流小舟綜述，趙建寧，吳蘇稼審校

0 引 言

骨肉瘤是常見的多發(fā)于青少年的骨惡性腫瘤，臨床表現(xiàn)為侵襲型強且易發(fā)生轉(zhuǎn)移［1］。雖然保肢手術(shù)技術(shù)及新輔助化療已廣泛應(yīng)用于治療該疾病，但腫瘤的復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移率高及化療耐藥的問題依然存在，患者的五年生存率僅為50%～60%［2］。故骨肉瘤的早期診斷、復(fù)發(fā)與轉(zhuǎn)移的預(yù)測以及避免化療耐藥成為解決此問題的關(guān)鍵。骨肉瘤的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移是十分復(fù)雜的過程，它是多種遺傳學(xué)改變參與的結(jié)果。除DNA序列改變外，表觀遺傳學(xué)改變也可導(dǎo)致特定基因表達的異常［3］。而作為表觀遺傳學(xué)中一項重要的研究內(nèi)容，DNA甲基化是導(dǎo)致癌基因激活和抑癌基因失活的主要原因，已逐漸成為骨肉瘤治療領(lǐng)域研究的熱點［4］。

1 DNA甲基化概述

作為唯一可通過不改變DNA一級結(jié)構(gòu)達到基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控目的，并采用共價化學(xué)方式作用的表觀遺傳學(xué)修飾，DNA甲基化是指在 DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(DNA methyltransferase，DNMT)的催化作用下，將S-腺苷甲硫氨酸上的甲基轉(zhuǎn)移到特定堿基上的過程，通常發(fā)生在腺嘌呤的N-6位、胞嘧啶的N-4位、鳥嘌呤的N-7位或胞嘧啶的C-5位等［5］。哺乳動物體內(nèi)的DNA甲基化則主要通過CpG雙核苷酸5'-C上的H被甲基基團所取代來實現(xiàn)［6］。通常這種CpG雙核苷酸序列在哺乳動物基因組中出現(xiàn)的頻率僅為1%，遠低于基因組中的其他雙核苷酸序列［7］。其分別以甲基化形式分散于DNA中，可稱其為甲基化CpG位點;另一種是非甲基化的CpG雙核苷酸高度聚集在基因的5'端，其長度為 0.5～3.0 kbp，富含CG序列(60% ～70%)，稱為CpG島。正常情況下，除無活性的印蹤基因和女性X-染色體的轉(zhuǎn)錄沉默基因中存在完全甲基化的 CpG島，其余CpG島均處于非甲基化狀態(tài)［8-9］。由于只有CpG島的胞嘧啶能夠被甲基化，且其富集于基因啟動子區(qū)域或附近的外顯子區(qū)，并包含多個轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(可使轉(zhuǎn)錄因子沉默)，這些特性可在細胞分裂過程中得到穩(wěn)定的遺傳［10］。因此CpG島具有調(diào)節(jié)基因表達和保護DNA位點不受特定限制酶降解的作用，是導(dǎo)致包括骨肉瘤在內(nèi)的惡性腫瘤發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移及復(fù)發(fā)的一個重要因素［11］。

2 DNA異常甲基化與基因表達

Santini等［12］研究證實啟動子區(qū)域 CPG島的異常甲基化是影響基因轉(zhuǎn)錄和表達的重要機制之一。其可能作用機制為:①CpG島異常甲基化后直接作用于轉(zhuǎn)錄因子激活蛋白2基因Ap-2、癌基因c-Myc/Myn、環(huán)磷酸腺苷反應(yīng)元件結(jié)合蛋白CREB、核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB等在啟動子區(qū)上結(jié)合的位點，阻止了它們的正常識別和始動轉(zhuǎn)錄過程［13］。②CpG島異常甲基化后使啟動子區(qū)上的位點與特定的轉(zhuǎn)錄抑制蛋白甲基胞嘧啶結(jié)合蛋白1和2(MeCP-1、MeCP-2)、共同抑制復(fù)合物Sin3和甲基化CpG結(jié)合域MBD等相結(jié)合，間接阻止了轉(zhuǎn)錄因子與基因形成轉(zhuǎn)錄復(fù)合物［14-15］。③CpG島異常甲基化后通過位點與轉(zhuǎn)錄抑制蛋白結(jié)合過程，提高組蛋白去乙酞化酶的活性，進而使組蛋白與DNA結(jié)合的能力增強，在引起染色質(zhì)重構(gòu)的同時阻止轉(zhuǎn)錄因子進入啟動子區(qū)域［16-17］。另外，CPG島的異常甲基化也可通過直接誘導(dǎo)基因突變從而對基因的表達產(chǎn)生影響［18］。其中在DNMT的作用下封閉尿嘧啶的修復(fù)及誘發(fā)胞嘧啶向胸腺嘧啶突變是實現(xiàn)基因突變的主要途徑［19］。

3 DNA甲基化與骨肉瘤

由于啟動子區(qū)域CPG島的異常甲基化使其自衛(wèi)效應(yīng)減弱，同時調(diào)控DNMT復(fù)合體機制發(fā)生障礙使其表達量激增。故在惡性腫瘤發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移及復(fù)發(fā)過程中，腫瘤中啟動子區(qū)域甲基化可導(dǎo)致癌基因、轉(zhuǎn)移正相關(guān)基因去甲基化或低甲基化及抑癌基因的高甲基化［20］。

3.1 腫瘤相關(guān)基因甲基化與骨肉瘤診斷、預(yù)后目前已證實多種基因的甲基化與骨肉瘤的分期、分級、轉(zhuǎn)移及預(yù)后等臨床指標(biāo)密切相關(guān)［21］。對于這些基因的異常甲基化檢測能否為骨肉瘤的早期診斷和預(yù)后判斷提供參考還在進一步的深入研究中。

3.1.1 RASSF1A基因 作為一種新型腫瘤抑癌基因，RASSF1A基因定位于人第3號染色體短臂上，在細胞凋亡信號的轉(zhuǎn)導(dǎo)、調(diào)節(jié)細胞周期、控制基因轉(zhuǎn)錄及抑制腫瘤發(fā)生等方面發(fā)揮重要作用。故在正常組織中，RASSF1A基因呈現(xiàn)廣泛表達，但在包括骨肉瘤在內(nèi)的多種惡性腫瘤中表達均呈現(xiàn)降低或者缺失［22］。高甲科等［23］發(fā)現(xiàn)在骨肉瘤組織中RASSF1A蛋白的陽性率(45.70%)顯著低于骨軟骨瘤組織中RASSF1A 蛋白的陽性率(95.00%)(P ＜0.01)，甚至有個別低分化骨肉瘤組織中的RASSF1A未表達，他們認為這是由啟動子區(qū)域的 CpG島甲基化及基因突變、缺失協(xié)同作用引起的，且甲基化是該過程中的主導(dǎo)因素。牛軍濤等［24］在通過RT-PCR和Western blot方法驗證了骨肉瘤中完全或部分甲基化抑制RASSF1A基因表達的前提下，采用甲基化特異性PCR(Methylation-Specific PCR，MSP)方法對44例臨床明確診斷的骨肉瘤及癌旁骨組織 RASSF1A基因的甲基化狀態(tài)進行檢測和分析，結(jié)果表明RASSF1A基因骨肉瘤組織中的甲基化率(61.4%)顯著高于其在癌旁正常骨組織中的甲基化率(20.5%)，提示在骨肉瘤組織中具有腫瘤特異性的RASSF1A基因異常甲基化可能在骨肉瘤發(fā)生的早期過程中發(fā)揮著重要的作用。另有研究顯示RASSF1A基因的的異常甲基化與腫瘤的分化程度、恩耐基(Enneking)分期、遠處轉(zhuǎn)移情況及患者血清中的堿性磷酸酶)水平密切相關(guān)，而與患者的年齡、性別、腫瘤的部位及大小無關(guān)［25］?？梢姍z測RASSF1A甲基化水平對于骨肉瘤的早期診斷及預(yù)后評價均有一定的參考價值。

3.1.2 p14ARF基因 p14ARF基因是由位于人類第9號染色體短臂(9p21)上的INK4a/ARF基因座編碼而成的抑癌基因。作為細胞周期依賴性激酶抑制基因的可變讀框基因，p14ARF基因可直接結(jié)合癌基因MDM2，阻止MDM2介導(dǎo)的針對p53的泛素化抑制，從而達到穩(wěn)定p53水平的作用，最終啟動細胞凋亡或細胞周期阻滯。p14ARF基因的轉(zhuǎn)錄也受其啟動子區(qū)域甲基化的調(diào)節(jié)。Oh等［26］采用MSP方法對32例骨肉瘤組織樣本p14ARF基因啟動子區(qū)域甲基化狀態(tài)進行評估，結(jié)果顯示47%的樣本中存在p14ARF基因啟動子區(qū)域的高甲基化，且甲基化組患者的生存率(31%)明顯低于非甲基化組(79%)，說明p14ARF基因異常甲基化可導(dǎo)致骨肉瘤患者預(yù)后不良。但也有學(xué)者提出骨肉瘤組織樣本p14ARF基因的甲基化率僅為23.5%，且甲基化組的腫瘤轉(zhuǎn)移率明顯低于非甲基化組，說明p14ARF基因的異常甲基化與骨肉瘤患者的預(yù)后良好呈正相關(guān)［27］。可見，該基因甲基化在骨肉瘤中的表達及與預(yù)后的關(guān)系尚存在爭議。

3.1.3 ESR1基因 ESR1基因負責(zé)編碼雌激素受體蛋白1(estrogen receptor protein 1，ESRP1)，甲基化則是其轉(zhuǎn)錄抑制和表達沉默的主要原因。由于雌激素在青春期骨骼生長和成人骨重建中發(fā)揮了重要的調(diào)節(jié)作用，因此許多研究表明ESR1基因不僅通過調(diào)控雌激素在骨礦化過程中產(chǎn)生效應(yīng)，而且該基因純合性的缺失與嚴(yán)重的骨質(zhì)疏松和骨轉(zhuǎn)換率增加密切相關(guān)［28］。有研究發(fā)現(xiàn)雖然骨肉瘤患者組中ESR1基因的異常甲基化率僅為14.7% ，但從5年生存率和生存曲線兩方面對比均提示未發(fā)生ESR1基因甲基化的患者預(yù)后優(yōu)于甲基化組［27］。

3.1.4 PTEN基因 作為一個具有磷酸酶活性的抑癌基因，PTEN基因的異常甲基化也在骨肉瘤的發(fā)生、發(fā)展中起重要作用。何博等［29］發(fā)現(xiàn)在組織細胞和外周血樣中，骨肉瘤患者PTEN基因啟動子區(qū)域的甲基化率均明顯高于正常人;將啟動子區(qū)域上的CpG島位點進行區(qū)分，得到了異常甲基化易發(fā)生(非穩(wěn)定)的位點，從而為今后骨肉瘤早期診斷乃至靶向治療提供了理論依據(jù)。

3.2 甲基化與骨肉瘤治療 由于傳統(tǒng)的手術(shù)治療創(chuàng)傷性較大，輔助化療選擇性不高、毒副作用大及存在耐藥性，導(dǎo)致骨肉瘤的治療預(yù)后較差。以甲基化為基礎(chǔ)的探索性治療為骨肉瘤的治療提供了新途徑，其主要集中在抑癌基因的去甲基化及輔助化療增敏作用上［30-31］。

由于DNA甲基化主要依賴于DNMT的催化作用，故應(yīng)用DNMT抑制劑可使高甲基化的抑癌基因重新去甲基化并激活，進而抑制腫瘤［32］。作為DNMT抑制劑的代表性藥物5-氮雜-2'脫氧胞苷(5-Aza-2'-deoxycytidine，5-Aza-CdR)，通過與 DNMT共價結(jié)合來抑制其生物活性。梁德勇等［33］在證實骨肉瘤HS888T細胞系中存在抑癌基因APAF-1甲基化的基礎(chǔ)上，用5-Aza-CdR處理Hs888T細胞后發(fā)現(xiàn)APAF-1的mRNA得以重新表達，且其表達具有對該藥物作用時間和濃度的依賴性。有研究在使用5-Aza-CdR處理骨肉瘤MG-63細胞系中高甲基化的RASSF1A基因時也得到了相似的結(jié)論，說明5-Aza-CdR無組織或基因特異性，其可激活多種抑癌基因共同抑制骨肉瘤的生長［34］。

目前國內(nèi)外常規(guī)采用甲氨喋呤、多柔比星、順鉑聯(lián)合異環(huán)磷酰胺的方案對骨肉瘤進行化療，但該方案尚存在化療耐藥的問題。O6-甲基鳥嘌呤-DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(O6-methylguanine-DNA-methytransferase，MGMT)基因具有將結(jié)合在鳥嘌呤O6-位點上的甲基基團轉(zhuǎn)移到自身半胱氨酸殘基上，從而修復(fù)DNA鏈上鳥嘌呤的功能。在正常細胞中，這種功能會使其自身不可逆的失活［35］。而在腫瘤細胞中，MGMT的過度甲基化導(dǎo)致MGMT的失活和合成間平衡的破壞。一方面，MGMT失去了對DNA的保護，使其易受外界烷化劑的影響進而導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生;另一方面，MGMT的失活又使形成的腫瘤對烷化劑化療藥物的敏感性明顯增強。這種看似矛盾的特性提示MGMT異常甲基化的監(jiān)測不僅有利于腫瘤的早期診斷，且對于諸如骨肉瘤等早期不宜發(fā)現(xiàn)的惡性腫瘤，有助于預(yù)測烷化劑化療的效果。有研究顯示MGMT基因甲基化患者對常規(guī)化療藥物(含有烷化劑)的反應(yīng)性明顯好于未甲基化者，這也進一步驗證了MGMT基因甲基化與化療療效的關(guān)系［36］?；诖?，有人提出通過監(jiān)測骨肉瘤細胞中MGMT基因及其甲基化水平，指導(dǎo)合理使用烷化劑，進行個體化治療［37］。也有人提出聯(lián)合應(yīng)用MGMT活性抑制劑和化療藥物可顯著提高腫瘤對順鉑等烷化劑的敏感性，但由于該種方法亦可能促進體內(nèi)正常組織細胞的癌變，因而函待進一步的研究［38］。

4 結(jié) 語

綜上所述，DNA的異常甲基化在骨肉瘤的發(fā)生發(fā)展及轉(zhuǎn)移中發(fā)揮了重要的作用。因此，針對骨肉瘤中癌基因、轉(zhuǎn)移正相關(guān)基因及抑癌基因異常甲基化的研究，有望為其治療提供新的途徑。由于骨肉瘤細胞基因甲基化的遺傳相對較穩(wěn)定，提示可尋找骨肉瘤相對特異的異常甲基化譜用于診治［39］。另外，由于去甲基化和增強甲基化存在作用范圍的不確定性和破壞正常DNA結(jié)構(gòu)的矛盾性，這些治療手段均有促進腫瘤轉(zhuǎn)移和生長的風(fēng)險［40］。故最佳干預(yù)方法應(yīng)該是針對甲基化基因的靶向治療，這將是我們今后研究的重點和目標(biāo)。

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