陽 諾 馬 輝 冼 磊 陳銘伍

作者單位：530021 南寧 廣西醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院心胸外科

臨床研究

ERCC1、BAG-1及BRCA1基因在非小細胞肺癌中的表達及其與預后的關(guān)系

陽 諾 馬 輝 冼 磊 陳銘伍

作者單位：530021 南寧 廣西醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院心胸外科

目的 探討ERCC1、BAG-1和BRCA1基因mRNA在接受以鉑類為基礎輔助化療的非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）患者中的表達情況及其與預后的關(guān)系。方法 85例NSCLC患者中74例給予以鉑類為基礎的術(shù)后輔助化療，采集全組患者的腫瘤組織和其中34例患者的癌旁組織，應用半定量RT-PCR法，檢測其ERCC1、BAG-1和BRCA1基因mRNA的表達情況，回顧性分析患者的臨床病理資料，探討3個基因的表達與患者總生存期（OS）之間的關(guān)系。結(jié)果 ①ERCC1、BAG-1陰性表達的患者OS顯著長于陽性表達的患者（P均=0.001）。ERCC1、BAG-1陰性表達的患者接受鉑類化療的療效顯著優(yōu)于陽性表達的患者（P=0.002、P=0.001）。②BRCA1陰性表達的患者OS長于陽性表達的患者，但差異無統(tǒng)計學意義（P=0.057）。③多因素分析顯示ERCC1、BAG-1可作為NSCLC患者接受鉑類化療的預后指標（P=0.027、P=0.022）。結(jié)論 檢測ERCC1和BAG-1的表達可作為指導NSCLC患者術(shù)后接受鉑類化療及預后評估的指標?！娟P(guān)鍵詞】肺腫瘤；非小細胞肺癌；ERCC1；BAG-1；BRCA1；化療；預后

在我國肺癌是最常見的惡性腫瘤之一，現(xiàn)已成為導致城鄉(xiāng)居民癌癥死因的首位。手術(shù)及輔助化療是治療肺癌的主要手段，但術(shù)后患者出現(xiàn)化療耐藥往往成為治療失敗的常見原因，從而導致患者的生存期較短。目前，非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）術(shù)后化療方案以鉑類制劑（順鉑/卡鉑）聯(lián)合細胞毒性藥物（如吉西他濱、長春瑞濱和紫杉醇等）為主。有研究表明NSCLC組織中切除修復交叉互補基因1（excision repair cross-complementing 1，ERCC1）、bcl-2結(jié)合抗凋亡基因1（bcl-2 associated athanogene-1，BAG-1）及乳腺癌和卵巢癌易感基因1（breast and ovarian cancer susceptibility gene 1，BRCA1）基因mRNA的表達將直接影響NSCLC患者予鉑類制劑的治療及預后。

本研究通過檢測85例NSCLC患者癌組織和其中34例癌旁組織標本中ERCC1、BAG-1及BRCA1基因mRNA的表達情況，從基因?qū)用婊仡櫺苑治銎浔磉_水平及以鉑類為基礎的化療方案與NSCLC患者預后的關(guān)系，從而指導NSCLC患者術(shù)后化療藥物的選擇。

1 材料和方法

1.1 臨床資料

1.1.1 研究對象 收集2007年8月至2009年5月在廣西醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院心胸外科經(jīng)手術(shù)切除并經(jīng)病理確診的85例NSCLC標本，患者年齡為24～84歲,其中鱗癌25例，腺癌60例。采用UICC 2003標準進行TNM分期，其中Ⅰ期＋Ⅱ期48例，Ⅲ期＋Ⅳ期37例。高、中分化58例，低分化27例。有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者28例，無淋巴轉(zhuǎn)移57例。同時收集其中34例癌旁組織（癌組織外5cm的肺組織）作為對照。手術(shù)切除的新鮮組織離體后迅速貯于-80℃低溫冰箱備用。術(shù)前全組患者均未接受放療或化療。85例患者中Ⅰb期11例，術(shù)后僅給予定期復查、隨訪，余74例均給予以鉑類為基礎的術(shù)后化療方案化療。本研究所有標本的取得均已簽署知情同意書。

1.1.2 隨訪 總生存期（OS）為手術(shù)當日至隨訪截止日期（2011年6月1日），或因復發(fā)、轉(zhuǎn)移導致死亡的日期。

1.2 半定量RT-PCR法檢測NSCLC癌組織中3種基因的表達

NSCLC癌組織中ERCC1、BAG-1和BRCA1 mRNA的表達應用Trizol法提取總RNA（Trizol總RNA提取試劑購自美國Invitrogen公司，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒Revert AidTM First Strand cDNA購自美國Fermentas公司），總RNA經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄獲得cDNA。檢測的基因及內(nèi)參引物均由上海捷瑞公司合成。ERCC1基因序列：上游引物為5′-CCCTGGGAATTTGGCGACGTAA-3′；下游引物為5′-CTCCAGGTACCGCCCAGCTTCC-3′，片段大小為273 bp。BAG-1基因序列：上游引物為5′-GGCAGCAGTGAACCAGTTG-3′；下游引物為5′-GCTATCTTCTCCACAGACTTCTC-3′，片段大小為242 bp。BRCA1基因序列：上游引物為5′-AAGGTTGTTGATGTGGAGGAG-3′；下游引物為5′-CAGAGGTTGAAGATGGTATGTTG-3'′，片段大小為208 bp。β-actin為內(nèi)參基因：上游引物為5′-CTCGCGTACTCTCTCTTTCTGG-3′；下游引物為5′-GCTTACATGTCTCGATCCCACTTAA-3′，片段大小為334 bp。PCR反應體系總體積為25 μl。反應條件：預變性94℃3 min 30 s，變性94℃40 s，退火溫度為40 s，72℃延伸50 s，30個循環(huán)后，總延伸72℃5 min。取PCR反應產(chǎn)物各6 μl均勻上樣于含溴化乙錠的2%瓊脂糖凝膠中，以Bio-Rad Gel Doc 2000凝膠成像系統(tǒng)拍照并記錄。

預實驗PCR產(chǎn)物送至北京諾賽基因組研究中心測序，將ERCC1、BAG-1和BRCA1基因片段的測序結(jié)果與NCBI（美國國立生物技術(shù)信息中心）中的Nucleotide Blast進行比對，結(jié)果完全匹配。然后采取同樣的步驟進行大樣本檢測，β-actin為內(nèi)參，不加模板的反應體系為陰性對照，以測序證實為ERCC1、BAG-1或BRCA1基因的產(chǎn)物為陽性對照，排除基因組DNA污染和排除假陰性，并將編號的試驗結(jié)果隨機抽樣進行測序以確保大樣本的準確性。將組織標本PCR擴增產(chǎn)物進行電泳，出現(xiàn)目的條帶者為陽性表達，反之為陰性表達。

1.3 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件處理分析實驗數(shù)據(jù)。計數(shù)資料的比較采用χ2檢驗或Fisher′s確切概率法；采用KaPlan-Meier法進行單因素生存分析，以Cox回歸模型進行多因素分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 NSCLC癌組織中ERCC1、BAG-1、BRCA1基因的表達情況

從凝膠電泳圖中可以看到大小約為273 bp、242 bp、208 bp及334 bp 4個條帶，這與目的基因及內(nèi)參基因測序結(jié)果一致，表明NSCLC癌組織中均存在3個基因的表達，內(nèi)參穩(wěn)定。見圖1。

2.2 ERCC1、BAG-1和BRCA1的表達與患者臨床病理特征的關(guān)系

ERCC1在85例NSCLC癌組織和34例癌旁組織中均有陽性表達，其陽性率分別為58.8%（50/85）和55.9%（19/34），差異無統(tǒng)計學意義（χ2=0.086，P=0.769）；BAG-1和BRCA1在NSCLC癌組織和癌旁組織中均有陽性表達，其陽性率分別為37.6%（32/85）、82.4%（28/34）（χ2=19.416，P=0.000）和16.5%（14/85）、44.1%（15/34）（χ2=9.265，P<0.05），差異均有統(tǒng)計學意義；ERCC1的表達與NSCLC的TNM分期（P=0.006）和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與否有關(guān)（P=0.01），而與患者性別、年齡、民族、組織學類型及分化程度等無關(guān)（P均>0.05）；BAG-1及BRCA1的表達與患者各臨床病理特征均無關(guān)（P均>0.05）。見表1。

圖1 ERCC1、BAG-1及BRCA1的凝膠電泳圖（A為ERCC1；B為BAG-1；C為BRCA1）注：M.marker對照；1.β-actin內(nèi)對照；2.陽性對照；3.空白對照；4～7.NSCLC癌組織；4、6.陽性表達；5、7.陰性表達。

表1 NSCLC患者ERCC1、BAG-1及BRCA1基因的表達與臨床病理特征的關(guān)系（n）

2.3 ERCC1、BAG-1和BRCA1的表達與患者總生存期的關(guān)系

NSCLC患者OS為2.3～42.6個月，平均27.2個月。ERCC1、BAG-1陰性表達的患者其OS顯著高于陽性表達的患者（＞42.6個月vs 19.7個月，P=0.001；32.3個月vs 15.2個月，P=0.002）（圖2）；BRCA1基因的表達與患者的OS差異無統(tǒng)計學意義（P=0.057）。單因素分析發(fā)現(xiàn)ERCC1的表達（P=0.002）、BAG-1的表達（P=0.001）、TNM分期（P=0.008）和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與否（P=0.007）與患者OS相關(guān)，而BRCA1的表達與患者OS無明顯相關(guān)，差異無統(tǒng)計學意義（P=0.057）。見表2。

將NSCLC患者ERCC1、BAG-1的表達、TNM分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等通過Cox回歸模型進行多因素分析，結(jié)果表明ERCC1及BAG-1在腫瘤組織中的表達情況可獨立影響NSCLC患者的預后（P均<0.05），而淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和TNM分期與患者OS無明顯相關(guān)（P均>0.05）。見表3。

圖2 NSCLC患者ERCC1和BAG-1表達的總生存曲線注：A.ERCC1；B.BAG-1。

表2 NSCLC患者的臨床病理特征及ERCC1、BAG-1、BRCA1的表達與患者OS的單因素分析

表3 NSCLC患者ERCC1、BAG-1的表達及臨床病理特征與患者OS的多因素分析

3 討論

目前，許多研究表明DNA修復能力與NSCLC的發(fā)生及化療耐藥密切相關(guān)，臨床上僅依靠病理類型及臨床分期來指導NSCLC患者的治療及評估預后，其效果并不理想。因此，我們試圖從基因?qū)用嬲业揭恍┡cNSCLC密切相關(guān)的標志物，用以指導NSCLC的治療及評估預后，以提高NSCLC的治療效果。

ERCC1是人類第一個通過克隆得到的DNA損傷修復基因，它參與DNA鏈的切割及損傷識別，其表達量直接影響DNA修復的生理過程［1］。有研究表明，ERCC1在修復內(nèi)源性或外源性致癌物質(zhì)所導致的DNA損傷過程中發(fā)揮重要作用［2］。鉑類化療藥物的藥理作用主要是通過形成鉑類-DNA加合物和兩股DNA鏈的交聯(lián)來發(fā)揮其細胞毒性，而ERCC1在鉑類藥物所誘導的細胞毒性過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用［3］。有研究表明，在鉑類耐藥的NSCLC A549細胞株中，其ERCC1呈高表達［4］。ERCC1陽性表達患者的OS低于陰性表達的患者，且術(shù)后輔助化療效果差于陰性表達的患者［5］。本研究檢測85例NSCLC患者癌組織中ERCC1 mRNA的表達情況，發(fā)現(xiàn)ERCC1陰性表達的患者其OS顯著高于陽性表達的患者（＞42.6個月vs 19.7個月），從而提示ERCC1的表達與NSCLC的預后密切相關(guān)。同時，本研究還發(fā)現(xiàn)ERCC1的表達和TNM分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與否密切相關(guān)，TNM分期越高，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移越廣泛，ERCC1表達的陽性率越高，提示ERCC1的表達與腫瘤的侵襲性及預后不良呈正相關(guān)，這與Ota等［6］的研究一致。但也有部分文獻報道NSCLC患者癌組織中ERCC1呈陽性表達者可能有較好的預后［7，8］，這種差異可能是由于不同的實驗過程、不同實驗技術(shù)的選擇和不同的地區(qū)差異等因素造成。

BAG-1是一種多功能調(diào)節(jié)蛋白，通過與多種基因蛋白產(chǎn)物相互作用來調(diào)節(jié)細胞的凋亡與增殖［9］。有研究表明，BAG-1在乳腺癌、NSCLC和結(jié)腸癌等腫瘤組織中呈陽性表達，而在正常組織中幾乎不表達，BAG-1的表達與患者的預后不良呈正相關(guān)［10，11］，因此BAG-1可用于評估乳腺癌、NSCLC和結(jié)腸癌等多種腫瘤的預后。本研究我們發(fā)現(xiàn)BAG-1在NSCLC癌組織中的陽性表達率為37.6%（32/85），遠低于癌旁組織的82.4%（28/34），說明BAG-1在癌組織中的抗凋亡作用明顯下降，這可能成為腫瘤發(fā)展的因素之一。此外，我們還發(fā)現(xiàn)BAG-1呈陽性表達的患者其OS顯著低于陰性表達的患者（15.2個月vs 32.3個月），提示BAG-1的表達可作為評估NSCLC患者預后的一個重要因素。同時，我們通過單因素分析，結(jié)果表明BAG-1的表達、TNM分期以及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與否等是影響NSCLC患者OS的因素，而其中BAG-1基因的表達是影響患者預后的獨立因素，這與王偉強等［12］的研究結(jié)果一致。

BRCA1參與細胞有絲分裂的過程，在DNA的損傷修復中同樣起著關(guān)鍵性的作用［13］。已有研究表明BRCA1在NSCLC患者預后中有潛在預測的作用［14］。在本研究中我們發(fā)現(xiàn)BRCA1陰性表達的患者其OS長于陽性者，但兩者差異無統(tǒng)計學意義（P=0.057），這可能受限于隨訪時間和樣本的數(shù)量所致，期待進一步探索和驗證。

綜上，ERCC1和 BAG-1的表達可作為指導NSCLC患者術(shù)后予鉑類化療及預后評估的一個重要參考指標，有關(guān)方面值得深入研究。

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［2013-11-29收稿］［2014-02-11修回］［編輯 阮萃才］

Expression and prognostic significance of ERCC1 BAG-1 and BRCA1 mRNA in non-small cell lung cancer

YANG Nuo，MA Hui，XIAN Lei，CHEN Ming-wu（Department of Cardiothoracic Surgery，F(xiàn)irst Affiliated Hospital of Guangxi Medical University，Nanning 530021，P.R.China）

XIAN Lei.E-mail：xianlei59@163.com

Objective To investigate the expression and prognostic usefulness of ERCC1，BAG-1 and BRCA1 in patients with nonsmall cell lung cancer（NSCLC）treated with platinum-based adjuvant chemotherapy.Methods RT-PCR was used to investigate the mRNA expression of ERCC1，BAG-1 and BRCA1 in 85 samples of NSCLC tissues and 34 tumor-adjacent tissues.Relationships of the expression of these three genes with overall survival（OS）were analyzed.Results①OS was significantly longer in patients negative for ERCC1 or BAG-1 mRNA expression than in those positive for expression of either gene（P=0.001）.Platinum-based chemotherapy was more effective for patients negative for ERCC1 or BAG-1 than for the corresponding positive patients（P=0.001 and P=0.002），respectively.②OS may be longer in patients negative for BRCA1 mRNA expression than in BRCA1-positive patients（P=0.052）.③Multivariate analysis suggests that ERCC1 and BAG-1 may be prognostic indicators for patients receiving platinum-based adjuvant chemotherapy（P=0.027 and P=0.022）.Conclusion Expression of ERCC1 and BAG-1 mRNA may be useful in the prognosis of NSCLC treated with platinum.

Lung neoplasm；Non-small cell lung cancer；ERCC1；BAG-1；BRCA1；Chemotherapy；Prognosis

R734.2

A

1674-5671（2014）01-05

10.3969/j.issn.1674-5671.2014.01.06

廣西科學研究與技術(shù)開發(fā)計劃項目（桂科攻10124001A-44）；廣西留學回國人員科學基金資助項目（桂科回0832011）；廣西衛(wèi)生廳科研基金資助課題（Z2011329）

冼 磊。E-mail：xianlei59@163.com