吳守芳 江廣予 馬明明 丁雪冰 王雪晶

1)河南盧氏縣人民醫(yī)院 盧氏 472200 2)河南三門峽黃河醫(yī)院 三門峽 452000 3)鄭州大學(xué)帕金森病及相關(guān)運動障礙病病研究所 鄭州 450052

突變型TDP-43(A315T)蛋白誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞凋亡的機制研究

吳守芳1)江廣予2)馬明明3)丁雪冰3)王雪晶3)

1)河南盧氏縣人民醫(yī)院 盧氏 472200 2)河南三門峽黃河醫(yī)院 三門峽 452000 3)鄭州大學(xué)帕金森病及相關(guān)運動障礙病病研究所 鄭州 450052

目的 探討TDP-43(A315T)突變蛋白誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞凋亡的機制。方法 采用真核細(xì)胞轉(zhuǎn)染技術(shù)將Flag-TDP-43(wt)及Flag-TDP-43(A315T)質(zhì)粒轉(zhuǎn)入SH-SY5Y細(xì)胞，通過Western blot檢測TDP-43截短型表達(dá)及自噬水平的變化；PI/Annexin-V-FITC檢測細(xì)胞凋亡率；單丹磺酰尸胺(monodansylcadaverin，MDC)染色檢測細(xì)胞自噬空泡的變化。結(jié)果 與轉(zhuǎn)染Flag-TDP-43(wt)組相比，過表達(dá)Flag-TDP-43(A315T)細(xì)胞截短型片段Flag-TDP-35及Flag-TDP-25表達(dá)明顯上調(diào)，下調(diào)細(xì)胞內(nèi)源性Beclin 1水平及LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的比值降低。與轉(zhuǎn)染Flag-TDP-43(wt)組相比，過表達(dá)Flag-TDP-43(A315T)誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞自噬性小泡聚集明顯減少。與轉(zhuǎn)染Flag- TDP-43(wt)組相比，過表達(dá)Flag-TDP-43(A315T)后SH-SY5Y細(xì)胞凋亡率增加。結(jié)論 TDP-43(A315T)突變蛋白可通過增加其截短型表達(dá)及抑制細(xì)胞巨自噬水平誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞凋亡。

TDP-43(A315T)；SH-SY5Y細(xì)胞；自噬；凋亡

肌萎縮側(cè)索硬化癥(amyotrophic lateral sclerosis，ALS)和額顳葉變性 (frontotemporal lobar degeneration，F(xiàn)TLD)是兩種臨床少見的神經(jīng)退行性疾病，研究證實，二者有共同的病理基礎(chǔ)，即神經(jīng)系統(tǒng)殘存神經(jīng)元及膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)存在泛素陽性包涵體，其發(fā)病與TDP-43基因突變導(dǎo)致神經(jīng)元退行性改變相關(guān)[1]。TDP-43(TAR DNA-binding protein 43)是由 414 個氨基酸構(gòu)成的一個多功能DNA和RNA結(jié)合蛋白，其在RNA轉(zhuǎn)錄、選擇性剪接及mRNA穩(wěn)定性調(diào)節(jié)等過程中發(fā)揮功能[2]。家族性ALS病例中，也已鑒定出40多種TDP-43蛋白突變[3]，越來越多的研究證實，TDP-43蛋白與ALS及FTD的發(fā)病密切相關(guān)，但其表達(dá)的蛋白在發(fā)病中機制如何至今尚不能確定。本課題組在1例ALS家系中篩選到TDP-43基因A315T突變。以往研究顯示，攜帶此突變的患者中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)TDP-43發(fā)生片段化，產(chǎn)生大量TDP-43截短型片段，失去了正常的胞核定位，在胞核及胞漿中大量聚集形成包涵體[4]。但TDP-43(A315T)突變蛋白的具體致病機制，至今仍未明確。

1 材料與方法

1.1 材料 Flag-TDP-43(WT)、Flag-TDP-43(A315T)質(zhì)粒由上海吉凱有限公司構(gòu)建合成。SH-SY5Y細(xì)胞由湘雅醫(yī)院唐北沙教授惠贈。轉(zhuǎn)染試劑脂質(zhì)體Lipofectamine TM 2000購于美國Invitrogen公司，DMEM培養(yǎng)基、OPTI-MEM培養(yǎng)基、胎牛血清(FBS)購自美國GIBCO公司，抗TDP-43抗體購自Abcam美國公司、抗Beclin-1 抗體購自Eptimics美國公司、LC3抗體購自Abcam公司、GAPDH抗體購自美國 Santa Cruz Biotechnology公司、過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG購自美國Promega公司、MDC購自Sigma公司。

1.2 質(zhì)粒轉(zhuǎn) SH-SY5Y細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)于15% FBS的DMEM完全培養(yǎng)液中。待細(xì)胞鋪滿培養(yǎng)瓶底35%～45%后，棄去DMEM，每孔加入2 mL OPTI-MEM，將2～4 μL的質(zhì)粒及1.0 μL lipofectamine TM 2000分別與100 μL OPTI-MEM混勻后，共同加入六孔板的每個孔中，混勻，在37℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中孵育6 h，改用含10% FBS的DMEM培養(yǎng)基繼續(xù)孵育48 h。

1.3 免疫印跡檢測細(xì)胞TDP-35、TDP-25、Beclin 1蛋白及LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值 SH-SY5Y細(xì)胞細(xì)胞分別轉(zhuǎn)染Flag-TDP-43(WT)、Flag-TDP-43(A315T)48 h后，提取細(xì)胞總蛋白，進(jìn)行SDS-PAGE電泳，將蛋白樣本轉(zhuǎn)移至硝酸纖維濾膜上。用5%脫脂奶粉封閉1 h，TBST洗3次，加入抗TDP-43(1∶500)、抗Beclin 1(1∶800)、抗LC3(1∶500)抗體，4℃過夜。加入過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG(1∶5000)，置于水平脫色搖床上孵育1 h，TBST漂洗5次，ECL光化學(xué)法顯色。凝膠成像分析系統(tǒng)分析掃描。

1.4 MDC檢測細(xì)胞自噬空泡變化 SH-SY5Y細(xì)胞細(xì)胞分別轉(zhuǎn)染Flag-N1、Flag-TDP-43(WT)、Flag-TDP-43(A315T)24 h后，以4%多聚甲醛，4℃下固定10 min，PBS洗3遍，加入終濃度為50 μmol/L的MDC染色液，37℃下孵育60 min，PBS洗3遍，熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞自噬空泡的變化。

1.5 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡 SH-SY5Y細(xì)胞分別轉(zhuǎn)染Flag-TDP-43(WT)、Flag-TDP-43(A315T)24 h后，取200 μL細(xì)胞懸液加入10 μL Annexin-/FITC和20 μg/mL PI溶液20 μL，混勻后室溫避光孵育30 min，加入800 μL 1×PBS，以流式細(xì)胞儀PI/Annexin-V-FITC檢測細(xì)胞凋亡情況。

2 結(jié)果

2.1 Western blot檢測細(xì)胞內(nèi)源性TDP-35蛋白、TDP-25蛋白、Beclin 1 蛋白、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的表達(dá) 在SH-SY5Y細(xì)胞內(nèi)過表達(dá)Flag、Flag-TDP-43(WT)、Flag-TDP-43(A315T)，Western blot結(jié)果顯示，與Flag相比，過表達(dá)Flag-TDP-43(WT)，使SH-SY5Y細(xì)胞中Beclin 1表達(dá)上調(diào)且LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的比值增高；與Flag-TDP-43(WT)相比，過表達(dá)Flag-TDP-43(A315T)使SH-SY5Y細(xì)胞中Beclin1表達(dá)明顯下調(diào)且LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的比值降低。過表達(dá)Flag-TDP-43(A315T)使SH-SY5Y細(xì)胞中TDP-35及TDP-25表達(dá)上調(diào)。見圖1。

圖1 Western blot檢測SH-SY5Y細(xì)胞內(nèi)源性TDP-35蛋白、TDP-25蛋白、Becline 1蛋白及LC3Ⅱ、LC3Ⅰ蛋白的表達(dá)

2.2 MDC染色檢測SH-SY5Y細(xì)胞細(xì)胞中自噬空泡的變化 在SH-SY5Y細(xì)胞內(nèi)過表達(dá)Flag-TDP-43(WT)、Flag-TDP-43(A315T)，MDC染色結(jié)果顯示，與Flag-TDP-43(WT)相比，過表達(dá)Flag-TDP-43(A315T)導(dǎo)致MDC染色信號減弱，自噬空泡聚集減少。見圖2。

圖2 MDC染色檢測SH-SY5Y細(xì)胞細(xì)胞中自噬空泡的變化(免疫熒光×400)

2.3 PI/Annexin-V-FITC檢測TDP-43(A315T)對細(xì)胞凋亡率的影響 PI/Annexin-V-FITC檢測細(xì)胞凋亡率，結(jié)果顯示，與Flag-TDP-43(WT)相比，過表達(dá)Flag-TDP-43(A315T)使細(xì)胞凋亡率上調(diào)。見圖3。

圖3 PI/Annexin-V-FITC檢測細(xì)胞凋亡率的變化

3 討論

生理狀態(tài)下，TDP-43蛋白在細(xì)胞胞漿內(nèi)合成后轉(zhuǎn)變?yōu)榉€(wěn)定的多肽，成熟的TDP-43蛋白大部分轉(zhuǎn)運至核內(nèi)，與TAR DNA 結(jié)合，發(fā)揮調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄并參與 mRNA 修飾的功能；而留在胞漿中的TDP-43及TDP-43經(jīng)caspase-3 切割產(chǎn)生的C-末端片段(C-terminal fragments，CTFs)含量甚微。ALS及FTLD患者中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)TDP-43發(fā)生片段化，產(chǎn)生大量TDP-43 CTFs，失去正常的胞核定位，在胞核及胞漿中大量聚集形成包涵體，包涵體內(nèi)殘存的TDP-43被過度磷酸化修飾。2011年吳瑛教授研究證實TDP-43野生型和A315突變型蛋白在生物化學(xué)及結(jié)構(gòu)方面有差異，TDP-43(A315T)突變蛋白可產(chǎn)生截短型毒性片段在細(xì)胞間橫向播散而致病[5]。但TDP-43的毒性截短型片段導(dǎo)致細(xì)胞損害的具體機制至今仍未明。

自噬(autophagy)是真核細(xì)胞所特有的一種重要的高度保守的防御和保護(hù)機制，是細(xì)胞亞細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)發(fā)生動態(tài)的形態(tài)改變，并通過細(xì)胞溶酶體介導(dǎo)自身的大分子物質(zhì)或受損的細(xì)胞器的吞噬降解過程，對維持細(xì)胞生理平衡以及機體內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定起到重要作用[6]。越來越多的研究表明，自噬功能的失調(diào)在ALS的發(fā)病機制及發(fā)展過程中起到重要作用。自噬是細(xì)胞內(nèi)的大分子營養(yǎng)物質(zhì)和細(xì)胞器在溶酶體內(nèi)降解的過程。自噬過程可分為微自噬、巨自噬和分子伴侶介導(dǎo)的自噬。在巨自噬形成過程中，LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值明顯增高。Beclin 1通過與Vps34結(jié)合激活P13K通過促進(jìn)自噬體的形成，能夠反映體內(nèi)巨自噬的激活水平。細(xì)胞內(nèi)環(huán)境紊亂時，細(xì)胞自噬被抑制，導(dǎo)致蛋白降解障礙，在細(xì)胞內(nèi)聚集而致病。

本研究發(fā)現(xiàn)，TDP-43(A315T)轉(zhuǎn)染細(xì)胞后產(chǎn)生大量毒性截短型片段，通過下調(diào)SH-SY5Y細(xì)胞中Beclin 1 蛋白及LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值，抑制自噬水平，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。由此我們認(rèn)為，TDP-43(A315T) 通過抑制SH-SY5Y細(xì)胞自噬誘導(dǎo)神經(jīng)元細(xì)胞凋亡；調(diào)控自噬可能作為ALS治療一個新的方向。

[1] Sephton CF, Cenik B, Cenik BK, et al.TDP-43 in central nervous system development and function: clues to TDP-43-associated neurodegeneration[J]. Biological chemistry, 2012, 393(7): 589-594.

[2] Kanouchi T, Ohkubo T, Yokota T. Can regional spreading of amyotrophic lateral sclerosis motor symptoms be explained by prion-like propagation[J].J Neurol Neurosurg Psychiatry, 2012, 83(7): 739-745.

[3] Kanouchi T, Sekiguchi T, Mizusawa H, et al. Whether or not ALS lesions spread contiguously[J]. Rinsho Shinkeigaku, 2012, 52(11):1 059-1 061.

[4] Polymenidou M, Cleveland DW. The seeds of neurodegeneration: prion-like spreading in ALS [J]. Cell, 2011, 147(3): 498-508.

[5] King OD, Gitler AD, Shorter J. The tip of the iceberg: RNA-binding proteins with prion-like domains in neurodegenerative disease [J]. Brain Res, 2012, 1462: 61-80.

[6] Johnson BS, Snead D, Lee JJ, et al. TDP-43 is intrinsically aggregation-prone, and amyotrophic lateral sclerosis-linked mutations accelerate aggregation and increase toxicity [J]. The Journal of biological chemistry, 2009, 284(30):20 329-20 339.

(收稿2014-05-25)

Mutant TDP-43(A315T) induced SH-SY5Y cells apoptosis by regulate autophagy

WuShoufang＊,JiangGuangyu

＊DepartmentofNeurology,LushiPeople'sHospital,Lushi472200,China

Objective To investigate the mechanism of the TDP-43(A315T) regulate autophagy and induced apoptosis mechanism in SH-SY5Y cells. Methods The recombinant plasmid Flag-TDP-43(wt) and Flag-TDP-43(A315T) were transfected into SH-SY5Y cells transfection technique. The cells were collected 24h later, and the cell total protein were extracted to detect Beclin 1, LC3Ⅱ and LC3Ⅰprotein expressions by Western blot. The autophagic vacuoles in the cells were stained with MDC, the cell apoptotic ratio was determined with PI/Annexin V-FITC staining by flow cytometry analysis. Results Compared with the control group transfected Flag-TDP-43(wt), in the group of overexpression Flag-TDP-43(A315T), the level of Beclin 1 protein expression was decreased, and also to the level of LC3Ⅱ/LC3Ⅰ. The percentage of apoptotic cells increased in the Flag-TDP-43(A315T) group. Conclusion TDP-43 (A315T) induced apoptosis of SH-SY5Y cells by up-regulation autophagy.

TDP-43(A315T); SH-SY5Y; Autophagy; Apoptosis

國家自然科學(xué)基金項目(81100949)

R329.2+5

A

1673-5110(2014)23-0026-03