物，由北京六合華大基因有限公司合成。FAS基因上游引物：5′-CCTCGGTGCCCGTTGTCTAC-3′；下游引物：5′-TGCTGCTCAAAGGATGTGTC-3′；目的片段長(zhǎng)度為256 bp。LPL基因上游引物：5′-GATTAGCGATTCCTACTTCAGC-3′；下游引物：5′-AGACTTGTCATGGCATTTCAC-3′；目的片段長(zhǎng)度為181 bp。

1.2.2RNA的提取利用TRIzol一步法提取試驗(yàn)樣品的總RNA，瓊脂糖凝膠電泳鑒定RNA的質(zhì)量，于-70 ℃保存?zhèn)溆?。然后依次加入以下試劑? μg RNA、10× Reaction buffer、1 μL MgCl2、1 μL DNase Ⅰ（RNase-free），用DEPC處理水補(bǔ)足至10 μL，除去存在的少量基因組 DNA。于37 ℃反應(yīng) 30 min，然后加入1 μL 50 mol/L EDTA，65 ℃孵化10 min，即可用此RNA作為反轉(zhuǎn)錄模板。以RNase-free水為對(duì)照，用紫外分光光度計(jì)測(cè)定D260 nm/D280 nm值、總RNA濃度。

1.2.3反轉(zhuǎn)錄向提取純化好的各組織的總RNA中加入以下試劑：2 μL 5×gDNA Eraser bufferⅠ、1 μL 5 xgDNA EraserⅠ、1 μL總RNA，用無(wú)核酸酶水補(bǔ)足至10 μL。然后于42 ℃孵育混合物3 min，冷卻后向下旋轉(zhuǎn)混勻，將管子放回冰上。再向以上反應(yīng)液中按指定順序加入如下試劑：4 μL無(wú)核酸酶水Ⅰ、4 μL 5×PrimeScript buffer 2、1 μL RT Prime MixⅠ、1 μL Prime Script RT Enzyme MixⅠ，終體積為20 μL。加完樣后輕柔混合，短暫離心，然后于37 ℃孵育混合物30 min，最后于85 ℃加熱5 s終止反應(yīng)。反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物可直接用于PCR擴(kuò)增，或于-20 ℃保存（3個(gè)月以內(nèi)），長(zhǎng)期保存建議放于-70 ℃。

1.2.4目的基因PCR反應(yīng)及克隆測(cè)序利用常規(guī)PCR反應(yīng)對(duì)組織樣品中FAS、LPL基因進(jìn)行擴(kuò)增，將目標(biāo)片段分別從瓊脂糖凝膠中切下，按照DNA回收試劑盒說(shuō)明回收目的片段，在T4-DNA連接酶作用下，經(jīng)16 ℃過(guò)夜連接PGEM-T Easy載體，用CaCl2法將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入大腸桿菌E.coli DH5α感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)藍(lán)白斑篩選陽(yáng)性菌落后，挑取單菌落進(jìn)行培養(yǎng)，然后從菌液中提取質(zhì)粒，菌液送往上海華大基因科技有限公司測(cè)序。

1.2.5基因序列分析采用DNAMAN軟件對(duì)GenBank中綿羊、山羊、牛、豬、斑馬魚(yú)、褐家鼠、馬等11個(gè)物種和測(cè)序后的阿勒泰羊FAS、LPL基因的編碼區(qū)核苷酸序列進(jìn)行同源比對(duì)分析。用MEGA5.1軟件構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)，進(jìn)行遺傳進(jìn)化分析。

2結(jié)果與分析

2.1提取總RNA

提取的總RNA經(jīng)紫外分光光度計(jì)測(cè)定，D260 nm/D280 nm在1.8～2.0間，表明提取的總RNA無(wú)蛋白質(zhì)和苯酚污染，純度較高，可用于后續(xù)試驗(yàn)。

2.2FAS基因的RT-RCR擴(kuò)增

以RNA反轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板，以FAS、LPL的上、下游引物擴(kuò)增，分別得到256、181 bp的條帶（圖1、圖2）。

2.3FAS、LPL基因測(cè)序結(jié)果與序列分析

將阿勒泰羊的FAS基因核苷酸序列與已公布的綿羊的相應(yīng)序列進(jìn)行分析比對(duì)，結(jié)果顯示序列同源性為99.61%；通過(guò)與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中綿羊、牛、小鼠等11個(gè)物種進(jìn)行核苷酸序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)，阿勒泰羊FAS基因與綿羊的序列同源性最高，與西農(nóng)薩能奶山羊的序列同源性最低；與牛、馬、人、豬、褐家鼠的序列同源性均在80%～95%之間；與鴿、雞的序列同源性分別為72.66%、71.88%；與虎鯨的序列同源性最低，為46.24%（表1）。結(jié)果與傳統(tǒng)分類相一致。

2.4系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)分析

采用MEGA 5.0軟件構(gòu)建了FAS基因系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。從圖3可以看出，大分支分為2類，虎鯨為1個(gè)分支；其余10個(gè)物種聚為一大類，首先禽類的鴿子和雞成為一類，后與馬、褐家鼠以及人、豬聚成的小類合成一類，最后與平行的哺乳綱偶蹄目的綿羊、阿勒泰羊、山羊以及西農(nóng)薩能奶山羊以及牛聚為一大類。

從LPL的基因系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)中可以看出，主支分為2支，第1主支以阿勒泰羊、牛、馬、人、雞等11個(gè)物種組成，另1支為羅非魚(yú)。其中第1主支又分為5個(gè)分支，第1分支為阿勒泰羊與綿羊；第2分支主要為山羊、牛、貓、馬；第3分支為東非狒狒、人；第4分支為小家鼠、豚鼠；第5分支為雞（圖4）。

3討論

脂肪的合成代謝與分解代謝始終處于一個(gè)平衡狀態(tài)，主要是由甘油三酯的酯化、分解這2個(gè)過(guò)程主導(dǎo)，其相對(duì)速度決定了脂肪的分解或儲(chǔ)存。FAS是脂肪合成的關(guān)鍵酶，LPL可以催化乳糜微粒、極低密度脂蛋白中的甘油三酯水解，因此對(duì)FAS、LPL基因的研究有助于深入了解脂肪代謝的分子機(jī)制。

有關(guān)人、鼠、豬、牛等哺乳動(dòng)物 FAS 基因的結(jié)構(gòu)、定位、表達(dá)研究已有報(bào)道[7-9]，從序列分析可以看出，阿勒泰羊FAS基因與羊亞科的西農(nóng)薩能奶山羊的序列同源性較低，這可能與地理環(huán)境的差異有關(guān)。Krichgessner等從綿羊脂肪組織中克隆測(cè)序得到1 656 bp的部分LPL基因序列[10-11]；為獲得綿羊全長(zhǎng)LPL基因，Bonnet等通過(guò)3′-RACE方法獲得了1 917 bp的綿羊LPL基因序列[12]，并與Edwards等獲得的 LPL基因序列拼接后得到共3 529 bp的綿羊LPL全長(zhǎng)cDNA序列，通過(guò)Southern Blotting方法定位在綿羊第2號(hào)染色體上。本試驗(yàn)克隆測(cè)序阿勒泰羊LPL基因的cDNA發(fā)現(xiàn)，與GenBank中收錄的9種哺乳動(dòng)物中LPL基因cDNA序列表現(xiàn)了較高的同源性及進(jìn)化上的保守性。

采用MEGA5.0 軟件構(gòu)建了FAS與LPL基因的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，進(jìn)化樹(shù)上分支節(jié)點(diǎn)越近，說(shuō)明基因序列間遺傳距離也相對(duì)較近；11個(gè)物種構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)表明FAS基因中阿勒泰羊和綿羊具有最近的遺傳關(guān)系，而與虎鯨的親緣關(guān)系最遠(yuǎn)，LPL基因與羅非魚(yú)的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，其結(jié)果均正確地反映了物種間的進(jìn)化關(guān)系。

隨著分子生物學(xué)技術(shù)的出現(xiàn)和不斷成熟，人們從分子生物學(xué)水平對(duì)脂肪代謝的調(diào)控進(jìn)行了一些探索性的研究，而本研究獲得了阿勒泰羊FAS、LPL基因的部分序列，為人們進(jìn)一步對(duì)阿勒泰羊脂肪相關(guān)的研究和肉質(zhì)性狀的研究以及育種提供了理論基礎(chǔ)，同時(shí)也為今后研究阿勒泰羊與牛亞科等近緣物種間分子進(jìn)化和遺傳分化奠定了一定的理論基礎(chǔ)。

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