丁雪冰 王雪晶 馬明明 滕軍放

1)鄭州大學第一附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科 鄭州 450052 2)鄭州大學帕金森病及相關(guān)運動障礙疾病研究所 鄭州 450052 3)河南省人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科 鄭州 450003

LRRK2活化Rho GTPases信號通路在小膠質(zhì)細胞吞噬α-突觸核蛋白中的作用機制

丁雪冰1，2)王雪晶1，2)馬明明3)滕軍放1，2)

1)鄭州大學第一附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科 鄭州 450052 2)鄭州大學帕金森病及相關(guān)運動障礙疾病研究所 鄭州 450052 3)河南省人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科 鄭州 450003

目的 探討小膠質(zhì)細胞吞噬α-突觸核蛋白的分子機制。方法 構(gòu)建α-Syn寡聚體誘導BV-2細胞活化模型，免疫熒光檢測BV-2細胞內(nèi)α-Syn陽性包涵體的數(shù)量。Western blot檢測BV-2細胞LRRK2蛋白的表達。Pull down檢測BV-2細胞Rac1、Cdc42、RhoA的活性。結(jié)果 與對照組相比，α-Syn寡聚體誘導BV-2細胞內(nèi)α-Syn陽性包涵體數(shù)量增加，LRRK2蛋白表達增加及Rac1、Cdc42、RhoA活性增加。結(jié)論 小膠質(zhì)細胞對α-突觸核蛋白的吞噬與LRRK2活化Rho GTPases信號通路相關(guān)。

LRRK2；Rho GTPases信號通路；小膠質(zhì)細胞；α-突觸核蛋白

帕金森病(Parkinson’s disease，PD)是人類最常見的神經(jīng)退行性疾病之一[1]。其病理特征為黑質(zhì)致密部多巴胺神經(jīng)元變性缺失及殘存神經(jīng)元胞漿中異常聚集的α-突觸核蛋白(α-synuclein，α-Syn)陽性路易小體的形成[2]。隨著研究的不斷深入，學者們發(fā)現(xiàn)在α-Syn陽性包涵體胞間播散過程中，小膠質(zhì)細胞作為重要的傳遞媒介，在大量吞噬異常聚集的α-Syn后被持續(xù)激活,導致神經(jīng)元損傷[3-4]。由此推測α-Syn陽性包涵體在小膠質(zhì)細胞間播散在PD進展中起重要作用。

α-Syn寡聚體通過小膠質(zhì)細胞胞吞作用在相鄰細胞之間傳遞[5]，進入受體細胞的α-Syn寡聚體，可以像“朊蛋白”一樣作為“種子”誘導正常構(gòu)象的α-Syn蛋白錯誤折疊最終形成α-Syn陽性包涵體。通過這種模式α-Syn陽性包涵體在細胞間播散[6]，導致神經(jīng)元的損傷從黑質(zhì)向其他腦區(qū)擴散。而抑制α-Syn寡聚體的胞間傳遞能夠阻斷LB的細胞間播散，從而減少神經(jīng)元的損傷。LRRK2基因(1eucine rich repeat kinase 2 gene，PARK8；OMIM 607060)位于細胞質(zhì)內(nèi)，定位于細胞膜、細胞器膜等膜結(jié)構(gòu)，作為分子開關(guān)參與細胞信號傳導、骨架重塑及膜轉(zhuǎn)運等多種生理過程[7]。我們的前期研究發(fā)現(xiàn)LRRK2作為Rho GTPase的調(diào)控因子，介導上皮細胞吞噬能力增強。因此LRRK2很可能參與調(diào)控小膠質(zhì)細胞對于α-Syn寡聚體的吞噬。本研究以小膠質(zhì)細胞吞噬α-Syn寡聚體為切入點，檢測LRRK2活化Rho GTPases信號通路在小膠質(zhì)細胞吞噬α-突觸核蛋白中的作用機制，探索PD神經(jīng)元損傷的病理機制。

1 材料與方法

1.1 材料 BV-2細胞由本實驗室保存。DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清購于美國GIBCO公司。LRRK2抗體購于美國Cell Signaling公司，α-Syn抗體購于美國 Santa Cruz Biotechnology公司，過氧化物酶標記山羊抗兔IgG購于美國Promega公司，Alexa Fluor 633 標記 Phalloidin購于美國Molecular Probes公司。Rac/Cdc42 Assay Reagent (PAK1 PBD，agarose)或 Rho Assay Reagent (Rhotekin RBD, agarose) 購于美國Millipore公司。人源重組α-Syn凍干粉購于Sigma公司。

1.2 α-Syn寡聚體誘導BV-2細胞活化模型的構(gòu)建 BV-2細胞以1×106接種到12孔板中培養(yǎng)24 h后，換無血清培養(yǎng)基，實驗組中加入終濃度0.5 μM的α-Syn寡聚體，對照組加入相應(yīng)體積PBS，并于37℃ 5% CO2中孵育24 h。

1.3 免疫熒光檢測BV-2細胞內(nèi)α-Syn陽性包涵體 收獲細胞，PBS洗2次。加入-20℃預(yù)冷的丙酮于-20℃孵育10 min，再加入0.1% Triton，常溫孵育5 min，PBS洗3次。5% BSA 37℃孵育30 min。加入α-Syn抗體(1∶1000)4℃孵育過夜，PBS洗3次。加入Alexa Fluor 488 標記羊抗兔二抗(1∶1000) 4℃孵育3 h，PBS洗3次。加入DAPI(1∶400)，常溫孵育3 min。于干凈的載玻片滴加封片劑，常溫下避光晾干過夜，于激光共聚焦顯微鏡下觀察。

1.4 Western blot檢測BV-2細胞蛋白表達 構(gòu)建α-Syn寡聚體誘導BV-2細胞活化模型，提取細胞總蛋白，做SDS-PAGE電泳，將蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維濾膜上。用5%脫脂奶粉封閉1 h，PBS洗3次，加入LRRK2及GTP-Rac1、GTP-Cdc42、GTP-RhoA抗體(1∶1000)，4℃過夜。加入過氧化物酶標記山羊抗兔IgG(1∶5000)孵育2 h，PBS洗3次，ECL光化學法顯色。凝膠成像分析系統(tǒng)分析掃描。

1.5 Pull down檢測BV-2細胞Rac1、Cdc42、RhoA活性 0.5 mL預(yù)冷的細胞裂解液MLB裂解細胞10 min，離心收集上清。加入GST，冰上孵育10 min，離心收集上清。冰上取1 mL細胞提取液，加入20 μL Rac/Cdc42 Assay Reagent (PAK1 PBD, agarose)或 Rho Assay Reagent (Rhotekin RBD, agarose)冰上孵育2 h。離心去上清，500 μL Wash Buffer 洗滌沉淀，所得蛋白做Western blot檢測GTP-Rac1、GTP-Cdc42、GTP-RhoA蛋白表達。

1.6 統(tǒng)計學分析 應(yīng)用AlphaEaseFC(FluorChem8900)軟件分析圖像結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 免疫熒光檢測BV-2細胞內(nèi)α-Syn陽性包涵體 構(gòu)建α-Syn誘導BV-2細胞活化模型。免疫熒光結(jié)果顯示，與對照組相比，α-Syn誘導BV-2細胞中α-Syn陽性包涵體數(shù)量增高。如圖1所示。

圖1 免疫熒光檢測BV-2細胞中α-Syn陽性包涵體(免疫熒光×400)

2.2 Western blot檢測BV-2細胞LRRK2蛋白表達 Western blot結(jié)果顯示，與對照組相比，α-Syn誘導BV-2細胞LRRK2蛋白表達增高。如圖2所示。

圖2 Western blot檢測BV-2細胞LRRK2蛋白表達

2.3 Pull down檢測BV-2細胞Rac1、Cdc42、RhoA活性 構(gòu)建α-Syn誘導BV-2細胞活化模型。Pull down結(jié)果顯示，與對照組相比，α-Syn誘導BV-2細胞中GTP-Rac1、GTP-Cdc42、GTP-RhoA表達增高。表明Rac1、Cdc42、RhoA活性增高。如圖3所示。

圖3 Pull down檢測BV-2細胞Rac1、Cdc42、RhoA活性

3 討論

研究表明α-Syn陽性包涵體胞間播散介導的小膠質(zhì)細胞活化，在PD進展中起到重要作用。小膠質(zhì)細胞是中樞神經(jīng)系統(tǒng)的重要免疫炎癥反應(yīng)細胞，研究表明，小膠質(zhì)細胞與DA神經(jīng)元通過細胞間、細胞分子間的網(wǎng)絡(luò)式作用相互聯(lián)系參與了帕金森病的發(fā)生發(fā)展過程[8,9]。在α-Syn寡聚體的細胞間傳遞所介導的神經(jīng)元損傷中，小膠質(zhì)細胞的活化扮演了重要角色。作為免疫效應(yīng)細胞，小膠質(zhì)細胞具有強大的吞噬功能。研究表明小膠質(zhì)細胞能夠吞噬α-Syn寡聚體及單體，作為α-Syn寡聚體傳遞的重要載體，加速α-Syn陽性包涵體的細胞間播散，促進PD的發(fā)展。研究表明，米諾環(huán)素、白細胞介素-10等抑制小膠質(zhì)細胞活化的藥物能夠減輕PD模型DA神經(jīng)元損傷。因此，調(diào)控小膠質(zhì)細胞吞噬功能的因子很可能通過促進α-Syn寡聚體的內(nèi)吞而激活小膠質(zhì)細胞，介導DA神經(jīng)元的損傷，從而推動PD的進展。

LRRK2基因是新近在散發(fā)性、家族聚集性常染色體顯性遺傳的帕金森病患者中發(fā)現(xiàn)的致病基因。在細胞水平上LRRK2位于細胞質(zhì)內(nèi)，參與細胞膜轉(zhuǎn)運等生理過程。LRRK2具有6個主要功能區(qū)域，其中ROC區(qū)域具有GTPases水解酶活性[10]，通過直接結(jié)合調(diào)控Rho GTPases的活性。研究表明，ROC區(qū)域與PD有關(guān)的突變(R1441C, R1441G)減弱了GTPase水解活性，增強了與GTP的結(jié)合，導致Rho GTPases的活化,引起細胞骨架重塑及神經(jīng)元結(jié)構(gòu)和功能的改變,這也是LRRK2致病的主要機制[11]。我們的前期研究發(fā)現(xiàn)，LRRK2很可能通過調(diào)控Rho GTPases信號通路的活化而在上皮細胞吞噬功能中起重要作用。尸檢發(fā)現(xiàn)路易小體中LRRK2與α-Syn存在共定位。在α-Syn A53T轉(zhuǎn)基因小鼠體內(nèi)過表達LRRK2會加重表型及病變進展。以上研究表明，LRRK2與α-Syn的相互作用參與了PD的發(fā)病過程。

本研究發(fā)現(xiàn)小膠質(zhì)細胞對α-Syn的吞噬與LRRK2的表達上調(diào)及Rho GTPases信號通路活化相關(guān)。由此我們認為，LRRK2活化Rho GTPases信號通路促進了小膠質(zhì)細胞吞噬α-Syn寡聚體；調(diào)控LRRK2可能成為PD治療一個新的方向。

[1] MassanoJ.Parkinson's disease: a clinical update[J].Acta Medica Portuguesa,2011, 24(Suppl4):827-834.

[2] Mollenhauer B, Forstl H, Deuschl G,et al. Lewy body and parkinsonian dementia: common, but often misdiagnosed conditions[J]. Deutsches Arzteblatt International, 2010,107(39): 684-691.

[3] Beraud D, Maguire-Zeiss KA. Misfolded alpha-synuclein and Toll-like receptors: therapeutic targets for Parkinson's disease[J]. Parkinsonism & Related Disorders,2012,18 (Suppl1):S17-S20.

[4] Hosoi T, Ozawa K. Molecular approaches to the treatment, prophylaxis, and diagnosis of Alzheimer's disease: endoplasmic reticulum stress and immunological stress in pathogenesis of Alzheimer's disease[J]. Journal of Pharmacological Sciences,2012,118(3): 319-324.

[5] Freundt EC, Maynard N, Clancy EK, et al. Neuron-to-neuron transmission of alpha-synuclein fibrils through axonal transport[J]. Annals of Neurology, 2012, 72(4): 517-524.

[6] Olanow CW, Brundin P. Parkinson's disease and alpha synuclein: is Parkinson's Disease a prion-like disorder[J].Movement Disorders, 2013, 28(1): 31-40.

[7] Biosa A, Trancikova A, Civiero L, et al. GTPase activity regulates kinase activity and cellular phenotypes of Parkinson's disease-associated LRRK2[J]. Human Molecular Genetics，2013, 22(6): 1 140-1 156.

[8] Depboylu C, Stricker S, Ghobril JP,et al. Brain-resident microglia predominate over infiltrating myeloid cells in activation, phagocytosis and interaction with T-lymphocytes in the MPTP mouse model of Parkinson disease[J]. Experimental Neurology，2012，238(2): 183-191.

[9] Tseng YT, Hsu YY, Shih YT, et al. Paeonol attenuates microglia-mediated inflammation and oxidative stress-induced neurotoxicity in rat primary microglia and cortical neurons[J]. Shock，2012, 37(3): 312-318.

[10] Jebelli JD, Dihanich S, Civiero L,et al. GTP binding and intramolecular regulation by the ROC domain of Death Associated Protein Kinase 1[J]. Scientific Reports，2012, 2: 695.

[11] Anand VS, Braithwaite SP. LRRK2 in Parkinson's disease: biochemical functions[J]. The FEBS Journal，2009, 276(22): 6 428-6 435.

(收稿2014-05-10)

The functions and mechanisms of Rho GTPases signaling pathway activation induced by LRRK2 in microglial phagocytosis of α-synuclein

DingXuebing＊,WangXuejing,MaMingming,TengJunfang

＊DepartmentofNeurology,theFirstAffiliatedHospitalofZhengzhouUniversity,Zhengzhu450052,China

Objective To investigate the mechanism of microglial phagocytosis of α-synuclein.Methods BV-2 cells activation model induced by α-synuclein oligomers was established. Immunofluorescence stain was performed to detect α-synuclein-positive inclusions in BV-2 cells. Western blot was performed to detect LRRK2 expression in BV-2 cells. Pull down was performed to detect Rho GTPases signaling pathway activation in BV-2 cells.Results Compared with the control group,α-synuclein-positive inclusions, LRRK2 expression and Rho GTPases signaling pathway activity in BV-2 cells significantly increased in theα-synuclein group.Conclusion The Rho GTPases signaling pathway activation induced by LRRK2 associate closely with microglial phagocytosis of α-synuclein.

LRRK2; Rho GTPases signaling pathway; Microglia; α-synuclein

國家自然科學基金項目(81301086)

R329.2

A

1673-5110(2014)23-0017-03