王鑒++謝波

摘要：目的 探討CD146在骨肉瘤患者組織中的表達(dá)情況，并分析其與骨肉瘤臨床特征的關(guān)系。方法 采用免疫組化法檢測50例骨肉瘤患者組織中CD146的表達(dá)情況，并檢測用CD34標(biāo)記的腫瘤微血管密度MVD，并利用RT-qPCR和western blot方法檢測骨肉瘤組織標(biāo)本中CD146的表達(dá)。結(jié)果 CD146在骨肉瘤組織中過高表達(dá)，其MVD值顯著高于骨肉瘤周圍非惡性組織， CD146的表達(dá)與骨肉瘤的Enneking 分期及有無肺轉(zhuǎn)移顯著相關(guān)（P<0.01），隨著骨肉瘤組織臨床分期及組織分化的進(jìn)展，CD146的表達(dá)明顯提高，且骨肉瘤組織中有肺結(jié)轉(zhuǎn)移組的陽性表達(dá)率顯著高于無肺轉(zhuǎn)移組。結(jié)論 CD146在骨肉瘤的發(fā)生和發(fā)展過程中起著十分重要的作用，其分子水平的高低可能可以成為衡量骨肉瘤疾病活動(dòng)程度中的一個(gè)重要的指標(biāo)。

關(guān)鍵詞：CD146；骨肉瘤；表達(dá)

Abstract：Objective To investigate the expression of CD146 in osteosarcoma tissues and the relationship with clinical and pathological characteristics. Methods The expression of CD146 and microvessel density （MVD） in 50 cases of osteosarcoma tissues was determined by Immunohistochemistry， and further detecting the expression of CD146 in osteosarcoma tissues by RT-qPCR and Western blot. Results CD146 was overexpressed in Human Osteosarcoma Tissues， and the MVD value was significantly higher than nonmalignant tissue surrounding in osteosarcoma， and the expression level of CD146 was correlated with Enncking stage and pulmonary metastasis（P<0.01）. With the progress of clinical stage and histological differentiation of osteosarcoma， expression of CD146 was increased， and expression of CD146 in osteosarcoma with pulmonary metastasis group was significantly higher than those without pulmonary metastasis. Conclusion CD146 is related to the occurrence and development of osteosarcoma closely， and should play an important role in the process.

Key words：CD146； Osteosarcoma； Expression

骨肉瘤是人類骨骼系統(tǒng)的惡性腫瘤中，發(fā)病率居首位，并且在青少年中也最為常見，其中在小兒骨惡性腫瘤發(fā)病率中約占5%，嚴(yán)重威脅了人類的健康。早期骨瘤肉患者（Enneking IIA期）一般臨床癥狀輕微，難以察覺，由于骨肉瘤發(fā)展迅速，所以多數(shù)骨肉瘤患者（約75%）在初診時(shí)已是中晚期（Enneking IIB/III期）。如今，由于新型的輔助化療結(jié)合外科治療的方法應(yīng)用于骨肉瘤的治療取得了突破性進(jìn)展，使得骨肉瘤患者 5 年內(nèi)生存率提高至60%左右[1]，但是仍有約50%的骨肉瘤患者會(huì)發(fā)生肺轉(zhuǎn)移，一旦出現(xiàn)肺轉(zhuǎn)移，5年生存率僅10%～15% [2]。

腫瘤血管生成（tumor angiogenesis，TA）及其在腫瘤發(fā)生、發(fā)展過程的重要作用為骨肉瘤發(fā)生和侵襲轉(zhuǎn)移的機(jī)制研究提供了新的方向。惡性黑色素瘤細(xì)胞黏附分子（melanoma cell adhesion molecule， CD146）是腫瘤的血管生成過程重要的相關(guān)因子，它通過參與細(xì)胞間和細(xì)胞-細(xì)胞外基質(zhì)之間的黏附作用促進(jìn)腫瘤組織的血管生成，并且與多種腫瘤的擴(kuò)散和轉(zhuǎn)移息息相關(guān) [3-5]。研究表明CD146在人體多種惡性腫瘤如人類惡性黑色素瘤、肝癌、前列腺癌、胰腺癌、腎癌等中表達(dá)明顯增高[6]。但 CD146 在骨肉瘤發(fā)生發(fā)展中作用的基礎(chǔ)研究還很薄弱，本研究采用免疫組織化學(xué)方法檢測50 例人骨肉瘤組織中 CD146的表達(dá)，以 CD34 作標(biāo)記，同時(shí)計(jì)數(shù)腫瘤組織的微血管密度（microvessel density，MVD），并結(jié)合RT-qPCR和western blot方法檢測骨肉瘤組織標(biāo)本中CD146的表達(dá)，探討它與骨肉瘤臨床特征的關(guān)系及其臨床意義，為骨肉瘤的治療研究提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 標(biāo)本來源于武漢某三甲醫(yī)院住院骨科患者，患者均簽署知情同意且在未接受治療前收集標(biāo)本，包括30（60%）例男性和20（40%）例女性的惡性骨肉瘤組織、周圍惡性骨肉瘤組織及周圍非惡性組織，50例骨肉瘤患者的平均年齡為20歲（范圍從7～31），病理證實(shí)所有標(biāo)本均為骨肉瘤。

1.2試劑及儀器 CD146：上游引物5'-GAAAAAGTGTGGCTGGAAGT-3'，下游引物5'-GTTGTCGTTGGTTGTCTC TT-3'；內(nèi)參基因：核糖體蛋白S18：上游引物5'-CGA TGG GCGGCG GAA AAT A-3'，下游引物5'-CTGCTTTCCTCAACACCACA-3'； QPCR反應(yīng)儀為ABI 7500（ABI 公司）；日本Olympus BX51 光學(xué)顯微鏡；Real Time反應(yīng)試劑盒（OMEGA公司）；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（Sigma公司）；總蛋白提取試劑盒（BestBio公司）。鼠抗人CD146單克隆抗體（美國Santa Cruz 公司產(chǎn)品）。CD34 鼠抗人單克隆抗體、抗鼠即用型快速免疫組化MaxVisionTM 檢測試劑盒及DAB 染色試劑盒（福州邁新生物技術(shù)有限公司）。

1.3實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 CD146及CD34 的免疫組化檢測 將骨肉瘤及骨肉瘤周圍非惡性組織標(biāo)本制成4μm切片，參照試劑盒說明書進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色。簡要過程如下：切片用二甲苯脫蠟后浸泡，高壓抗原修復(fù)，血清封閉加一抗，4℃孵育過夜，再復(fù)溫后加入二抗，孵育。用DAB 顯色，蘇木精對比染色后脫水、透明、封片。在光鏡下觀察結(jié)果。

1.3.2 免疫組化結(jié)果判定 CD146 以胞質(zhì)及胞膜中出現(xiàn)棕黃色染色顆粒為陽性。微血管密度（microvessel density MVD）計(jì)數(shù)標(biāo)準(zhǔn)參照Weidner等校正并修改方法。采用 CD34 免疫組化染色標(biāo)記血管內(nèi)皮細(xì)胞，以胞質(zhì)及胞膜中出現(xiàn)棕黃色染色顆粒為陽性。單個(gè)內(nèi)皮細(xì)胞或細(xì)胞團(tuán)，不管有沒有形成管腔，只要被抗體染色并與周圍的微血管、腫瘤細(xì)胞和其他連接組織分離，都認(rèn)為是1個(gè)微血管，有平滑肌壁及管腔直徑約大于8個(gè)紅細(xì)胞直徑的血管排除在外。先用低倍鏡（×100）下在每一個(gè)標(biāo)本中選擇3個(gè)微血管數(shù)最多的區(qū)域，在每一個(gè)區(qū)域中計(jì)數(shù)1個(gè)高倍鏡（×400）下的微血管數(shù)，取其均值為MVD值。

1.3.3 肉瘤組織中CD146的表達(dá)及western blot分析 提取組織樣本中總RNA，反轉(zhuǎn)錄得cDNA，以此為模板Real time PCR檢測，引物序列CD146：上游引物5'-GAAAAAGTGTGGCTGGAAGT-3'，下游引物5'-GTTGTCGTTGGTTGTCTC TT-3'；核糖體蛋白S18（RPS18）：上游引物5'-CGATGG GCGGCGGAAAAT A-3'，下游引物5'-CTGCTTTCCTCA ACACCAC A-3'。用ABI7500熒光定量PCR儀進(jìn)行熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)。擴(kuò)增的反應(yīng)程序：94℃ 5min，94℃ 40s，50℃ 40 s，72℃ 50s，40循環(huán)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用△△Ct法進(jìn)行分析。提取樣品總蛋白，確定蛋白樣品的濃度后，加入等量樣品到每個(gè)加樣孔，進(jìn)行WB檢測，經(jīng)曝光、顯影及定影后，統(tǒng)計(jì)目的條帶灰度值。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 16.0軟件完成統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。計(jì)量資料結(jié)果采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s ）進(jìn)行統(tǒng)計(jì)描述。計(jì)量資料采用t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料采用分析。以P<0.05為差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，反之則為差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CD146和CD34在骨肉瘤組織中表達(dá) 免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示 CD146在骨肉瘤組織中多數(shù)呈陽性表達(dá)，在 50例骨肉瘤組織切片中，CD146 表達(dá)陽性 36 例，陰性 14 例，陽性率 72%。光學(xué)顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn) CD146 主要表達(dá)于骨肉瘤組織的血管內(nèi)皮細(xì)胞，當(dāng)胞膜或胞漿中呈現(xiàn)棕黃色顆粒即為陽性（Fig.1），否則判定為陰性；CD34 標(biāo)記的血管內(nèi)皮細(xì)胞，以胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性判斷標(biāo)準(zhǔn)（Fig.2），否則為陰性。染色結(jié)果顯示所有骨肉瘤切片中 CD34 均呈陽性表達(dá)，根據(jù) Weidner 的計(jì)數(shù)方法，骨肉瘤組中的MVD平均值為48.68±4.00 ，周圍非惡性組織的MVD平均值為10.27±3.00，兩者差異顯著，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P<0.01。通過檢驗(yàn)結(jié)果比較發(fā)現(xiàn)，CD146的表達(dá)與骨肉瘤的Enneking 分期及有無肺轉(zhuǎn)移顯著相關(guān)（P<0.01），而與性別、年齡、腫瘤直徑無顯著關(guān)系（P>0.05）。

2.2 肉瘤組織中CD146 mRNA的表達(dá)情況 由表2可見，隨著臨床分期的增加以及組織分化的進(jìn)展，CD146的表達(dá)明顯增加：其在III的表達(dá)量高于II、I期（P<0.05）；在周圍非惡性組織中的表達(dá)顯著低于I和II肉瘤組織中的表達(dá)（P<0.01）。表中數(shù)據(jù)顯示CD146在肉瘤組織中的高表達(dá)與其分期、組織分級密切相關(guān)。

2.3 肉瘤組織中CD146的western blot檢測 周圍非惡性組織組中CD146的表達(dá)水平均低于I，II和III組，相比差異顯著，P<0.05，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；III組中CD146的平均表達(dá)水平顯著高于II和I組中的表達(dá)水平，P<0.05；II組中CD146的平均表達(dá)水平顯著高于I組中的表達(dá)水平，P<0.05。表明隨著骨肉瘤組織臨床分期及組織分化的進(jìn)展，CD146的表達(dá)有上升的趨勢。

圖3 骨肉瘤患者肉瘤組織中CD146的western blot檢測

3 討論

骨肉瘤已經(jīng)成為嚴(yán)重危害青少年生命健康的 “殺手”之一，尋找更為有效的方法治療骨肉瘤已經(jīng)迫在眉睫。腫瘤血管生成及其在腫瘤發(fā)生，侵襲和轉(zhuǎn)移過程的重要作用為骨肉瘤機(jī)制的基礎(chǔ)研究提供了新的方向和思路。眾所周知，腫瘤的生長需要通過血管供給氧及營養(yǎng)，并且惡性腫瘤細(xì)胞可進(jìn)入其周圍的腫瘤血管，并通過這種途徑向周圍轉(zhuǎn)移擴(kuò)散。因此，可以說腫瘤的發(fā)生發(fā)展的每一步，包括生長、浸潤、轉(zhuǎn)移和擴(kuò)散都與TA這一關(guān)鍵步驟相關(guān)[6-8]。腫瘤處于無血管期時(shí)，主要通過周圍組織的彌散作用來獲取營養(yǎng)物質(zhì)并清除代謝產(chǎn)物，當(dāng)腫瘤增殖至一定的階段將啟動(dòng)血管生成，進(jìn)入血管期；但是由于新生的血管結(jié)構(gòu)并不完整，相比成熟的正常血管，新生的血管更容易被腫瘤細(xì)胞沿新生血管開啟的膠原裂隙侵襲，從而遭到破壞。腫瘤組織中的新生血管越多，預(yù)示著腫瘤體增長的速度越快，轉(zhuǎn)移的可能性就越大，從而患者生存期就越短[9]。

CD146作為分子靶向或基因治療的靶向位點(diǎn)研究成為國內(nèi)外學(xué)者研究的熱點(diǎn)。CD146 是屬于黏附分子（cell adhesion molecule，CAM）家族的一種膜糖蛋白[10]。CD146通過與其他成分如腫瘤細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞、細(xì)胞外基質(zhì)等發(fā)生作用，參與重組細(xì)胞骨架、維持細(xì)胞形態(tài)、誘導(dǎo)局部細(xì)胞聚集、促使細(xì)胞游走和調(diào)控癌細(xì)胞無限增殖等過程。Kang等[11]研究數(shù)據(jù)表明，在血管新生過程中，CD146起到了重要作用，其中包括了新生血管生成的多個(gè)環(huán)節(jié)，如促使內(nèi)皮細(xì)胞增殖、黏附和遷移。CD146 調(diào)節(jié)腫瘤血管形成的機(jī)制可能是激活了MMP-2，后者能夠降解基膜和細(xì)胞外基質(zhì)；激活生長因子，最主要是血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子（vascular endothelial growth factor， VEGF），這種作用有利于腫瘤轉(zhuǎn)移和腫瘤血管形成[13]。

本研究采用免疫組織化學(xué)方法結(jié)合RT-qPCR和western blot方法檢測人骨肉瘤組織中 CD146的表達(dá)，探討它與骨肉瘤臨床特征的關(guān)系及其臨床意義。研究結(jié)果顯示，CD146在骨肉瘤組織中高表達(dá)，其MVD值顯著高于骨肉瘤周圍非惡性組織，并且利用RT-qPCR和western blot方法檢測骨肉瘤組織標(biāo)本中CD146的表達(dá)也同樣證實(shí)了這個(gè)結(jié)論。同時(shí)，CD146的表達(dá)與骨肉瘤的Enneking 分期及有無肺轉(zhuǎn)移顯著相關(guān)（P<0.01），隨著骨肉瘤組織臨床分期及組織分化的進(jìn)展，CD146的表達(dá)有上升的趨勢，表明其表達(dá)上調(diào)與腫瘤惡性發(fā)展呈正相關(guān)。且骨肉瘤組織中有肺結(jié)轉(zhuǎn)移組陽性表達(dá)率顯著高于無肺轉(zhuǎn)移組，這表明CD146在骨肉瘤的發(fā)生和發(fā)展過程中均起著十分重要的作用，其分子水平的高低可能可以成為衡量骨肉瘤疾病活動(dòng)程度中的一個(gè)重要的指標(biāo)。

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