莫媛媛 侯華新 黎丹戎陳云龍 梁 燕 莫春燕 王春苗 李 竟

作者單位：530021 南寧 廣西醫(yī)科大學藥學院；△廣西腫瘤防治研究所實驗研究部

基礎研究

大黃素乙?；镏卤茄拾〤NE-1細胞線粒體自噬活性的研究

莫媛媛 侯華新 黎丹戎△陳云龍 梁 燕 莫春燕 王春苗 李 竟

作者單位：530021 南寧 廣西醫(yī)科大學藥學院；△廣西腫瘤防治研究所實驗研究部

目的 研究大黃素乙?；镒饔帽茄拾〤NE-1細胞后，其線粒體損傷及其與線粒體自噬的關系。方法 以5 mg·L-1及10 mg·L-1大黃素乙?；镒饔帽茄拾〤NE-1細胞，通過透射電鏡觀察大黃素乙?；飳е卤茄拾〤NE-1細胞自噬體形成的超微結構；激光共聚焦顯微鏡測定線粒體膜電位、細胞內鈣離子、細胞內活性氧的濃度變化及線粒體自噬的活性。結果 與空白對照組比較，兩個實驗組細胞都出現(xiàn)線粒體損傷以及線粒體自噬體。大黃素乙?；镒饔煤蟮募毎€粒體膜電位降低（P<0.05）；細胞內游離的鈣離子濃度升高（P<0.05）；細胞內活性氧增加（P<0.05），且呈劑量依賴性。經線粒體與溶酶體示蹤分析，可見大黃素乙酰化物作用的實驗組均出現(xiàn)酸性溶酶體增殖，其中包含線粒體探針標記的線粒體碎片等典型的自噬特征，且增加的趨勢呈劑量效應關系。結論 大黃素乙酰化物可致鼻咽癌CNE-1細胞線粒體損傷，并與線粒體自噬密切相關。

鼻咽腫瘤；大黃素乙酰化物；線粒體自噬；透射電鏡；激光共聚焦顯微鏡

癌細胞往往存在凋亡逃逸的現(xiàn)象，導致以促凋亡為基礎的治療療效低下，而誘導凋亡缺陷的細胞自噬死亡是減少抗癌藥物耐受性以及提高化療敏感性的一種高效的方式［1，2］。本課題組前期以大黃素為基本結構，化學合成了大黃素乙?；?，在細胞實驗中發(fā)現(xiàn)該化合物可聚集在鼻咽癌CNE-1細胞的線粒體上，無細胞毒作用的大黃素乙?；铮?0 mg·L-1）對鼻咽癌CNE-1細胞具有放射增敏活性，并伴隨線粒體的損傷［3］。為進一步研究大黃素乙?；飳Ρ茄拾┘毎€粒體損傷的機制及線粒體損傷與自噬的關系，本文通過激光掃描共聚焦顯微鏡和電鏡技術，觀察大黃素乙?；飳е卤茄拾〤NE-1細胞自噬體形成的超微結構，測定自噬過程中線粒體跨膜電位、細胞內鈣離子、細胞內活性氧的濃度等變化，探討大黃素乙?；镒鳛樽允烧T導劑的可能性。

1 材料

1.1 細胞株

鼻咽癌CNE-1細胞株由廣西腫瘤防治研究所傳代保存。細胞于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內，以10%小牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液在培養(yǎng)瓶內單層傳代培養(yǎng)。

1.2 試劑

大黃素乙?；镉杀菊n題組以大黃素為基本結構化學合成，其結構為1，8-二羥基-3-乙?；?6-甲基-9，10蒽醌，并經紅外光譜（IR）、核磁共振氫譜（1HNMR）及碳譜（13C-NMR）進行結構確證［3］?；钚匝鯔z測試劑盒購自上海碧云天公司。Fluo-3/AM購自美國Sigma公司。溶酶體探針lyso-Tracker Red和線粒體探針Mito Tracker Green為美國LIFE公司產品。

1.3 儀器

激光共聚焦顯微鏡為日本Nikon公司，型號為A1，透射電鏡為日本日立公司，型號為H7650。

2 實驗方法

2.1 實驗分組

空白對照組，不做任何處理；低濃度大黃素乙酰化物（5 mg·L-1）實驗組；高濃度大黃素乙酰化物（10 mg·L-1）實驗組。兩個實驗組所用的藥物濃度均無細胞毒性，各組細胞經藥物孵育作用1 h后，棄去含藥的培養(yǎng)基，再經正常培養(yǎng)基培養(yǎng)1 h后進行后續(xù)實驗。

2.2 細胞超微結構的觀察

對各實驗組經處理后的細胞進行消化、離心、收集，以3%戊二醛、1%鋨酸雙重固定，丙酮逐級脫水、苯二甲酸二丙烯酯包埋，超薄切片。用透射電鏡觀察和攝圖。

2.3 細胞內鈣離子濃度的測定

各組細胞經不同處理后，以PBS清洗細胞，加入10 μmol·L-1的Fluo-3/AM探針，避光、37℃孵育1 h，用無鈣緩沖液反復洗滌3次后，將細胞保存于無鈣緩沖液中并在激光掃描共聚焦顯微鏡下觀察和攝圖。每個樣本重復實驗3次。

2.4 細胞線粒體膜電位的測定

各組細胞經不同處理后，以PBS清洗細胞，加入1 ml（5 μg·ml-1）的Rhodamine 123，避光、37℃孵育30 min，以PBS洗滌3次，將細胞在激光掃描共聚焦顯微鏡下觀察和攝圖。每個樣本重復實驗3次。

2.5 細胞內活性氧的測定

各組細胞經不同處理后，以PBS清洗細胞，加入1∶1 000的DCFH-DA探針，避光、37℃孵育20 min，以無血清1640培養(yǎng)基洗滌3次后，用激光共聚焦顯微鏡掃描和攝圖。每個樣本重復實驗3次。

2.6 線粒體與溶酶體探針示蹤分析

各組細胞經不同處理后，以PBS清洗細胞，加入37℃預熱的0.5 μmol·L-1線粒體探針Mito-Tracker Green，20 min后撤去探針，再加入0.5 μmol·L-1溶酶體探針lyso-Tracker Red 20 min后，將細胞置于激光共聚焦顯微鏡下分析檢測溶酶體對線粒體的吞噬活性。

2.7 統(tǒng)計學分析

細胞線粒體膜電位、細胞內活性氧、細胞內鈣離子濃度通過NIS-element AR軟件進行統(tǒng)計分析。所有數(shù)據以均數(shù)±標準差（s）表示，采用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件的方差分析進行差異顯著性檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

3 結果

3.1 自噬線粒體的超微結構

如圖1所示，空白對照組線粒體未見有明顯損傷，細胞器結構完整，基本沒有自噬線粒體的形成；低濃度（5 mg·L-1）實驗組線粒體有些腫脹，未見脊斷裂，但空泡明顯增多，有少量自噬線粒體出現(xiàn)；高濃度（10 mg·L-1）實驗組的大部分線粒體出現(xiàn)脊融合或者消失，線粒體腫脹、空泡明顯，有些雙層膜已消失，出現(xiàn)大量的自噬線粒體（如箭頭所示）。

圖1 透射電鏡下觀察各組細胞的超微結構注：A、D.空白對照組細胞；B、E.低濃度實驗組細胞；C、F.高濃度實驗組細胞。

3.2 細胞線粒體跨膜電位

經大黃素乙?；镒饔肅NE-1細胞后，空白對照組熒光強度為40.58±3.56，其線粒體膜電位（ΔΨm）最高，而實驗組熒光強度減弱，分別為32.09±1.61和22.42±1.23，表明其線粒體跨膜電位下降，且呈劑量依賴性（F=44.143，P=0.000）。見圖2。

圖2 各組細胞線粒體跨膜電位的變化注：*與空白對照組比較，P＜0.05。

3.3 細胞內鈣離子濃度

實驗結果表明，空白對照組細胞內游離的鈣離子濃度最低為（1 166.04±77.43），而經大黃素乙?；镒饔肅NE-1細胞后，細胞中游離的鈣離子濃度隨著藥物濃度的增加而顯著升高（5 mg·L-1組為1 388.16±48.63；10 mg·L-1組為1 427.15±54.55），與空白對照組比較差異均有統(tǒng)計學意義（F=15.75，P=0.004）。見圖3。

圖3 各組細胞內游離鈣離子濃度的變化注：*與空白對照組比較，P＜0.05。

3.4 細胞內活性氧濃度

如圖4所示，細胞內活性氧的濃度隨著大黃素乙?；锏臐舛仍黾佣?。空白對照組細胞熒光強度值為816.84±53.92，5 mg·L-1和10 mg·L-1藥物實驗組的熒光強度值分別為1 027.47±34.05和1 472.66±110.68（F=61.835，P=0.000）。

3.5 線粒體探針與溶酶體探針示蹤分析

對鼻咽癌細胞的線粒體和酸性溶酶體同時采用線粒體探針Mito-Tracker Green（MTG）和溶酶體探針Lyso-Tracker Red（LTR）染色，在激光共聚焦顯微鏡下觀察去極化的線粒體是否與溶酶體融合，即是否發(fā)生了線粒體自噬，檢測細胞線粒體的自噬活性。激光共聚焦顯微鏡下觀察顯示細胞線粒體及溶酶體的形態(tài)，紅色為溶酶體探針標記的信號；綠色為線粒體探針標記的信號。合并的圖片中黃色區(qū)域顯示線粒體與溶酶體的共定位。如圖5所示，空白對照組線粒體豐富，顯影清晰，呈棒狀或短棒狀交織連接而成網狀結構，溶酶體數(shù)量較少。經大黃素乙酰化物作用后，細胞的線粒體隨著藥物濃度的增加其形狀改變?yōu)辄c狀或粒狀，與線粒體探針的結合信號減弱，而溶酶體與探針的結合信號隨著藥物劑量的增加而增強，且包含的線粒體碎片的溶酶體數(shù)量增多（黃色區(qū)域）。

圖5 大黃素乙?；镒饔肅NE-1細胞后線粒體的自噬活性注：A.空白對照組；B.5 mg·L-1實驗組；C.10 mg·L-1實驗組。

4 討論

線粒體是細胞生命活動最主要的能量供應場所，在其發(fā)揮生物效應過程中為應對細胞環(huán)境的變化而引起線粒體的損傷，從而產生線粒體自噬。線粒體自噬一般分為4個時期：①線粒體受損后其通透性轉變，線粒體去極化［4］；②形成線粒體自噬體［5］；③形成成熟的線粒體自噬溶酶體［6］；④線粒體被溶酶體降解。研究表明，自噬是一把雙刃劍，在腫瘤微環(huán)境中，自噬既能在不利的環(huán)境中提高腫瘤細胞對應激的耐受能力，維持其生存；另一方面，過度線粒體自噬可以導致細胞自噬性死亡［7］。因此，研究和開發(fā)自噬誘導劑，促使抗凋亡的腫瘤細胞或缺乏凋亡機制的腫瘤細胞發(fā)生自噬性死亡，是提高腫瘤化療敏感性的一個新方向［8］。

電子顯微鏡可以觀測到細胞內各種細胞器的超微結構，是目前檢測自噬過程自噬體形成的金標準［9］，但該法由于耗時長且存在較強的主觀性，有時候還要借助一些示蹤劑來對自噬體進行顯影。本研究選擇線粒體及溶酶體兩種探針進行染色，LTR探針主要用于標記和追蹤活細胞中的酸性細胞器，對酸性細胞器如溶酶體具有高選擇性，染色后產生紅色熒光［10］。MTG探針的細胞通透性好，與細胞簡單孵育后能被動地滲透質膜，與活性的線粒體結合發(fā)射綠色熒光。在激光共聚焦顯微鏡下實現(xiàn)對兩種細胞器已融合或者受損嚴重看不清輪廓的細胞器進行共定位。同時還可動態(tài)示蹤自噬體的形成和對細胞器自噬程度進行半定量分析。本研究以電鏡和激光共聚焦顯微鏡觀察到大黃素乙酰化物可以選擇性地損傷線粒體，誘導細胞內線粒體自噬體的產生。

已有大量文獻報道，細胞內鈣離子濃度的增加［11］、活性氧的升高［12］以及膜電位的下降［13］與線粒體損傷有關，是促發(fā)自噬的關鍵因素。本課題組前期發(fā)現(xiàn)具有蒽醌母核結構的大黃素乙酰化物，是一種生物還原性物質，易聚集在乏氧的腫瘤細胞線粒體上，導致線粒體脊腫脹、空泡化。本研究發(fā)現(xiàn)大黃素乙酰化物作用CNE-1細胞后細胞內鈣離子濃度顯著升高，細胞內活性氧濃度亦增加，而細胞線粒體跨膜電位下降。提示大黃素乙?；锟赡芘c細胞內的氧化還原酶反應，產生過量的活性氧，過量活性氧可以靶向損傷線粒體，作用于膜滲透性轉換孔（MPTP），改變其構象使其呈現(xiàn)開放狀態(tài)［14］，線粒體膜去極化，引起線粒體滲透性轉換（MPT），導致膜電位下降［15］，同時大黃素乙酰化物刺激內質網使其紊亂，造成游離鈣離子濃度的增加，破壞線粒體膜電位和ATP合成水平，最終引發(fā)自噬。

研究表明，一些天然食物及其類似物或化合物可誘導腫瘤細胞自噬和抑制增殖的作用［16］。本研究選取大黃素乙酰化物作用于鼻咽癌CNE-1細胞線粒體損傷可以誘發(fā)線粒體自噬，研究結果為開發(fā)促腫瘤細胞自噬性死亡的藥物提供了新的線索。探討自噬在腫瘤發(fā)生、發(fā)展過程中的作用及其機制，或許可以揭開抗腫瘤藥物的新篇章，但如何提高該藥物對腫瘤組織或細胞的靶向性，降低其毒副反應有待進一步研究。

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［2013-12-05收稿］［2014-01-28修回］［編輯 阮萃才］

Mitophagy of nasopharyngeal carcinoma CNE-1 cells induced by acetylated emodin derivative

MO Yuan-yuan，HOU Hua-xin，LI Dan-rong△，CHEN Yun-long，LIANG Yan，MO Chun-yan，WANG Chun-miao，LI Jing（College of Pharmaceutical Science of Guangxi Medical University；△Department of Research，Guangxi Cancer Institute，Nanning 530021，P.R. China）

HOU Hua-xin.E-mail：houhuaxin@163.com

Objective To explore the relationship between mitochondrial damage and mitophagy in nasopharyngeal carcinoma CNE-1 cells treated with acetylated emodin derivative.Methods CNE-1 cells were divided into a control group and groups treated with 5 or 10 mg·L-1of acetylated emodin derivative.After treatment，autophagosome ultrastructure was analyzed by transmission electron microscopy，while mitochondrial membrane potential and levels of intracellular free calcium ion and reactive oxygen species were measured by confocal microscopy.Results Cells treated with acetylated emodin derivative showed mitochondrial damage and the presence of mitophagosomes，which were not observed in control cells.The emodin derivative also led to a significant decrease in mitochondrial membrane potential and increases in levels of intracellular free calcium ion and reactive oxygen species（P<0.05）；these effects were dose-dependent.Analyzing mitochondrial and lysosome markers of treated cells revealed typical mitophagic features，including acidic lysosomal proliferation and lysosomes containing mitochondrial remnants labeled with Mito Tracker Green.The abundance of these features was also dose-dependent.Conclusion The acetylated emodin derivative can cause mitochondrial damage in nasopharyngeal carcinoma CNE-1 cells，perhaps through a mechanism closely related to mitophagy.

Nasopharyngeal neoplasm；Acetylated emodin derivative；Mitophagy；Transmission electron microscopy；Confocal laser scanning microscopy

R739.63

A

1674-5671（2014）01-06

10.3969/j.issn.1674-5671.2014.01.01

國家自然科學基金資助項目（81060270）；廣西醫(yī)學科學實驗中心開放基金資助項目（KFJJ2011-25）

候華新。E-mail：houhuaxin@163.com