李杰等

【摘 要】目的：利用合成的RGD（ Arg-Gly-Asp） 三肽研究其對骨肉瘤細(xì)胞增殖抑制作用可能的機(jī)制。方法：不同濃度RGD作用于骨肉瘤細(xì)胞后，MTT法檢測骨肉瘤細(xì)胞增殖抑制率變化，流式細(xì)胞術(shù)檢測骨肉瘤細(xì)胞凋亡情況。結(jié)果：RGD能明顯呈濃度依賴性抑制骨肉瘤細(xì)胞的生長。RGD處理后，可以導(dǎo)致MG63骨肉瘤細(xì)胞的凋亡。結(jié)論：RGD能明顯抑制MG63骨肉瘤細(xì)胞生長，并促骨肉瘤細(xì)胞凋亡，這種作用具有明顯時(shí)間劑量效應(yīng)。

【關(guān)鍵詞】RGD； 骨肉瘤； 凋亡；

骨肉瘤是一種臨床常見惡性骨腫瘤，約占所有骨腫瘤的20%。其惡性程度高，好發(fā)于青少年，易復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移，預(yù)后較差[1]。目前臨床上主要采用外科手術(shù)和化療聯(lián)合治療，新輔助化療的應(yīng)用使骨肉瘤患者的生存率較以前有了很大的提高[2]。傳統(tǒng)的化療藥物主要是通過細(xì)胞毒性藥物殺滅腫瘤，其對機(jī)體嚴(yán)重的毒副作用和腫瘤產(chǎn)生的耐藥性使繼續(xù)有效的化療陷入了困境。這都成為了目前困擾骨肉瘤治療的主要問題。因此，尋找作用機(jī)制與現(xiàn)有化療藥物不同，且特異性高、毒副作用小的抗腫瘤靶向藥物成為了腫瘤基礎(chǔ)和臨床的研究熱點(diǎn)。RGD 肽是一類含有精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸（Arg-Gly-Asp） 序列的短肽，廣泛存在于生物體內(nèi)，是整合素（ Integrin） 與其配體蛋白相互作用的識別位點(diǎn)。自Pierschbacher 等于1984年首次報(bào)道纖維蛋白原中所含的RGD 序列為細(xì)胞識別位點(diǎn)以來，RGD 肽及其衍生物就成為眾多學(xué)者關(guān)注與研究的熱點(diǎn)。通過本實(shí)驗(yàn)我們發(fā)現(xiàn)，RGD可以抑制骨肉瘤細(xì)胞增殖并促進(jìn)骨肉瘤細(xì)胞凋亡作用。

1 材料及方法

1.1 試劑 RGD 三肽及人骨肉瘤細(xì)胞MG63由本實(shí)驗(yàn)室保存。細(xì)胞培養(yǎng)用DMEM 培養(yǎng)基含10%胎牛血清和1%的青、鏈霉素，購自杭州四季青生物工程材料有限公司，無噬菌體，低內(nèi)毒素，培養(yǎng)條件為5%的CO2及37 ℃。MTT及凋亡試劑盒均購自Sigma公司。

1.3 細(xì)胞傳代及培養(yǎng) 骨肉瘤細(xì)胞在5%CO2和37℃的條件下，在含10%～15%小牛血清的1640培養(yǎng)基（ Invitrogen）中貼壁生長。細(xì)胞用含0.25%胰蛋白酶和0.02%EDTA的消化液消化進(jìn)行傳代。加入0.5～1ml 0.25%胰酶溶液，一般室溫消化時(shí)間約為1～3分鐘。用吸管將貼壁的細(xì)胞吹打成懸液，分到另外兩到三瓶中，實(shí)踐培養(yǎng)液塞好橡皮塞，置37℃下繼續(xù)培養(yǎng)。第二天觀察貼壁生長情況。

1.3 實(shí)驗(yàn)分組 本實(shí)驗(yàn)共分為4組，RGD 25μg/ml組，RGD 50μg/ml組，RGD 75μg/ml組及空白對照組。

1.4 MTT檢測細(xì)胞增殖 將處于對數(shù)生長期的骨肉瘤細(xì)胞于轉(zhuǎn)染后的第24h、48h加入MTT20μl/孔（5mg/ml），繼續(xù)培養(yǎng)4h后吸棄上清。加入二甲亞砜150μl/孔，溶解甲瓚紫結(jié)晶，酶標(biāo)儀570nm波長下測定吸光度A值，每孔設(shè)3個(gè)復(fù)孔取均值，計(jì)算抑制率。相對抑制率=（1-轉(zhuǎn)染組/ 對照組）×100﹪。

1.5 細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn) 取對數(shù)生長期細(xì)胞胰酶消化、細(xì)胞計(jì)數(shù)，以5*105/瓶細(xì)胞數(shù)轉(zhuǎn)至6孔板培養(yǎng)16h，加無血清培養(yǎng)基同步化12h，進(jìn)行加藥處理。分別給藥作用24h和48h后，胰酶消化，離心收集細(xì)胞，用冷PBS 洗滌兩次，加入100μL 1X annexin-binding buffer溶解，按照凋亡檢測試劑盒操作依次加入檢測試劑 。流式檢測細(xì)胞凋亡 。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 121 0 軟件包處理數(shù)據(jù)， 采用單因素方差分析， 以P< 0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義， 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均重復(fù)測定3 次以上。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 MTT結(jié)果呈現(xiàn)濃度依賴性抑制MG63骨肉瘤細(xì)胞增殖，RGD 對MG63 細(xì)胞的增殖抑制如表1所示。結(jié)果顯示，RGD 能明顯抑制MG63 細(xì)胞增殖，并且這種抑制作用呈濃度依賴性增強(qiáng)。

2.2 RGD誘導(dǎo)MG63 骨肉瘤細(xì)胞凋亡：RGD誘導(dǎo)MG63 細(xì)胞凋亡結(jié)果如圖1，圖2所示。流式細(xì)胞檢測顯示，RGD能明顯促進(jìn)MG63細(xì)胞凋亡，并且這種凋亡作用呈濃度依賴性增強(qiáng)。

3 討論

RGD 肽作為整合素和其配體相互作用的識別位點(diǎn)，能與腫瘤細(xì)胞或者新生血管特異表達(dá)的某些整合素如αvβ3結(jié)合[3]， 眾所周知，腫瘤血管的生成或新生血管的萌芽在腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移中起到重要作用。研究表明，沒有形成新生血管來提供氧氣和營養(yǎng)物質(zhì)的，腫瘤的生長不會增長。而一旦血管化，以前處于休眠狀態(tài)的腫瘤便開始迅速增長，侵入周圍組織，并發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。既然癌細(xì)胞能夠高效的侵襲和轉(zhuǎn)移，那么之前細(xì)胞外基質(zhì)的降解則是其入侵前必需的。整合素作為一類細(xì)胞黏附受體分子，則廣泛參與細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)、細(xì)胞與細(xì)胞之間的相互作用[4]。雖然內(nèi)皮細(xì)胞能夠表達(dá)許多種不同的整合素，但是αvβ3 在血管生成中是最重要的[5]。在激活的內(nèi)皮細(xì)胞、新生血管以及某些腫瘤細(xì)胞常特異性地高表達(dá)整合素αvβ3，而在處于休眠狀態(tài)的內(nèi)皮細(xì)胞和正常的器官系統(tǒng)則不表達(dá)，使腫瘤血管靶向治療成為可能[6]。 研究表明整合素αvβ3 在骨肉瘤實(shí)體腫瘤細(xì)胞表面有高水平的表達(dá)，而在正常骨細(xì)胞未見表達(dá)，在其他實(shí)體腫瘤表面少量表達(dá)[7]。而且骨肉瘤易通過血管肺部轉(zhuǎn)移，Ham等人[8]利用RGD與整合素αvβ3結(jié)合研究表明攜帶RGD的相關(guān)病毒靜脈用藥骨肉瘤肺轉(zhuǎn)移的小鼠，結(jié)果提示，通過RGD的介入明顯抑制了骨肉瘤肺部轉(zhuǎn)移瘤的生長，認(rèn)為RGD在骨肉瘤血管靶向治療上發(fā)揮重要作用。相信RGD肽修飾后的相關(guān)給藥系統(tǒng)以及病毒載體在高表達(dá)整合素αvβ3骨肉瘤治療上以及抑制骨肉瘤肺轉(zhuǎn)移上應(yīng)該有很好的應(yīng)用前景。

在本實(shí)驗(yàn)中，通過MTT檢測我們觀察到各實(shí)驗(yàn)組對骨肉瘤細(xì)胞增殖的抑制作用均明顯高于對照組，且隨時(shí)間推移，抑制率增加。通過細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)檢測，各實(shí)驗(yàn)組對骨肉瘤細(xì)胞的凋亡作用均明顯高于對照組，且隨時(shí)間推移，凋亡率增加。結(jié)果顯示，RGD可以抑制骨肉瘤細(xì)胞增殖并促進(jìn)骨肉瘤細(xì)胞凋亡作用。

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