湯 帆覃宇周 林 源 茹海明 謝學(xué)成

作者單位：530021 南寧 廣西醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院胃腸外科；△廣西醫(yī)科大學(xué)研究生學(xué)院

臨床研究

Ku70和端粒酶及端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶預(yù)測直腸癌新輔助放化療的療效

湯 帆△覃宇周 林 源 茹海明 謝學(xué)成△

作者單位：530021 南寧 廣西醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院胃腸外科；△廣西醫(yī)科大學(xué)研究生學(xué)院

目的 研究Ku70、端粒酶（telomerase）及端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶（hTERT）3種蛋白預(yù)測Ⅱ期和Ⅲ期直腸癌放療聯(lián)合XELOX方案化療的療效。方法 根據(jù)新輔助放化療前后影像學(xué)檢查的療效評價(jià)，將入組患者分為有效組27例和無效組18例；采用免疫組化SP法檢測兩組患者新輔助放化療前后Ku70、端粒酶及hTERT蛋白的表達(dá)情況，并分析其與療效的關(guān)系。結(jié)果 有效組患者h(yuǎn)TERT蛋白的表達(dá)水平比無效組低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。Ku70、端粒酶蛋白在有效組與無效組患者中的表達(dá)水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。Ku70、端粒酶及hTERT蛋白的表達(dá)水平在放化療前后的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。直腸癌患者新輔助放化療的療效與患者KPS評分、性別、年齡和病理類型等無關(guān)（P>0.05）。結(jié)論 hTERT蛋白的表達(dá)可以反映Ⅱ期和Ⅲ期直腸癌患者予放療聯(lián)合XELOX方案化療的新輔助放化療的療效。

直腸腫瘤；Ku70；端粒酶；端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶；新輔助放化療；療效

新輔助放化療是促進(jìn)腫瘤降期、進(jìn)一步提高療效的有效措施［1］，XELOX方案聯(lián)合放療是直腸癌新輔助放化療的方案之一，但臨床上不同患者之間的療效各異，且目前尚缺該方案療效的預(yù)測指標(biāo)。因此制訂療效評估標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行治療以獲得更好的療效，是直腸癌新輔助放化療關(guān)注的問題之一［2］。人端粒酶（telomerase）是由端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶（hTERT）、端粒酶RNA和假尿嘧啶合成酶組成。Shin等［3］報(bào)道端粒酶及hTERT蛋白的表達(dá)情況可以反映直腸癌放療的敏感性。Ku70是一種二聚體蛋白，主要表達(dá)在腫瘤細(xì)胞核中，研究表明其表達(dá)與放療敏感性相關(guān)［4］。本研究探討Ku70、端粒酶及hTERT蛋白在直腸癌患者新輔助放化療前后的表達(dá)水平與新輔助放化療療效的關(guān)系，以期為臨床提供預(yù)測直腸癌新輔助放化療療效的指標(biāo)，從而為制訂合理的“個體化”綜合治療方案提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 一般資料

收集我院2009年9月至2012年9月術(shù)前TNM分期確診為Ⅱ期和Ⅲ期的中低位直腸癌（距離肛緣≤12 cm）45例患者，其中Ⅱ期19例，男性13例，女性6例；Ⅲ期26例，男性18例，女性8例。腺癌35例，其中管狀腺癌23例，黏液腺癌8例，乳頭狀腺癌4例，未分化癌10例?；颊吣挲g25~86歲，中位年齡48歲，KPS評分≥60分。手術(shù)治療41例，4例未手術(shù)，術(shù)前獲取組織標(biāo)本45例，術(shù)后標(biāo)本41例。術(shù)后病理檢查pCR者未找到癌細(xì)胞，全組病例的病理類型與術(shù)前一致。所有患者經(jīng)輔助檢查確定無肝、肺等遠(yuǎn)處器官轉(zhuǎn)移，均可耐受放化療。全組患者均經(jīng)同意并簽署相關(guān)醫(yī)療文書后行術(shù)前放化療。

1.2 治療方法

對入組的直腸癌患者予CT或MRI影像學(xué)檢查并分期評估，予以術(shù)前同步放化療后行手術(shù)治療。①化療（XELOX方案）：奧沙利鉑50 mg/（m2·w），加入5%葡萄糖250 ml靜滴2 h；卡培他濱800 mg/m2，Bid，5天/周，隨放療周期服用。②放療：予6 MV X直線加速器X射線照射，靶區(qū)包括直腸原發(fā)灶及淋巴引流區(qū)域。等中心三野照射，后野∶左側(cè)野∶右側(cè)野=2∶1∶1，照射劑量為50 Gy/25次，共5周。放化療期間定期檢查血常規(guī)和肝腎功能，并予以對癥和營養(yǎng)支持治療。③手術(shù)：放療結(jié)束6~8周后根據(jù)CT或MRI影像學(xué)檢查的分期評估決定是否手術(shù)，可手術(shù)者在全麻下接受規(guī)范的直腸癌根治術(shù)。

1.3 評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)及分組

①評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)：使用CT或MRI影像學(xué)檢查判定放化療的療效，根據(jù)WHO實(shí)體瘤療效評定標(biāo)準(zhǔn)（RECIST 1.1）分為完全緩解（CR）、部分緩解（PR）、穩(wěn)定（SD）和進(jìn)展（PD）。②分組：由3位影像學(xué)專家判定腫瘤達(dá)到降期，或腫瘤最長徑縮小超過30%，或達(dá)CR者判定為有效（CR+PR）組；腫瘤未達(dá)到降期或腫瘤最長徑縮小未超過30%者判定為無效（SD+PD）組。

1.4 主要試劑、檢測方法及結(jié)果判斷

①試劑：Ku70、hTERT一抗購自藥明康德新藥開發(fā)有限公司；端粒酶購自北京中杉金橋生物有限公司；二抗及DAB顯色劑購自福建邁新公司。②檢測方法：采用免疫組化SP法檢測Ku70、端粒酶及hTERT 3種蛋白的表達(dá)，玻片經(jīng)防脫片處理，高壓堿修復(fù)后按試劑盒說明書進(jìn)行操作。③結(jié)果判斷：以已知陽性表達(dá)的直腸癌標(biāo)本切片為陽性對照，以PBS作陰性對照。檢測的每張切片隨機(jī)選取4個視野鏡下觀察（400倍），每個視野計(jì)數(shù)200個細(xì)胞，細(xì)胞核著色染為棕黃色為陽性細(xì)胞。陽性結(jié)果判斷：＞5%中染色到強(qiáng)染色或＞50%弱染色判為癌細(xì)胞陽性；癌細(xì)胞間質(zhì)單個核細(xì)胞數(shù)＞50%強(qiáng)染色判為間質(zhì)細(xì)胞陽性。計(jì)算平均陽性細(xì)胞率。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

使用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。蛋白表達(dá)水平的比較使用獨(dú)立樣本四格表的χ2檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 患者放化療的療效及其與臨床病理參數(shù)的關(guān)系

根據(jù)影像學(xué)檢查和評估，入組患者中有效組27例，無效組18例。放化療后獲pCR 2例，CR 5例，PR 22例，SD 14例，PD 4例。放化療期間16例（35.6%）出現(xiàn)各種不良反應(yīng)，包括腹瀉、手足綜合征、肛門疼痛、肛周皮膚糜爛和白細(xì)胞減少等，大多數(shù)為Ⅰ～Ⅱ級不良反應(yīng)，其中有6例（13.3%）出現(xiàn)Ⅲ級手足綜合征，5例（11.1%）出現(xiàn)Ⅲ級骨髓抑制，Ⅲ級不良反應(yīng)的發(fā)生率為24.4%，無Ⅳ級不良反應(yīng)發(fā)生。分析顯示患者的性別、年齡、病理類型和KPS評分等與放化療的療效無關(guān)（P>0.05）。見表1。

2.2 免疫組化法檢測Ku70、端粒酶及hTERT蛋白的表達(dá)

顯微鏡下觀察Ku70蛋白主要表達(dá)在腫瘤細(xì)胞核中；端粒酶及hTERT蛋白主要表達(dá)在腫瘤細(xì)胞核和部分細(xì)胞質(zhì)中，蛋白染色后均為棕黃色顆粒，陰性對照的細(xì)胞核為深藍(lán)色顆粒，細(xì)胞質(zhì)及間質(zhì)均不染色。每張切片隨機(jī)選取不同視野計(jì)算棕黃色染色的細(xì)胞個數(shù)，并計(jì)算陽性細(xì)胞率。見圖A、圖B、圖C和圖D。

注:A.癌細(xì)胞細(xì)胞核呈棕黃色，少部分呈深藍(lán)色，細(xì)胞質(zhì)及間質(zhì)呈現(xiàn)淡黃色或不染色（SP×40）；B.細(xì)胞核呈棕黃色染色、深藍(lán)色，部分細(xì)胞核呈深藍(lán)、棕黃交界色，細(xì)胞質(zhì)及間質(zhì)見有大片棕黃色染色區(qū)（SP×100）；C.大部分細(xì)胞核呈棕黃色，間質(zhì)及細(xì)胞質(zhì)未見明顯染色或淡黃色（SP×100）；D.細(xì)胞核呈深藍(lán)色，細(xì)胞質(zhì)及間質(zhì)不染色（SP×100）。

表1 45例患者臨床病理參數(shù)與療效的關(guān)系（n）

2.3 3種蛋白在放化療有效組和無效組及放化療前后的表達(dá)水平

Ku70蛋白在有效組、無效組患者中陽性表達(dá)率分別為44.4%、55.6%，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），放化療前后Ku70蛋白的陽性表達(dá)率分別為48.8%、4.9%，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。端粒酶蛋白在有效組、無效組患者中陽性表達(dá)率分別為63.0%、72.2%，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），放化療前后端粒酶的陽性表達(dá)率分別為65.9%、17.1%，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。hTERT蛋白在有效組、無效組中陽性表達(dá)率分別25.9%、77.8%，差異性具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），放化療前后hTERT的陽性表達(dá)率分別為43.9%、9.8%，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見表3、表4。

表3 Ku70、端粒酶及hTERT在放化療有效組和無效組患者組織中的陽性表達(dá)［n（%）］

表4 Ku70、端粒酶及hTERT在放化療前后患者組織中的陽性表達(dá)［n（%）］

3 討論

臨床上XELOX作為直腸癌一線化療方案已成共識，卡培他濱是在體內(nèi)可轉(zhuǎn)變成5-FU的抗代謝氟嘧啶脫氧核苷氨基甲酸酯類藥物，與奧沙利鉑有協(xié)同作用，目前臨床上已將XELOX方案化療聯(lián)合放療作為進(jìn)展期結(jié)直腸癌的新輔助治療方案。有研究表明患者臨床緩解與血液循環(huán)中的鉑-DNA加合物的水平相關(guān)［5］，如果腫瘤細(xì)胞DNA修復(fù)能力減弱，則導(dǎo)致對鉑-DNA加合物的清除減少，使患者對鉑類藥物的臨床緩解率提高，反之則差，所以DNA對損傷的修復(fù)能力與化療療效關(guān)系密切，而放射線對腫瘤細(xì)胞殺傷主要是通過腫瘤細(xì)胞DNA雙鏈斷裂導(dǎo)致致死性損傷，DNA損傷修復(fù)能力的高低成為影響放射敏感性的重要因素。

近年關(guān)于預(yù)測新輔助放化療療效的研究較多。Shim等［6］研究104例Ⅱ期和Ⅲ期直腸癌患者的療效，結(jié)果顯示GLUT1蛋白高表達(dá)者較低表達(dá)者具有較低的CR率。Chen等［7］分析1 830例直腸癌新輔助放化療的患者，認(rèn)為野生型p53與新輔助放療有相關(guān)性，表明p53是直腸癌患者新輔助放療治療反應(yīng)的預(yù)測指標(biāo)。Pucciarelli等［8］研究98例直腸癌新輔助放化療的結(jié)果，認(rèn)為血漿中cf RNA和hTERT的水平可作為直腸癌新輔助放化療的敏感性指標(biāo)。本研究采用免疫組化法檢測直腸癌組織中hTERT蛋白在有效組和無效組的陽性表達(dá)率，結(jié)果兩組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），表明直腸癌組織中hTERT蛋白低表達(dá)的患者予新輔助放化療較高表達(dá)者有更好的療效。而端粒酶蛋白在有效組和無效組的差異則無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），表明端粒酶蛋白的表達(dá)不能反映XELOX方案化療聯(lián)合放療療效的敏感性。認(rèn)為hTERT是端粒酶的成分之一，端粒酶的表達(dá)結(jié)果差異推測與其RNA及尿嘧啶的影響有關(guān)，因此有待擴(kuò)大樣本量，或用PCR定量分析以進(jìn)一步驗(yàn)證。Ku70是廣泛存在于生物體內(nèi)的一種核蛋白，其重要功能之一是參與DNA的雙鏈斷裂修復(fù)，檢測Ku70蛋白可以預(yù)測結(jié)直腸癌放療的敏感性，高表達(dá)者提示對放療敏感性更好［9］。本研究Ku70蛋白的表達(dá)在有效組和無效組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明Ku70不能反映XELOX方案化療聯(lián)合放療的療效，不能作為直腸癌放化療敏感性的指標(biāo)。分析其原因推測DNA雙鏈斷裂時在斷裂末端Ku70和Ku80形成異源二聚體，因此不能排除Ku80的影響，亦可能與樣本量較少、不同病理類型的患者對放療敏感性不一和化療因素影響蛋白的表達(dá)水平有關(guān)。本研究Ku70、端粒酶及hTERT 3種蛋白在放化療前后的表達(dá)差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），這與余細(xì)球［10］的研究結(jié)果相似。本研究入組患者新輔助放化療后CR率為10.7%，新輔助放化療的療效與患者性別、年齡、病理類型和KPS評分等無相關(guān)性。但治療后CR率較低，而不良反應(yīng)高達(dá)35.6%，考慮可能為樣本量較小所致。

綜上，hTERT蛋白在Ⅱ期和Ⅲ期直腸癌組織中的表達(dá)情況可以反映放療聯(lián)合XELOX方案化療的療效，表明hTERT蛋白的表達(dá)水平與新輔助放化療的療效有相關(guān)性，Ku70、端粒酶蛋白的表達(dá)水平不能反映新輔助放化療的療效，且聯(lián)合放化療可以引起直腸癌組織Ku70、端粒酶及hTERT 3種蛋白的表達(dá)量降低。本研究3種蛋白的表達(dá)水平與生存期關(guān)系有待進(jìn)一步隨訪調(diào)查，有必要加大樣本量并深入研究。

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［2013-11-25收稿］［2014-01-23修回］［編輯 阮萃才］

Ku70，telomerase and hTERT as novel predictors of sensitivity to neoadjuvant chemoradiotherapy to treat rectal cancer

TANG Fan△，QIN Yu-zhou，LIN Yuan，RU Hai-ming，XIE Xue-cheng△（Department of Gastrointestinal surgery，Affiliated Tumor Hospital of Guangxi Medical University；△Graduate School of Guangxi Medical University，Nanning 530021，P.R.China）

QIN Yu-zhou.E-mail：qyz402@126.com

Objective To correlate the efficacy of neo-adjuvant chemoradiotherapy in phaseⅡandⅢrectal cancer patients with expression of Ku70，telomerase and hTERT proteins.Methods Expression levels of Ku70，telomerase and hTERT were analyzed by immunohistochemistry in rectal cancer patients who responded effectively to neoadjuvant chemoradiotherapy（XELOX regimen，n=27）and in patients in whom such therapy was ineffective（n=18）.Levels in the two groups were compared before and after neoadjuvant chemoradiotherapy.Results Expression of hTERT was significantly lower in patients who responded effectively to therapy than in those who did not（P<0.05）.The two patient groups showed similar expression of Ku70 and telomerase（P>0.05）.In each of the patient groups，expression levels of hTERT，telomerase and Ku70 differed significantly before and after chemoradiotherapy（P<0.05）.Efficacy of neoadjuvant chemoradiotherapy did not correlate with sex，age，pathological type or KPS score（P>0.05）.Conclusion Expression of hTERT in phaseⅡandⅢrectal cancer patients may correlate with the efficacy of neoadjuvant chemotherapy combined with radiotherapy.

Rectal neoplasm；Ku70；Telomerase；hTERT；Neoadjuvant chemoradiotherapy；Efficacy

R735.3+7

A

1674-5671（2014）01-05

10.3969/j.issn.1674-5671.2014.01.10

廣西教育廳科研基金資助項(xiàng)目［200911MS29］

覃宇周。E-mail：qyz402@126.com