許 颯寧淑芳 利基林 馮 雁 唐艷萍 駱成飄 張力圖

作者單位：530021 南寧 廣西腫瘤防治研究所實驗研究部；△廣西醫(yī)科大學研究生學院

基礎(chǔ)研究

人肝癌細胞系中CD90+細胞的生物學特性

許 颯△寧淑芳 利基林 馮 雁 唐艷萍 駱成飄 張力圖

作者單位：530021 南寧 廣西腫瘤防治研究所實驗研究部；△廣西醫(yī)科大學研究生學院

目的 篩選肝癌細胞系中CD90（Thy-1）陽性表達的細胞，初步探討CD90+細胞亞群的干細胞特性。方法 利用流式細胞分選術(shù)篩選5種肝癌細胞株（HepG2、SMMC-7721、Bel-7404、Bel-7403及SK-Hep-1）中CD90（Thy-1）陽性表達的細胞，以平板克隆形成實驗觀察其增殖能力，CCK-8法觀察CD90+細胞的增殖能力和順鉑對CD90+細胞的抑制率。結(jié)果 肝癌細胞株Sk-Hep-1中有66.02%的細胞CD90呈陽性表達。平板克隆形成實驗顯示CD90+細胞克隆形成率為（18.60±2.95）%，顯著高于CD90-細胞及未分選細胞，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。體外實驗顯示培養(yǎng)4 d后CD90+細胞的增殖較CD90-及未分選細胞明顯加快；CD90+細胞在相同濃度的順鉑作用下其抑制率較CD90-細胞和未分選細胞明顯降低，三者的抑制率分別為14.8%、29.7%和24.0%，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。結(jié)論 肝癌細胞中的CD90+細胞是具有腫瘤干細胞特性的細胞亞群，CD90可能是肝癌干細胞候選的分子標志物。

肝腫瘤；流式細胞分選術(shù)；CD90；Thy-1；干細胞；順鉑；抗藥性，腫瘤；生物學特性

肝細胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC，簡稱肝癌）是世界上第六大常見癌癥［1］，近年來雖然腫瘤的診斷和治療技術(shù)在不斷更新和發(fā)展，但肝癌死亡率仍居高不下，每年約有60萬人死于此病，其死亡率在男性腫瘤中位居第二位［2］。肝臟切除術(shù)和肝移植是HCC主要的治療方法［3］，但術(shù)后發(fā)生轉(zhuǎn)移或復發(fā)的比例仍較高。1977年Hamburger等［4］在干細胞的理論基礎(chǔ)上提出了“腫瘤干細胞（cancer stem cell，CSC）”的概念，使人類對腫瘤有了更多新的認識。目前，我們對肝癌干細胞的研究還處于探索階段。2008年Yang等［5，6］從肝癌組織中分離獲得肝癌干細胞，在肝癌中發(fā)現(xiàn)了腫瘤干細胞的存在。本實驗主要研究腫瘤干細胞的分選和肝癌細胞系中CD90的表達情況，并初步探討CD90+細胞體外增殖、抗藥性等特性，為進一步研究肝癌干細胞的生物學特性奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

DMEM（高糖）、RPMI-1640和胎牛血清均購自美國Hyclone公司，鹽酸左氧氟沙星氯化鈉注射液購自揚子江藥業(yè)有限責任公司，鼠抗人CD90單克隆抗體購自美國eBioscience公司，5種肝癌細胞株（HepG2、SMMC-7721、Bel-7404、Bel-7403和Sk-Hep-1）由廣西腫瘤防治研究所實驗研究部提供。流式細胞分選儀為美國BD公司產(chǎn)品。

1.2 實驗方法

1.2.1 肝癌細胞株的培養(yǎng) 肝癌細胞株HepG2用含10%胎牛血清和10 μl/ml鹽酸左氧氟沙星氯化鈉注射液的DMEM（高糖）培養(yǎng)基培養(yǎng)。余4種肝癌細胞株（SMMC-7721、Bel-7404、Bel-7403及Sk-Hep-1）分別用含10%胎牛血清、10 μl/ml鹽酸左氧氟沙星的RPMI-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)。細胞置于5%CO2、37℃恒溫培養(yǎng)箱中傳代培養(yǎng)。實驗采用對數(shù)生長期的細胞作為研究對象。

1.2.2 流式細胞分選術(shù)（fluorescence-activated cell sorting，F(xiàn)ACS）檢測肝癌細胞株中CD90的表達 選取對數(shù)生長期的肝癌細胞株，用不含EDTA的0.25%胰酶分別消化，培養(yǎng)液終止消化，吹打、制備單細胞懸液，離心（1 000 r/min，5 min）去上清液，計數(shù)并調(diào)整每管細胞數(shù)量為1×107個細胞。用含2%胎牛血清的磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer solution，PBS）洗滌，離心，制備單細胞懸液，分別加入鼠抗人單克隆抗體CD90 5 μl，用PBS將終體積定至100 μl，室溫避光孵育30 min，并設(shè)立陰性對照。用含2%胎牛血清的PBS洗滌細胞兩次，離心去上清液，每管加入500 μl含2%胎牛血清的PBS吹打，制備單細胞懸液，過濾，以流式細胞分選儀檢測細胞中CD90的表達量。

1.2.3 熒光顯微鏡下觀察抗體標記的細胞 根據(jù)細胞表面標志物，利用FACS從Sk-Hep-1細胞株中分選出CD90+細胞。收集分選出的CD90+細胞，取適量細胞懸液滴于載玻片，避光靜置20 min，待細胞沉淀后，利用熒光顯微鏡檢測細胞的熒光表達情況。

1.2.4 CCK-8法檢測細胞體外增殖能力 將分選獲得的CD90+細胞、CD90-細胞和未分選的細胞，用無血清培養(yǎng)基稀釋至1×104/ml，接種至96孔板，每孔0.2 ml，每孔設(shè)置8個平行孔，在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2 d換1次液體，用CCK-8法分別在1 d、3 d、5 d、7 d測定各種細胞的增殖情況。

1.2.5 細胞耐藥能力的比較 將CD90+細胞、CD90-細胞和未分選的細胞亞群，以2 500個細胞/孔接種至96孔板，每種細胞設(shè)置對照組和加藥組，每組設(shè)8個復孔。輕輕晃動96孔板以混勻細胞，于恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h后更換培養(yǎng)基，將每種細胞的加藥組加入濃度為12 μmol/L的順鉑培養(yǎng)基200 μl，對照組加入等量不含順鉑的完全培養(yǎng)基，48 h更換1次相應培養(yǎng)基，96 h后采用CCK-8法檢測A450值，計算抑制率。抑制率（%）=（A0-Am）/A0×100%。A0為對照組A450值，Am為加藥孔A450值。

1.2.6 平板克隆形成實驗 將流式細胞分選儀分選出CD90+細胞和CD90-細胞，在6孔板中接種1 000個細胞進行培養(yǎng)，每種細胞接種3個孔，輕輕晃動6孔板使細胞分布均勻，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)15 d左右。當出現(xiàn)肉眼可見的細胞克隆時，棄掉培養(yǎng)液終止培養(yǎng)，以PBS液輕洗3次，用吉姆薩染色15 min，流水緩慢沖洗染料，待孔板干燥后于顯微鏡下計數(shù)形成的克隆數(shù)（≥50個細胞為1個克?。?。平板克隆形成率（%）=形成的克隆數(shù)/接種細胞數(shù)× 100%。

1.3 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 16.0軟件對數(shù)據(jù)進行處理和分析。計量資料的比較用t檢驗，計數(shù)資料的比較用χ2檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 FACS分選的結(jié)果

經(jīng)FACS分選得出肝癌細胞株HepG2中CD90的陽性表達率為0.15%，Sk-Hep-1中CD90的陽性表達率為66.02%，其余細胞株均未檢測到CD90的陽性表達。見圖1。

2.2 熒光顯微鏡檢測分選細胞的純度

在熒光顯微鏡下觀察分選后的CD90+細胞，CD90陽性表達的SK-Hep-1細胞在顯微鏡下可見95%以上細胞的細胞膜發(fā)出綠色熒光（圖2）。表明本實驗經(jīng)FACS分選所獲得細胞純度較高。

2.3 CCK-8法檢測細胞體外增殖的能力

CCK-8法檢測CD90+細胞、CD90-細胞和未分選細胞的增殖能力。從圖3可見，自培養(yǎng)的第3天開始，CD90+細胞的增殖快速，而未分選的細胞和CD90-細胞的增殖緩慢，到第7天，CD90+細胞、CD90-細胞和未分選細胞的A450值分別為1.056±0.027、0.567±0.019和0.805±0.021，CD90+細胞較后兩者細胞的增殖明顯加快，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。

圖2 熒光顯微鏡下觀察分選后CD90陽性表達的SK-Hep-1細胞（×200）

圖3 CCK-8法檢測CD90+細胞、CD90-細胞及未分選細胞的生長曲線

2.4 細胞耐藥能力的比較

以CCK-8法對CD90+細胞、CD90-細胞和未分選細胞抵抗順鉑的能力進行檢測。經(jīng)12 μmol/L的順鉑培養(yǎng)4 d，3種細胞的生長抑制率分別為14.8%、29.7%和24.0%。CD90+細胞的抑制率明顯低于其余兩種細胞，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見圖4。

圖4 在12 μmol/L的順鉑作用下3種細胞的生長抑制率

2.5 平板克隆形成實驗檢測3種細胞的克隆形成數(shù)

實驗結(jié)果顯示，CD90+細胞的克隆形成率為（18.60±2.95）%，CD90-細胞的克隆形成率為（3.77±1.44）%，未分選細胞為（11.17±1.92）%，表明CD90+細胞的克隆形成率明顯高于CD90-細胞和未分選細胞，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見圖5。

圖5 平板克隆形成實驗檢測3種細胞的克隆形成數(shù)

3 討論

為了尋找患者體內(nèi)腫瘤細胞的特異性療法，因此對腫瘤干細胞的研究一直是熱點課題［7］，而分選腫瘤干細胞是對干細胞特性研究的第一步。目前，鑒定腫瘤干細胞最權(quán)威的方法是確定腫瘤干細胞的特異性細胞表面的標志［8］。有研究表明CD90標志的細胞分子參與肝癌的發(fā)生和發(fā)展［9］，因此必須根據(jù)細胞標志分選出腫瘤干細胞。目前肝癌干細胞的分離方法主要有磁性激活細胞分選術(shù)（magnetic activated cell sorting，MACS）和FACS，后者也稱熒光激活細胞分選術(shù)。MACS較簡單且容易操作，但分離細胞的效率和精確度相對較低，適用于對分選細胞純度要求相對較低的實驗；FACS雖操作復雜，但分選后的細胞純度和精確度較高，細胞回收率也相對較高，因此更適用于含量相對較低的細胞分選。這兩種分選方法共同的特點均依賴于腫瘤干細胞的表面標志。因此本實驗采用FACS分選CD90+細胞。

CD90是一種25~37 kDa的糖蛋白，通過甘油二酯（DAG）固定于糖磷脂酰肌醇（GPI）的C末端，附著在細胞膜的內(nèi)側(cè)面。CD90在細胞與細胞之間以及細胞與基質(zhì)之間的相互作用、細胞的凋亡、黏附、遷移、腫瘤演進和纖維化都起到十分重要的作用［10］。Saalbach等［11］研究證實，Thy-1（CD90）是人類微血管內(nèi)皮細胞活化的標志，它在腫瘤細胞血行轉(zhuǎn)移過程中可能起某種作用。另外，Herrera等［12］的研究表明，CD90表達于肝干細胞/肝祖細胞中（hepatic stem/progenitor cells，HSPCs）。2008年Yang等［5，6］成功地從肝癌組織中分離獲得肝癌干細胞，并證明表達CD90的肝癌細胞具有自我更新、多向分化和高致瘤性，是肝癌干細胞的特異性標志物。本實驗從肝癌細胞株SK-Hep-1中篩選出CD90+細胞，其CD90的陽性表達率為66.02%，這與 Yamashita等［13］研究肝癌細胞株SK-Hep-1中CD90陽性表達率為59.00%的數(shù)據(jù)相近。

本實驗成功地從肝癌細胞系中分選出CD90+細胞，并用免疫熒光染色法對分選細胞進行純度評估，結(jié)果表明通過FACS分選可獲得高純度的CD90+細胞。實驗中對CD90+細胞、CD90-細胞及未分選細胞的生長曲線進行分析以及平板克隆形成實驗，結(jié)果表明CD90+細胞的增殖能力及克隆形成能力均高于CD90-細胞及未分選細胞，這與文獻［14］報道的結(jié)果一致；在抗藥性實驗的研究中，CD90+細胞的抗藥性明顯比CD90-細胞和未分選的細胞強，這與以往的研究結(jié)果相似［15］。由此說明肝癌細胞中的確存在一部分細胞的生物學特性與其他細胞不同。本實驗經(jīng)FACS分選的SK-Hep-1細胞株中CD90的陽性表達率高于HepG2中CD90的陽性表達率，而其余3株肝癌細胞均未檢測到CD90的陽性表達，可能與細胞不同的生物學特性有關(guān)，有關(guān)方面值得深入研究。

本實驗通過FACS從5種肝癌細胞株中篩選出CD90+細胞，并進行了一系列體外實驗。結(jié)果表明CD90+細胞具有生長迅速、克隆形成率高和抗藥性強等腫瘤干細胞的特點。今后我們將篩選出的細胞亞群接種于裸鼠體內(nèi)，觀察各細胞亞群的體內(nèi)成瘤能力等特性，為肝癌干細胞的進一步研究奠定基礎(chǔ)。

［1］ Forner A，Llovet JM，Bruix J.Hepatocellular carcinoma［J］.Lancet，2012，379（9822）：1245-1255.

［2］ Jemal A，Bray F，Center MM，et al.Global cancer statistics［J］.CA Cancer J Clin，2011，61（2）：69-90.

［3］ Mazzaferro V，Regalia E，Doci R，et al.Liver transplantation for the treatment of small hepatocellular carcinomas in patients with cirrhosis［J］.N Engl J Med，1996，334（11）：693-699.

［4］ Hamburger AW，Salmon SE.Primary bioassay of human tumor stem cells［J］.Science，1977，197（4302）：461-463.

［5］ Yang ZF，Ngai P，Ho DW，et al.Identification of local and circulating cancer stem cells in human liver cancer［J］.Hepatology，2008，47（3）：919-928.

［6］ Yang ZF，Ho DW，Ng MN，et al.Significance of CD90+cancer stem cells in human liver cancer［J］.Cancer Cell，2008，13（2）：153-166.

［7］ Mishra L，Banker T，Murray J，et al.Liver stem cells and hepatocellular carcinoma［J］.Hepatology，2009，49（1）：318-329.

［8］ Lapidot T，Sirard C，Vormoor J，et al.A cell initiating human acute myeloid leukaemia after transplantation into SCID mice［J］.Nature，1994，367（6464）：645-648.

［9］ 張珍妮，匡志鵬，楊 帆，等.肝癌干細胞標志CD90在化學誘癌過程中的動態(tài)變化［J］.中國癌癥防治雜志，2012，4（2）：127-130.

［10］Rege TA，Hagood JS.Thy-1 as a regulator of cell-cell and cell-matrix interactions in axon regeneration，apoptosis，adhesion，migration，cancer，and fibrosis［J］.Faseb J，2006，20（8）：1045-1054.

［11］ Saalbach A，Hildebrandt G，Haustein UF，et al.The Thy-1/Thy-1 ligand interaction is involved in binding of melanoma cells to activated Thy-1-positive microvascular endothelial cells［J］.Microvasc Res，2002，64（1）：86-93.

［12］Herrera MB，Bruno S，Buttiglieri S，et al.Isolation and characterization of a stem cell population from adult human liver［J］.Stem Cells，2006，24（12）：2840-2850.

［13］ Yamashita T，Honda M，Nakamoto Y，et al.Discrete nature of EpCAM+and CD90+cancer stem cells in human hepatocellular carcinoma［J］.Hepatology，2013，57（4）：1484-1497.

［14］王海麗，文 忠，申聰香，等.人鼻咽癌CD133+干細胞的生物學特性及意義［J］.中國組織工程研究，2012，16（6）：1007-1010.

［15］Zhu Z，Hao X，Yan M，et al.Cancer stem/progenitor cells are highly enriched in CD133+CD44+population in hepatocellular carcinoma［J］. Int J Cancer，2010，126（9）：2067-2078.

［2014-01-05收稿］［2014-02-25修回］［編輯 阮萃才］

Biological Characteristics of CD90+Cells in Human Hepatocellular Carcinoma Cell Lines

XU Sa△，NING Shu-fang，LI Ji-lin，F(xiàn)ENG Yan，TANG Yan-ping，LUO Cheng-piao，ZHANG Li-tu（Department of Research，Guangxi Cancer Institute；△Graduate School of Guangxi Medical University，Nanning 530021，P.R.China）

ZHANG Li-tu.E-mail：zhanglitu@gmail.com

Objective To isolate CD90+（Thy-1+）cells from human hepatocellular carcinoma（HCC）cell lines and to study their stem cell properties.Methods Fluorescence-activated cell sorting was used to detect CD90 expression in five HCC cell lines：HepG2，SMMC-7721，Bel-7404，Bel-7403 and SK-Hep-1.The tablet clone formation test was used to measure the colony-forming ability of the sorted CD90+cells，and the CCK-8 assay was used to analyze their proliferation ability and their sensitivity to cisplatin.Results CD90 expression was detected in 66.02%of Sk-Hep-1 cells.The pelletizing rate of these CD90+cells was（18.6±2.95）%in the tablet colony formation assay，significantly higher than that of CD90-and unsorted cells（P＜0.05）.Proliferation after 4 days in culture was significantly greater for CD90+cells than for CD90-and unsorted cells.Cisplatin inhibited growth of CD90+cells by 14.8%，significantly less than it inhibited the growth of CD90-cells（29.7%，P＜0.05）and unsorted cells（24.0%，P＜0.05）.Conclusion CD90+cells are a subpopulation with tumor stem cell properties.CD90 may be a candidate biomarker for HCC stem cells.

Hepatocellular neoplasm；Fluorescence-activated cell sorting；CD90；Thy-1；Stem cell；Cisplatin；Drug resistance，neoplasm；Biological characteristics

R735.7

A

1674-5671（2014）01-05

10.3969/j.issn.1674-5671.2014.01.03

廣西科學研究與技術(shù)開發(fā)計劃課題（桂科攻1355005-3-10）；廣西醫(yī)科大學青年科學基金項目（GXMUYSF201215）

張力圖。E-mail：zhanglitu@gmail.com