孔 娜匡志鵬 楊 帆 李韻秋吳繼寧

作者單位：530021 南寧 廣西腫瘤防治研究所實(shí)驗(yàn)研究部；△廣西醫(yī)科大學(xué)研究生學(xué)院

基礎(chǔ)研究

Axin-1在C57BL/6J小鼠肝癌模型發(fā)生過(guò)程中的表達(dá)及意義

孔 娜△匡志鵬 楊 帆 李韻秋△吳繼寧

作者單位：530021 南寧 廣西腫瘤防治研究所實(shí)驗(yàn)研究部；△廣西醫(yī)科大學(xué)研究生學(xué)院

目的 檢測(cè)Wnt/β-catenin信號(hào)通路中Axin-1在化學(xué)誘導(dǎo)C57BL/6J小鼠肝癌模型發(fā)生過(guò)程中的表達(dá)水平，揭示W(wǎng)nt/β-catenin通路與肝癌發(fā)生的關(guān)系。方法 95只C57BL/6J小鼠隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組50只和對(duì)照組45只。實(shí)驗(yàn)組小鼠以聯(lián)合二乙基亞硝胺（DEN）/四氯化碳（CCl4）/乙醇誘導(dǎo)建立小鼠肝癌模型，對(duì)照組未予任何特殊處理。每2周定期處死兩組小鼠各5只，并取肝組織進(jìn)行病理學(xué)觀察，以實(shí)時(shí)熒光定量PCR（RT-PCR）技術(shù)、Western blot法、免疫組化法檢測(cè)并動(dòng)態(tài)觀察Axin-1 mRNA和蛋白水平的表達(dá)情況。結(jié)果 小鼠經(jīng)化學(xué)誘導(dǎo)20周后成功誘發(fā)小鼠肝癌并建立小鼠肝癌模型。RT-PCR和Western blot法檢測(cè)顯示，Axin-1 mRNA和蛋白水平的表達(dá)在誘導(dǎo)的第4周至第14周，實(shí)驗(yàn)組和同期對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；在誘導(dǎo)的第16周至第20周實(shí)驗(yàn)組和同期對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），且隨著誘癌時(shí)間的延長(zhǎng)，實(shí)驗(yàn)組Axin-1的表達(dá)逐漸降低，在誘導(dǎo)的第16周、第18周和第20周Axin-1 mRNA的相對(duì)表達(dá)量分別為0.421±0.083、0.278±0.042、0.120±0.028（P＜0.05）。免疫組化法檢測(cè)顯示Axin-1在對(duì)照組各誘導(dǎo)期均為陽(yáng)性表達(dá)，實(shí)驗(yàn)組從第16周開(kāi)始Axin-1的表達(dá)減弱，至第 20周時(shí)Axin-1幾乎不表達(dá)。結(jié)論 Wnt/β-catenin信號(hào)通路可能與肝癌的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)，其中Axin-1可能起著負(fù)性調(diào)節(jié)的作用。

肝腫瘤；Wnt/β-catenin信號(hào)通路；Axin-1；化學(xué)誘癌

目前，肝癌在世界范圍內(nèi)男性和女性癌癥死因中分別居于第二位和第六位［1］。肝癌的發(fā)生、發(fā)展是一個(gè)多因素、多基因和多階段共同作用的復(fù)雜過(guò)程，其具體發(fā)病的機(jī)制仍不清楚。目前已有研究發(fā)現(xiàn)，多條信號(hào)通路如Wnt通路、Hedgehog通路、Notch通路等對(duì)肝癌的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移起著至關(guān)重要的作用。其中Wnt/β-catenin信號(hào)通路已成為研究肝癌發(fā)病機(jī)制的熱點(diǎn)。有研究發(fā)現(xiàn)肝癌中存在Wnt通路的異常激活［2］。本文通過(guò)誘導(dǎo)建立C57BL/6J小鼠肝癌模型，觀察肝癌形成過(guò)程中Wnt/β-catenin信號(hào)通路中Axin-1的表達(dá)變化，為進(jìn)一步研究Wnt/β-catenin信號(hào)通路對(duì)肝癌發(fā)生、發(fā)展過(guò)程的調(diào)控作用打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

C57BL/6J雄性小鼠6~8周齡，體重20~30 g，購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，符合國(guó)標(biāo)GB14922-94 SPF級(jí)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。二乙基亞硝胺（DEN）購(gòu)于美國(guó)Sigma公司，四氯化碳（CCl4）購(gòu)于天津化學(xué)試劑研究所，乙醇、橄欖油購(gòu)于北京化學(xué)試劑公司，RNA提取試劑Trizol購(gòu)于美國(guó)Invitrogen公司，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自美國(guó)Thermo公司，SYBR?Premix Ex Taq TM購(gòu)于日本TaKaRa公司。蛋白裂解液RIPA、蛋白酶抑制劑PMSF、BCA試劑盒為碧云天生物技術(shù)研究所產(chǎn)品，GAPDH、Axin-1一抗購(gòu)于美國(guó)Cell Signaling公司，二抗購(gòu)于美國(guó)Proteintech Group公司。免疫組化試劑盒SP-9001、濃縮型DAB顯色試劑盒購(gòu)于北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.2 化學(xué)誘導(dǎo)小鼠肝癌模型的建立

化學(xué)誘導(dǎo)小鼠肝癌模型的建立參照文獻(xiàn)［3，4］。即95只C57BL/6J雄性小鼠購(gòu)入后先適應(yīng)環(huán)境7d，然后隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組50只和對(duì)照組45只。實(shí)驗(yàn)組小鼠首先以DEN 100 mg/kg腹腔注射。3d后以CCl4和橄欖油（配比體積為20∶80）按每次5 ml/kg灌胃，2次/周，第3周以DEN 50 mg/kg腹腔注射1次，同時(shí)給予含有9%乙醇的飲用水飲用，第4周開(kāi)始加大CCl4的劑量至8 ml/kg，共給藥20周。對(duì)照組小鼠不予任何特殊處理。兩組動(dòng)物均喂以顆粒飼料，并自由飲用滅菌的普通水。實(shí)驗(yàn)期間觀察兩組小鼠的生長(zhǎng)、體重、精神和食欲等情況。在誘癌開(kāi)始后的第4周、第6周、第8周、第10周、第12周、第14周、第16周、第18周和第20周，從實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組中各隨機(jī)抽取5只小鼠，手術(shù)摘取肝臟組織做后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3 病理組織學(xué)觀察

取實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組新鮮的小鼠肝組織，經(jīng)3%中性多聚甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋，制成5 μm的切片，HE染色后在光學(xué)顯微鏡下觀察病理組織學(xué)的變化。

1.4 RT-PCR檢測(cè)Axin-1mRNA的表達(dá)

利用Trizol提取總RNA，用紫外分光光度計(jì)測(cè)定提取的RNA的濃度。取3 μg總RNA，根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒的說(shuō)明書逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。PCR引物由上海生工設(shè)計(jì)合成，引物序列如下：Axin-1上游引物為5′-TACCTCACATTCCTCGCACTTA-3′，下游引物為5′-TCCAACTTTTCTTCAGCCTCTC-3′，產(chǎn)物大小為127 bp；內(nèi)參β-actin上游引物為5′-GTGACGTTGACATCCGTAAAGA-3′，下游引物為5′-GCCGGACTCATCGTACTCC-3′，產(chǎn)物大小為148 bp。將樣品cDNA稀釋16倍后取樣2 μl，按照TaKaRa Real-Time PCR試劑盒的說(shuō)明書在冰上配制PCR反應(yīng)液，反應(yīng)體系為20 μl。使用BIO-RAD Real-Time PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增，反應(yīng)條件為95℃變性30 s，95℃5 s，60℃30 s，共40個(gè)循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后建立溶解曲線并分析。將儀器自動(dòng)獲取的Ct值用2-ΔΔCt法計(jì)算Axin-1基因的相對(duì)表達(dá)量。

1.5 蛋白提取及Western blot法分析Axin-1蛋白的表達(dá)水平

在20 mg肝組織中加入150 μl含有蛋白酶抑制劑的蛋白裂解液，低溫勻漿提取總蛋白。按BCA試劑盒的說(shuō)明書測(cè)定蛋白濃度，-80℃貯存?zhèn)溆谩Ｈ?0 μg蛋白標(biāo)本加入上樣緩沖液，100℃變性5 min，在10% SDS-PAGE凝膠中電泳1.5 h，將蛋白移至PVDF膜，5%脫脂牛奶封閉1 h，4℃孵育一抗過(guò)夜（GAPDH和Axin-1一抗稀釋比例均為1∶1 000），然后再與1∶6 000的二抗室溫孵育1 h，TBST洗膜后顯影和定影。以Quantity One軟件測(cè)定各蛋白條帶的灰度值，計(jì)算Axin-1/GAPDH的灰度比值。

1.6 免疫組化法檢測(cè)Axin-1蛋白的表達(dá)

石蠟切片常規(guī)脫蠟，用30 ml/L H2O2滅活內(nèi)源性酶10 min，枸櫞酸鹽緩沖液抗原修復(fù)，然后按免疫組化SP法試劑盒的說(shuō)明書進(jìn)行反應(yīng)，DAB染色和蘇木精復(fù)染。Axin-1一抗工作濃度為1∶300，以PBS代替一抗作為陰性對(duì)照，每次實(shí)驗(yàn)均設(shè)陰性對(duì)照。Axin-1蛋白定位于細(xì)胞質(zhì)，以出現(xiàn)棕黃色或棕色顆粒的細(xì)胞為陽(yáng)性細(xì)胞。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

使用SPSS 16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。采用完全隨機(jī)設(shè)計(jì)資料的方差分析和t檢驗(yàn)對(duì)資料進(jìn)行比較和分析，以α=0.05的檢驗(yàn)水準(zhǔn)判斷差異有無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 化學(xué)誘導(dǎo)小鼠肝癌病理組織學(xué)的改變

實(shí)驗(yàn)組小鼠在誘癌的第8周、第18周和第20周分別死亡2只、2只和1只，死亡率為10%（5/50）；對(duì)照組45只小鼠無(wú)死亡。化學(xué)誘導(dǎo)20周后成功誘發(fā)小鼠肝癌。實(shí)驗(yàn)組小鼠在誘導(dǎo)的第8周可見(jiàn)部分肝細(xì)胞損傷，細(xì)胞變性水腫，有炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；第16周肝細(xì)胞排列紊亂，細(xì)胞開(kāi)始出現(xiàn)異型性增生，核圓形深染，可見(jiàn)核分裂相；第20周出現(xiàn)肝癌，癌細(xì)胞呈多邊形，核大深染，大小不等，核分裂相明顯，核質(zhì)比增大，細(xì)胞異型性明顯。對(duì)照組小鼠的肝組織結(jié)構(gòu)正常，肝細(xì)胞呈索狀排列，大小一致。見(jiàn)圖1。

圖1 化學(xué)誘導(dǎo)期兩組小鼠肝組織病理組織學(xué)的改變

2.2 RT-PCR法檢測(cè)Axin-1 mRNA的表達(dá)變化

如圖2所示，實(shí)驗(yàn)組小鼠Axin-1 mRNA的表達(dá)在誘導(dǎo)的第4周至第14周和同期對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；在誘導(dǎo)的第16周至第20周實(shí)驗(yàn)組小鼠Axin-1 mRNA的表達(dá)和同期對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），且隨著誘癌時(shí)間的延長(zhǎng)，實(shí)驗(yàn)組小鼠Axin-1 mRNA的相對(duì)表達(dá)量逐漸降低，在誘導(dǎo)的第16周、第18周和第20周Axin-1 mRNA的相對(duì)表達(dá)量分別為 0.421±0.083、0.278±0.042、0.120±0.028（P＜0.05）。

圖2 化學(xué)誘導(dǎo)期兩組小鼠Axin-1 mRNA的表達(dá)變化

2.3 Western blot法檢測(cè)Axin-1蛋白的表達(dá)水平

如圖3和表1所示，實(shí)驗(yàn)組小鼠Axin-1蛋白的表達(dá)水平在誘導(dǎo)的第16周之前和同期對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；而在第16周之后實(shí)驗(yàn)組和同期對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；隨著誘癌時(shí)間的延長(zhǎng)，實(shí)驗(yàn)組小鼠的Axin-1蛋白的相對(duì)表達(dá)量在第16周、第18周和第20周逐漸降低并且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

圖3 Western blot法檢測(cè)兩組小鼠Axin-1蛋白的表達(dá)

表1 化學(xué)誘導(dǎo)期小鼠肝組織Axin-1蛋白的表達(dá)水平（s）

表1 化學(xué)誘導(dǎo)期小鼠肝組織Axin-1蛋白的表達(dá)水平（s）

注：*與同期對(duì)照組比較，P＜0.05；▲與前一實(shí)驗(yàn)周期比較，P＜0.05。

誘導(dǎo)時(shí)間Axin-1蛋白的表達(dá)實(shí)驗(yàn)組 對(duì)照組第4周 0.622±0.026 0.615±0.019第6周 0.640±0.050 0.603±0.024第8周 0.602±0.051 0.584±0.055第10周 0.613±0.029 0.578±0.039第12周 0.586±0.049 0.587±0.034第14周 0.613±0.022 0.595±0.022第16周 0.392±0.035*▲0.595±0.021第18周第20周0.323±0.013*▲0.188±0.016*▲0.595±0.014 0.591±0.031

2.4 免疫組化法檢測(cè)Axin-1蛋白的表達(dá)

免疫組化法檢測(cè)顯示，Axin-1蛋白在對(duì)照組小鼠誘導(dǎo)各期中均為陽(yáng)性表達(dá)，第16周至第20周實(shí)驗(yàn)組均較同期對(duì)照組Axin-1蛋白的表達(dá)減弱；隨著誘癌時(shí)間延長(zhǎng)，實(shí)驗(yàn)組小鼠Axin-1蛋白的陽(yáng)性表達(dá)逐漸減弱，至20周時(shí)幾乎不表達(dá)。見(jiàn)圖4。

3 討論

Wnt/β-catenin信號(hào)通路常被稱為經(jīng)典Wnt信號(hào)通路，其將信號(hào)分子通過(guò)級(jí)聯(lián)方式，由細(xì)胞膜經(jīng)過(guò)細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)導(dǎo)至細(xì)胞核［5］。當(dāng)Wnt信號(hào)缺失時(shí)，Axin-1與APC、CK1α和GSK-3β形成摧毀復(fù)合體，它能有效地募集到β-catenin，并且保持絲氨酸蘇氨酸殘基磷酸化，從而引起泛素-蛋白酶體介導(dǎo)的降解過(guò)程［6］。而在Wnt信號(hào)通路活化的狀態(tài)下，β-catenin的活化被抑制，Axin的表達(dá)減少，大量β-catenin聚集轉(zhuǎn)移至核內(nèi)引起靶基因轉(zhuǎn)錄。經(jīng)典Wnt信號(hào)通路不僅在胚胎發(fā)育、細(xì)胞再生中起著重要作用，而且其異常的持續(xù)活動(dòng)與多種惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)。

圖4 免疫組化法檢測(cè)兩組小鼠化學(xué)誘導(dǎo)期Axin-1蛋白的表達(dá)

Axin-1是Wnt信號(hào)通路中重要的負(fù)性調(diào)節(jié)因子。Axin-1在結(jié)腸癌、神經(jīng)上皮瘤和髓母細(xì)胞瘤以及肝細(xì)胞癌等惡性腫瘤的錯(cuò)義突變中均可降低其表達(dá)水平［7，8］。Taniguchi等［9］在73例肝細(xì)胞癌和27例肝母細(xì)胞瘤中發(fā)現(xiàn)Axin-1的基因突變分別為9.6%和7.4%，除了大約20%肝細(xì)胞癌和80%肝母細(xì)胞瘤的發(fā)生是由于β-catenin突變外，其他10%的肝細(xì)胞癌和肝母細(xì)胞瘤可能是由于Axin-1和Axin-2突變的結(jié)果。另外，β-catenin和Axin-1基因突變發(fā)生在腫瘤形成的晚期階段，而不參與早期肝細(xì)胞癌的發(fā)生［10］。另有研究發(fā)現(xiàn)，Axin-1功能的缺失與β-catenin功能的增加是不同步的，暗示著Axin-1可能受肝癌中其他通路的調(diào)控［11］。Yang等［12］分析基因組序列發(fā)現(xiàn)Axin基因啟動(dòng)子富含CpGs，有數(shù)據(jù)表明Axin基因的甲基化可能與肺癌的發(fā)生、發(fā)展有一定的聯(lián)系。腺病毒轉(zhuǎn)染的Axin-1可抑制肝癌細(xì)胞的擴(kuò)散，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的凋亡［13］。Huang等［14］的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，Axin的1~87號(hào)氨基酸片段可增加內(nèi)源性Axin蛋白水平而不影響mRNA的表達(dá)，它并不是Axin缺失結(jié)構(gòu)域后的突變產(chǎn)物。

本實(shí)驗(yàn)以DEN/CCl4/乙醇誘導(dǎo)C57BL/6J小鼠20周，成功地誘發(fā)小鼠肝癌并建立小鼠肝癌動(dòng)物模型。此模型具有與人肝癌相似的病理過(guò)程［3］，對(duì)研究人肝癌具有十分重要的意義。本實(shí)驗(yàn)有以下發(fā)現(xiàn)：①實(shí)驗(yàn)組小鼠在化學(xué)誘癌第16周之前，肝組織細(xì)胞變性水腫、壞死，處于一個(gè)藥物性肝炎的階段，此時(shí)以RT-PCR技術(shù)、Western blot法和免疫組化法檢查，結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組和同期對(duì)照組小鼠Axin-1蛋白的表達(dá)無(wú)明顯差異，提示在細(xì)胞變性水腫階段Axin-1蛋白的表達(dá)無(wú)明顯變化；②實(shí)驗(yàn)組小鼠在誘導(dǎo)第16周之后細(xì)胞開(kāi)始出現(xiàn)異型性增生，出現(xiàn)核分裂相，直至第20周細(xì)胞異型性明顯，此時(shí)以RT-PCR技術(shù)和Western blot法檢測(cè)顯示實(shí)驗(yàn)組小鼠Axin-1蛋白的表達(dá)水平和同期對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），且隨著誘癌時(shí)間的延長(zhǎng)，Axin-1蛋白的表達(dá)逐漸降低；免疫組化法檢測(cè)示實(shí)驗(yàn)組小鼠誘導(dǎo)第16周和第20周Axin-1蛋白的表達(dá)減弱，這種變化與小鼠肝組織的病理變化相關(guān)，此時(shí)肝臟經(jīng)歷了肝硬化、非典型增生和肝癌的階段，Axin-1可能發(fā)生錯(cuò)義突變，抑制GSK-3β的活性和β-catenin的磷酸化，使β-catenin進(jìn)入細(xì)胞核并對(duì)下游靶基因進(jìn)行核轉(zhuǎn)錄，激活Wnt信號(hào)通路導(dǎo)致肝癌的發(fā)生、發(fā)展。這與Park等［10］的Axin-1基因突變發(fā)生在腫瘤形成的晚期階段而不參與肝細(xì)胞癌早期的發(fā)生互相一致。

綜上，本實(shí)驗(yàn)采用DEN/CCl4/乙醇聯(lián)合誘導(dǎo)C57BL/6J小鼠肝癌模型，在小鼠成癌過(guò)程中動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)Axin-1的表達(dá)水平，結(jié)果提示W(wǎng)nt信號(hào)通路參與了小鼠肝癌的發(fā)生、發(fā)展，Axin-1作為負(fù)性調(diào)節(jié)因子可能激活Wnt信號(hào)通路，與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后密切相關(guān)。進(jìn)一步研究Axin-1在腫瘤形成過(guò)程中的表達(dá)逐步減少的機(jī)制，有望使其成為腫瘤治療的靶點(diǎn)，有關(guān)方面值得深入研究。

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［2013-12-26收稿］［2014-01-25修回］［編輯 阮萃才］

Expression and significance of Axin-1 during chemical induction of liver cancer in C57BL/6J mice

KONG Na△，KUANG Zhi-peng，YANG Fan，LI Yun-qiu△，WU Ji-ning（Department of Research，Guangxi Cancer Institute；△Graduate School of Guangxi Medical University，Nanning 530021，P.R.China）

KUANG Zhi-peng.E-mail：kgzhou@163.com

Objective To analyze the expression of Axin-1 during chemical induction of liver cancer in C57BL/6J mice.Methods C57BL/6J mice were divided randomly into an experimental group（n=50）and a control group（n=45）.Mice in the experimental group were treated with diethylnitrosamine（DEN），carbon tetrachloride（CCl4）and ethanol for 20 weeks to induce hepatocellular carcinoma（HCC）.Every 2 weeks，5 mice in each group were sacrificed and liver samples were taken.Dynamic expression of Axin-1 was analyzed using real-time PCR，Western blotting and immunohistochemistry，while pathological changes were analyzed using hematoxylin staining.Results The 20-week DEN/CCl4/ethanol treatment successfully induced liver cancer in C57BL/6J mice.Based on real-time PCR and Western blotting，expression of Axin-1 mRNA and protein was significantly lower in the experimental group than in the control group between weeks 16 and 20.This expression decreased gradually over time in the experimental group：levels of mRNA were 0.421±0.083 at week 16，0.278±0.042 at week 18 and 0.120±0.028 at week 20（P＜0.05）.Immunohistochemistry showed detectable levels of Axin-1 staining in the control group at all time points tested；in the experimental group，however，the level of staining began to decrease at week 16 and was nearly undetectable at week 20.Conclusion The Wnt/β-catenin signalingpathway may be associated with HCC development，with Axin-1 acting to inhibit HCC progression.

Liver neoplasm；Wnt/β-catenin；Signaling pathway；Axin-1；Chemical carcinogenesis

R735.7

A

1674-5671（2014）01-05

10.3969/j.issn.1674-5671.2014.01.02

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（30760278）

匡志鵬。E-mail：kgzhou@163.com