李青青+王旭歌+鐘甲麗+李旺

摘要： 根據(jù)GenBank已報道的枯草芽孢桿菌的基因序列，設(shè)計特異性引物，經(jīng)PCR分別從B.subtilis L、B.subtilis K基因組中擴增得到3個纖維素酶基因序列，基因片段分別長約700、1 500、1 700 bp。連接到T載體上進行測序，獲得該3個纖維素酶基因片段的DNA序列，在線比對分析表明3個基因的部分堿基序列與已報道的纖維素酶基因的序列同源性達99%。這3個基因的全序列在GenBank中未見報道，且通過軟件對比，三者沒有任何相似性。根據(jù)3個纖維素酶基因的來源分別命名為Lcen、Ken、Kkg。借助軟件分析確定Lcen基因全長699 bp，基因序列為1個完整的閱讀框，連續(xù)編碼232個氨基酸。Ken基因全長1 500 bp，連續(xù)編碼499個氨基酸。Kkg基因全長1 686 bp，基因序列為1個完整的閱讀框，連續(xù)編碼561個氨基酸。3個基因均屬于纖維素酶家族大類。

關(guān)鍵詞： 纖維素酶；基因；克?。恍蛄蟹治?/p>

中圖分類號： Q785 文獻標(biāo)志碼： A 文章編號：1002-1302（2016）03-0040-04

纖維素是地球上最豐富的可再生自然資源[1]。全球每年纖維素產(chǎn)量達2 000億 t[2]，僅我國秸稈產(chǎn)量就達5億～7億t，大部分被焚燒、丟棄，不僅浪費資源，而且會對環(huán)境造成污染[3]。纖維素是一種無色、無味的白色絲狀物，難溶于一般的有機溶劑及水，是植物細胞壁的主要組成部分。植物纖維素結(jié)構(gòu)基本由結(jié)晶區(qū)域、無定型區(qū)域組成，纖維素結(jié)晶區(qū)域比無定型區(qū)域難降解[4]。酶解法是目前降解纖維素最有效的方法[5]。纖維素酶是能夠分解纖維素、最終將其降解成葡萄糖的一類酶的總稱。根據(jù)纖維素酶催化反應(yīng)功能的不同可將其分為：（1）內(nèi)切葡聚糖酶，這類酶作用于纖維素分子內(nèi)部的非結(jié)晶區(qū)，隨機水解β-1，4-糖苷鍵；（2）外切葡聚糖酶，這類酶作用于纖維素線狀分子末端，水解β-1，4糖苷鍵；（3）β-葡萄糖苷酶，這類酶將纖維二糖水解成葡萄糖分子[6]。纖維素酶分子多數(shù)由球狀的催化結(jié)構(gòu)域（catalytic domains，CD）、連接橋（linker）、纖維素結(jié)合結(jié)構(gòu)域（cellulose-binding domains，CBD）3個部分構(gòu)成[7-9]。纖維素酶分布廣泛，目前飼料用纖維素酶主要從微生物中獲得。隨著分子生物學(xué)、基因工程技術(shù)的發(fā)展，對纖維素酶分子層面研究也隨之展開，纖維素酶基因的克隆與表達成了研究焦點。細菌、真菌的纖維素酶系不斷被人們發(fā)現(xiàn)、分離，大量纖維素酶基因得到克隆、表達，豐富了纖維素酶的研究材料[10]。結(jié)構(gòu)功能完整的纖維素酶基因克隆到高效表達載體上再進行異源表達，能使纖維素酶的產(chǎn)量成倍提高[11]。本試驗對纖維素酶系內(nèi)的3個纖維素酶基因進行克隆和序列分析，旨在為后續(xù)高效聯(lián)合表達纖維素酶系基因進行研究準(zhǔn)備。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株與質(zhì)粒 Bacillus subtilis K、Bacillus subtilis L均由實驗室篩選并保存，大腸桿菌DH5α購于北京天根生化科技有限公司，pGEM-T Easy Vector System購于Promega公司。

1.1.2 主要試劑 DL 2000 Marker、溴酚藍、瓊脂糖購自北京天根生化科技有限公司；Taq酶、DNTP、各種限制性內(nèi)切酶購自Promega公司；溴化乙錠（EB）、抗生素（Amp）購于北京索萊寶科技有限公司；RNA酶，蛋白酶K購于北京中科瑞泰生物科技有限公司；瓊脂粉、蛋白胨購于Oxid公司?；蚪M提取試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒、DNA膠純化回收試劑盒均購自于中科瑞泰（北京）生物科技有限公司。

1.1.3 引物 試驗中的3對引物序列：

ENF： 5′-ATGAAACGGTCAATCTCTATT-3′；

ENR： 5′-CTAATTTGGTTCTGTTCCCCA-3′；

CENF：5′-ATGAAAAAGATCATGAGTGCAT-3′；

CENR：5′-TTATTCAGGAAACTGAACATGG-3′；

KGF：5′-ATGAGTGAATGGTGGAAAGAAG-3′；

KGR：5′-TCATATACTAATGCCCATCACAG-3′。

1.2 方法

LB培養(yǎng)基的配制：蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，氯化鈉10 g，蒸餾水1 L，固體LB培養(yǎng)基加入20 g瓊脂粉，120 ℃高壓滅菌30 min。細菌基因組DNA的提取、質(zhì)粒DNA的提取、DNA的凝膠回收參照試劑盒提供的說明進行。纖維素酶基因的PCR擴增、纖維素酶基因片段與T載體的連接、重組質(zhì)粒導(dǎo)入感受態(tài)細胞、含纖維素酶基因的重組質(zhì)粒的酶切鑒定參照《分子克隆試驗指南》規(guī)定的方法進行。纖維素酶系基因的序列測定由北京擎科新業(yè)公司完成。用VectorNT軟件和NCBI Blast 2.0在線軟件對該纖維素酶基因的序列進行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 纖維素酶基因的克隆

根據(jù)GenBank公布的纖維素酶系的內(nèi)切葡聚糖酶基因、外切葡聚糖酶基因、葡萄糖苷酶基因序列設(shè)計特異性引物：ENF（R）、CENF（R）、KGF（R），以提取得到的B.subtilis K、B. subtilis L基因組DNA為模板進行PCR擴增，擴增結(jié)果如圖1所示。擴增得到的DNA片段大小分別為1 500、700、1 700 bp左右。根據(jù)來源不同分別將3個基因命名為Ken、Lcen、Kkg。

2.2 纖維素酶基因的鑒定

分別將片段回收，連接于T載體上轉(zhuǎn)化到大腸桿菌培養(yǎng)，挑取單菌落，進行重組質(zhì)粒PCR鑒定（圖2-A），凝膠上有明顯的DNA條帶，與PCR擴增的結(jié)果一樣。進行酶切鑒定（圖2-B），凝膠上分別出現(xiàn)2條明顯的DNA條帶，一條大小約為3 kb與T-easy載體的片段大小一致，另一條帶大小分別約為1 500、700、1 700 bp，與PCR擴增的結(jié)果一致。由此確定PCR擴增產(chǎn)物順利連接到T-easy載體上，構(gòu)建了3個基因與T-easy連接的重組質(zhì)粒，分別命名為LcenT、KenT、KkgT。

2.3 纖維素酶基因的序列分析

將3個纖維素酶基因重組質(zhì)粒LcenT、KenT、KkgT分別進行測序，并通過VectorNT軟件和GenBank數(shù)據(jù)庫對3個基因的序列進行分析。

2.3.1 Lcen基因的序列分析 對LcenT重組質(zhì)粒進行測序，得到的基因序列如圖3所示。

用VectorNT軟件對Lcen基因序列進行分析發(fā)現(xiàn)，該基因全長699個堿基，組成1個完整的開放閱讀框（open read frame，ORF），連續(xù)編碼232個氨基酸，起始密碼ATG，終止密碼TAA。

利用NCBI網(wǎng)站上的Blast功能對該基因序列進行比對發(fā)現(xiàn)，基因Lcen與已報道的枯草芽孢桿菌纖維素酶基因GU327817.1、CP003695.1、CP003329.1、AP012496.1、AP012495.1十分相似，相似度為99%。對其編碼的氨基酸進行比對分析發(fā)現(xiàn)，該基因編碼的氨基酸序列與已報道的枯草芽孢桿菌胞外的葡萄糖苷酶基因NP389744.1、YP007427045.1、YP004203797.1、YP006231826.1、ZP06873100.1的氨基酸序列十分相似，相似度達到95%。故可初步確定該基因來源于枯草芽孢桿菌，屬于纖維素酶基因。

對基因編碼的氨基酸序列進行分析和預(yù)測得知，該基因編碼的氨基酸結(jié)構(gòu)屬于罕見的脂蛋白（RlpA）超家族，基因序列部分與罕見的脂蛋白、假定的EG45-like域包含蛋白1、內(nèi)切葡聚糖酶c終端域/亞單位和相關(guān)蛋白質(zhì)相似性高。

2.3.2 Ken基因的序列分析 對KenT重組質(zhì)粒進行測序，得到的基因序列如圖4所示。

用VectorNT軟件對Ken基因序列分析，KenT的基因全長1 500個堿基，組成1個完整的開放閱讀框，連續(xù)編碼499個氨基酸。起始密碼ATG，終止密碼TAG。利用NCBI網(wǎng)站上的Blast功能對該基因序列進行比對發(fā)現(xiàn)，基因Ken的序列與已報道的枯草芽孢桿菌纖維素酶基因FJ800366.1、EF070194.1、KC477685.1、CP002468.1、HM543165.1基因序列十分相似，相似度為99%。對其編碼的氨基酸進行比對，該基因編碼的氨基酸序列與已報道的枯草芽孢桿菌的內(nèi)切葡萄糖苷酶基因NP389695.2、AFX88666.1、YP007209477.1、ACK38261.1的氨基酸序列十分相似，相似度達到99%。故可確定該基因來源于枯草芽孢桿菌，屬于纖維素酶基因。

對該基因編碼的氨基酸結(jié)構(gòu)進行分析預(yù)測發(fā)現(xiàn)，該基因編碼的氨基酸屬于水解酶超級家族，整體由2個主要部分組成（圖5），一部分為纖維素酶區(qū)域（cellulase，圖5-A），一部分為纖維素酶的綁定區(qū)域（CBM-3，圖5-B），其中的纖維素酶區(qū)域結(jié)構(gòu)符合糖基水解酶家族5的結(jié)構(gòu)特征。

2.3.3 Kkg基因的序列分析 對KkgT重組質(zhì)粒進行測序，得到的基因序列如圖6所示。

用VectorNT軟件對Kkg基因序列分析，Kkg基因全長1 686個堿基，組成1個完整的開放閱讀框，連續(xù)編碼561個氨基酸。起始密碼ATG，終止密碼TGA。

利用NCBI網(wǎng)站上的Blast功能對該基因序列進行比對發(fā)現(xiàn)，Kkg的基因序列與已報道的枯草芽孢桿菌纖維素酶基因cp002468.1、CP003695.1、CP003329.1、AP012496.1、AP012495.1序列十分相似，相似度為99%。對其編碼的氨基酸進行比對分析發(fā)現(xiàn)，該基因編碼的氨基酸序列與枯草芽孢桿菌1，4-6-α-葡糖苷酶基因YP004205293.1、YP007208039.1、YP007428400.1、YP007664110.1、ZP12669813.1的氨基酸序列十分相似，相似度達到99%。故可初步確定該基因來源于枯草芽孢桿菌，屬于纖維素酶基因的類別。對該基因編碼的氨基酸結(jié)構(gòu)進行分析和預(yù)測發(fā)現(xiàn)，該基因編碼的氨基酸屬于 α-淀粉酶的超家族，基因編碼的氨基酸序列上包含纖維素酶活性部位、Ca綁定結(jié)構(gòu)域、催化部位（圖7）。

3 結(jié)論與討論

纖維素酶的應(yīng)用非常廣泛，然而天然纖維素酶由于酶活較低以及成本高等因素的限制，對于大規(guī)模的工業(yè)化應(yīng)用有一定困難。近年來，隨著分子生物學(xué)和基因工程技術(shù)的發(fā)展，對纖維素酶分子層面的研究也隨之展開，纖維素酶基因的克隆與表達成了研究焦點。 目前常用的基因克隆方法有人工合成法、PCR擴增法以及構(gòu)建基因文庫等[12]。本試驗通過GenBank檢索枯草芽孢桿菌纖維素酶基因，根據(jù)基因的編碼序列設(shè)計3對引物，從B. subtilis K、B. subtilis L基因組DNA擴增出了3個基因片段，通過測序得到基因序列?？莶菅挎邨U菌是目前細菌纖維素酶基因的主要來源，已報道的大部分纖維素酶基因均從枯草芽孢桿菌中獲得[13-14]。已報道的枯草芽孢桿菌纖維素酶基因大多數(shù)屬于內(nèi)切葡聚糖酶（endo β-1，4 glucanase）基因[14]。在纖維素酶基因克隆上，不論是從何種微生物上進行克隆，大部分報道均是克隆獲得1個基因。本試驗同時從Bucillus subitilis K基因組DNA中克隆得到2個纖維素酶基因Ken、Kkg，其中Ken大小為 1 500 bp，與已報道的大多數(shù)枯草芽孢桿菌內(nèi)切葡聚糖酶基因一致，屬于纖維素水解酶家族；Kkg基因全長1 686 bp，與已報道的枯草芽孢桿菌1，4-6-α-葡糖苷酶基因一致，在結(jié)構(gòu)分析上，該基因?qū)儆讦?淀粉酶的超家族。

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