趙鵬，楊紅生，孫麗娜

（1.中國科學(xué)院海洋研究所，山東 青島 266071；2.國家海洋信息中心 天津 300171）

仿刺參（Apostichopus japonicus） 屬棘皮動物門（Echinodermata），海參綱（Holothuroidea），楯手目（Aspidochirotida），刺參科（Stichopodidae）。主要分布于北太平洋沿岸淺海，是經(jīng)濟(jì)價值很高的海水養(yǎng)殖對象（廖玉麟，1997）。楯手目海參依靠觸手黏附、掃取沉積物；攝食時充分伸展觸手，分泌粘液、黏附沉積物碎屑，并將碎屑送入口咽部。海參綱部分生物對食物的粒度和有機(jī)物含量具有選擇性，觸手作為海參主要的攝食器官對食物的選擇具有重要作用。研究仿刺參觸手形態(tài)結(jié)構(gòu)及粘液細(xì)胞的類型和功能對研究仿刺參的攝食有重要意義。

棘皮動物作為底棲生物，其行為和適應(yīng)性與底質(zhì)條件密切相關(guān)。附著、運(yùn)動、取食、挖洞等行為有賴于管足對底質(zhì)的黏附和抓取。管足是仿刺參主要的運(yùn)動器官，研究仿刺參管足的形態(tài)結(jié)構(gòu)及其肌肉組織、神經(jīng)組織、粘液細(xì)胞的類型、分布對研究仿刺參的運(yùn)動和分布具有重要意義。

對海參觸手結(jié)構(gòu)和功能的研究主要集中于枝手目海參成體。國外學(xué)者對楯手目部分種類海參觸手和管足結(jié)構(gòu)、功能進(jìn)行了報道（Cameron et al，1984）；國內(nèi)學(xué)者對仿刺參水管系統(tǒng)的組織學(xué)結(jié)構(gòu)也進(jìn)行了研究（朱峰，2009），但從攝食、運(yùn)動角度對仿刺參觸手、管足的結(jié)構(gòu)、功能的研究報道較少。此外，在人工條件下對攝食行為和攝食偏好進(jìn)行研究，獲取生物攝食、運(yùn)動等基礎(chǔ)知識對研究生物攝食生態(tài)學(xué)至關(guān)重要（Hudson，2005）。本研究旨在利用光鏡、組織學(xué)、組織化學(xué)、電鏡技術(shù)等方法對仿刺參觸手、管足的結(jié)構(gòu)及粘液細(xì)胞等的類型進(jìn)行研究，為仿刺參攝食生態(tài)學(xué)的研究提供理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

仿刺參（體重50 g 左右） 取自山東青島膠南市圍堰養(yǎng)殖場，實(shí)驗(yàn)前，置于實(shí)驗(yàn)室循環(huán)水水槽內(nèi)暫養(yǎng)7 d，水溫15 ℃～18 ℃。每日投喂海泥、益參寶混合餌料（比例2 ∶1）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 麻醉

將仿刺參放入盛有1L 新鮮海水的玻璃容器內(nèi)。待海參觸手、管足伸出后，向海水中逐滴滴加10%MgCl2，至仿刺參運(yùn)動減弱，觸手、管足伸展、不再收縮時為止。2 h 后，取出仿刺參個體，進(jìn)行固定。

1.2.2 組織學(xué)和組織化學(xué)觀察

仿刺參整體用Bouin 氏固定液固定24 h 后（仿刺參觸手、管足較薄，固定液容易穿透，故無需向仿刺參體內(nèi)注射固定液），保存于70%酒精中。取觸手和管足，常規(guī)石蠟切片，切片厚度4 μm，Nikon 80i 型顯微鏡下觀察和拍照。

H.E.染色用于顯示組織細(xì)胞的基本結(jié)構(gòu)；Milligan 三色染色用于觀察肌肉、膠原的分布。

按愛茜藍(lán)-過碘酸雪夫氏法（AB-PAS） 對觸手、管足的粘液細(xì)胞、粘多糖進(jìn)行染色定位。其中中性粘多糖呈紅色、酸性粘多糖呈藍(lán)色、混合性粘多糖呈紫紅色。

1.2.3 掃描電鏡觀察

仿刺參整體用5%戊二醛固定液固定2 h 后，取管足、觸手、口咽部組織塊，經(jīng)0.1 mol/L 磷酸緩沖液（pH=7.4） 沖洗后，放入0.1 mol/L 磷酸緩沖液保存。臨界點(diǎn)干燥儀干燥，IB-3 型離子濺射儀噴金，KYKY2800B 型掃描電鏡下觀察、拍照。

1.2.4 透射電鏡觀察

將待取組織浸入3.5%戊二醛中15 min 左右后，取1×1×1 mm3仿刺參觸手、管足組織塊放入3.5%戊二醛固定液固定24 h。1%鋨酸后固定，乙醇梯度脫水，Epon812 環(huán)氧樹脂包埋，LKB 超薄切片機(jī)切片。醋酸鈾和檸檬酸鉛雙重染色，日立H-7000 型透射電鏡下觀察、拍照。

1.2.5 行為學(xué)觀察

在120×40×40 cm，水深20 cm 的玻璃水槽中，從水槽底部和側(cè)面觀察刺參攝食和運(yùn)動行為。

2 結(jié)果

2.1 觸手

2.1.1 掃描電鏡觀察

仿刺參口咽周圍有20 個觸手。觸手由柄部、楯狀觸手組成。楯狀觸手由掌心中央向外形成大致對稱的8 個主要分支，一些主要分支又形成次級、三級或更細(xì)的分支，在分支的腹面分布有許多1-3個一簇的乳突（圖1.A）。楯狀觸手的乳突上密布大量的微絨毛和小孔（圖1.B，1.C）。而位于楯狀觸手掌心的細(xì)胞則沒有微絨毛（圖1.D）。乳突和掌心上都分布有大量的粘液，黏附著顆粒物質(zhì)（圖1.C，1.D）。

2.1.2 組織學(xué)和組織化學(xué)觀察

仿刺參的觸手柄部自外向內(nèi)依次為角質(zhì)層、上皮、疏松結(jié)締組織、致密結(jié)締組織、神經(jīng)層、縱肌層、間皮（圖2.A，2.C）。致密結(jié)締組織靠近神經(jīng)層一側(cè)分布有1-2 層細(xì)胞呈AB 陽性，含有酸性粘多糖（圖2.F）。在結(jié)締組織、觸手分支基部，分布有眼點(diǎn)（圖2.D）。

圖1 觸手的掃描電鏡觀察

仿刺參觸手末端與柄部結(jié)構(gòu)組成大部分相同（圖2.E），僅在觸手末端腹面上皮加厚，且分布有大量神經(jīng)感覺細(xì)胞；觸手末端結(jié)締組織較?。▓D2.B）。結(jié)締組織、觸手末端和眼點(diǎn)中含有大量酸性粘多糖（圖2.C，2.D，2.E）。

2.1.3 透射電鏡觀察

圖2 觸手的組織學(xué)結(jié)構(gòu)和組織化學(xué)觀察

透射電鏡照片顯示仿刺參觸手乳突上皮主要由柱狀細(xì)胞組成，柱狀細(xì)胞中包含有電子密度高的顆粒囊泡，細(xì)胞核位于近基底面，而顆粒囊泡集中在上皮細(xì)胞的近游離面。上皮表層有大量微絨毛，一些微絨毛中含有顆粒囊泡。乳突上皮層中還分布有帶微絨毛環(huán)的無纖毛分泌細(xì)胞（non-ciliated secretory cells，NCS） （圖3.A）。

仿刺參水管系統(tǒng)內(nèi)側(cè)間皮主要由變形細(xì)胞組成，變形細(xì)胞內(nèi)側(cè)為縱肌纖維，肌纖維附近有大量線粒體。肌纖維內(nèi)側(cè)為致密的膠原纖維組成的基膜，這在水管系統(tǒng)和觸手乳突上皮較為常見?；?nèi)側(cè)為一層神經(jīng)細(xì)胞，神經(jīng)層內(nèi)側(cè)為致密結(jié)締組織（圖3.B）。

圖3 觸手超微結(jié)構(gòu)觀察

2.2 口咽

口咽的掃描電鏡照片顯示，口咽表皮環(huán)向內(nèi)折，形成許多褶皺（圖4.A）。表皮上分泌有大量粘液，黏附大量顆粒狀物質(zhì)，但表皮沒有微絨毛分布（圖4.B）。

圖4 口咽的掃描電鏡照片

2.3 管足

2.3.1 掃描電鏡觀察

仿刺參的管足由柄部和吸盤組成（圖5.A），吸盤分為外緣的外周區(qū)和中央凹陷。吸盤表面密布著大量微絨毛和小孔（圖5.B）。吸盤上分布著粘液，黏附有顆粒物質(zhì)。

圖5 管足的掃描電鏡照片

2.3.2 組織學(xué)和組織化學(xué)觀察

仿刺參管足壁自內(nèi)向外依次為間皮、縱肌層、神經(jīng)層、致密結(jié)締組織、疏松結(jié)締組織、上皮、角質(zhì)層（圖6.A，6.D）。在神經(jīng)層與結(jié)締組織之間有一層呈AB 陽性的細(xì)胞，含有酸性粘多糖（圖6.B）。

圖6 管足的組織學(xué)和組織化學(xué)觀察

仿刺參管足盤狀端自外向內(nèi)依次為角質(zhì)層、上皮、神經(jīng)板、結(jié)締組織、端板、間皮（圖6.C）。管足壁的縱肌層連接端板兩端（圖6.A）。管足頂端上皮加厚，酸性粘多糖含量豐富。

2.3.3 透射電鏡觀察

仿刺參管足縱切的透射電鏡照片顯示，仿刺參管足吸盤上皮有許多微絨毛和纖毛。著生纖毛的細(xì)胞是有纖毛的非分泌細(xì)胞（ciliated non-secretory cells，CNS），纖毛伸出表皮，有規(guī)則的“9+2”結(jié)構(gòu)（圖7.A）。無纖毛分泌細(xì)胞（non-ciliated secretory cells，NCS） 的細(xì)胞核位于細(xì)胞遠(yuǎn)離表皮一端（圖7.B），細(xì)胞向表皮一側(cè)伸出長的凸起到達(dá)管足吸盤末端（圖7.B）。NCS 含有電子密度高的粘液顆粒，細(xì)胞頂端有充有該種粘液顆粒的微絨毛狀細(xì)胞凸起，細(xì)胞頂端有環(huán)有微絨毛的開口，這種孔在掃描電鏡照片中也能看到。一些NCS 絨毛狀凸起中的粘液顆粒在管足吸盤附著后被排出（圖7.A）。支持細(xì)胞（support cell，SC） 填充與以上細(xì)胞之間（圖7.A）。

圖7 管足吸盤表皮的超微結(jié)構(gòu)觀察

2.4 攝食和運(yùn)動行為觀察

2.4.1 攝食行為觀察

刺參依靠觸手?jǐn)z食沉積物。攝食時，觸手末端分支接觸沉積物，并充分伸展呈“樹枝”狀，停留2-5 秒后，觸手分支在觸手柄部的帶動下脫離沉積物表面，并插入口咽。在這一過程中，觸手分支收縮，附著在觸手上的沉積物顆粒部分脫落。同一時間段內(nèi)，若干觸手同時接觸沉積物或插入口咽。

2.4.2 運(yùn)動行為觀察

刺參運(yùn)動時，身體前端管足吸附在附著基上，中部體壁收縮并隆起呈倒U 型，后部向前移動；后部吸附附著基，中部伸展，前端向前移動。在光滑的附著基上，管足吸盤牢固地吸附在附著基上，在細(xì)沙或淤泥表面，管足不能牢固地附著，但管足深長插入沉積物，并留下“足印”。

3 討論

3.1 攝食器官

仿刺參通過在沉積物上伸展、收縮觸手，并將觸手插入口咽攝取食物。伸展觸手時，與水管系統(tǒng)末端分支相連的縱向分布的肌纖維舒張，包圍壇囊（ampullae） 的肌纖維收縮，將水壓入水管腔中，導(dǎo)致觸手伸長；而觸手壁的結(jié)締組織則防止水管橫向膨脹。水管腔延伸到仿刺參觸手乳突的末端，使觸手更容易伸長，縱肌纖維收縮引發(fā)觸手收縮。仿刺參觸手的8 個主要分支軸對稱排列，在觸手舒張時，能夠向前向兩側(cè)伸展，使觸手腹面表面積最大化。與觸手柄部的上皮相比，仿刺參觸手乳突上皮分布有大量柱狀粘液細(xì)胞，分泌的粘液可以在微絨毛縫隙間形成粘液層，起到黏附食物的作用。結(jié)合仿刺參觸手在沉積物表面舒展、接觸，而非抓取食物的特點(diǎn)看，仿刺參主要通過粘液黏附食物并送入口咽中。仿刺參觸手乳突腹面有大量微絨毛，而“掌心”則沒有微絨毛，因此，仿刺參觸手黏附食物顆粒的主要部位是觸手的乳突。刺參神經(jīng)層向觸手柄部外側(cè)和乳突發(fā)出樹突，并延伸至乳突末端，這意味著觸手乳突不僅僅分泌粘液還能接受并傳遞外界信號。此外，觸手上分布的眼點(diǎn)也能感覺外界信號。

在對海參（Cucumaria pseudocurata） 的觸手乳突由許多頂端著生微絨毛的分泌細(xì)胞組成，細(xì)胞中含有膜包被的粘液顆粒（粘液囊泡），這些顆粒無疑可以將乳突和食物粘合起來（Hermans et al，1983）。與其他海參相似，仿刺參觸手乳突上皮微絨毛以及著生有環(huán)狀微絨毛的無纖毛細(xì)胞也有電子密度高的粘液囊泡，這些粘液囊泡在形態(tài)學(xué)和組織化學(xué)上與其他無脊椎動物粘液腺體分泌的粘液囊泡相似（Hermans et al，1983），可從微絨毛中釋放出來。觸手乳突是與海膽球形叉棘上感覺小丘同源的感覺部位（Bouland et al，1982），其上皮的無纖毛粘液細(xì)胞能感受到機(jī)械和化學(xué)刺激（Fankboner et al，1978），而管足上相似的細(xì)胞則專司化學(xué)感覺（Burke，1980）。本研究中，仿刺參觸手乳突存在無纖毛粘液細(xì)胞可能意味著觸手能夠感覺沉積物的成分和形態(tài)。不過也有學(xué)者認(rèn)為，棘皮動物表皮細(xì)胞缺乏感覺特異性。Hermans 等（1983） 認(rèn)為海參觸手表面只有一種分泌粘液的細(xì)胞存在，海參無法主動脫去食物顆粒，即海參觸手表面存在著一種僅能粘附捕獲食物、而不能丟棄食物的單腺（single gland） 粘附機(jī)制。在本研究中，觀察到一種含有電子密度高的顆粒囊泡的分泌細(xì)胞（圖3A），雖然尚不清楚觸手表面其他細(xì)胞的功能，不能斷定仿刺參觸手粘液細(xì)胞是單腺機(jī)制，但進(jìn)一步研究仿刺參觸手粘液細(xì)胞的類型和功能無疑是研究其攝食機(jī)制的重要方向。

仿刺參從沉積物表面撤回觸手后，在口咽部環(huán)狀分布的褶皺處刮掉食物。口咽處的粘液粘附食物，口咽收縮，食物進(jìn)入消化道。觀察中發(fā)現(xiàn)，一些顆粒從口咽中被排出，但尚不清楚這種現(xiàn)象是對食物的主動選擇還是食物從口咽部脫落。與本研究的結(jié)果相類似，海參（C.pseudocurata） 觸手表面只有一種分泌粘液的細(xì)胞存在，觸手不能主動釋放食物，而需借助口咽分泌的大量粘液完成（Hermans et al，1983）。仿刺參在口咽部刮掉食物這一現(xiàn)象可能預(yù)示著仿刺參觸手不能主動脫去食物顆粒，缺乏挑揀、辨識沉積物顆粒的能力。

3.2 運(yùn)動器官

仿刺參管足由柄部和吸盤組成，柄部通過與觸手類似的機(jī)制延長、收縮。管足柄部肌纖維末端連接吸盤的篩板，肌纖維收縮導(dǎo)致吸盤與附著基之間形成低壓空腔，使仿刺參附著在附著基上。雖然管足吸盤能強(qiáng)有力的吸附表面光滑的物體，但仿刺參在粒徑小于管足直徑的沉積物上仍能運(yùn)動，管足像“錨”一樣伸入沉積物內(nèi)部固定住身體，再通過伸展和收縮體壁向前運(yùn)動。這種現(xiàn)象意味著除管足吸盤“抽真空”式地吸附附著基以外，管足上還有其他參與附著的機(jī)制。Paine（1926） 首次通過實(shí)驗(yàn)證明了棘皮動物管足化學(xué)（粘液） 粘附的重要性，她發(fā)現(xiàn)海星（Asterias vulgaris） 帶有粘液吸盤的粘附能力比吸盤單獨(dú)的粘附能力高一倍。Smith（1937） 在對海星綱、海膽綱、海參綱代表性物種進(jìn)行研究后，認(rèn)為它們吸盤發(fā)達(dá)的吸附能力是由機(jī)械吸附和粘液黏附共同參與的。海參（Holothuria forskali） 管足沒有吸盤，完全靠分泌粘液在附著基上移動（Flammang et al，1992）。Binyon（1972）對海星（A.vulgaris） 的研究中發(fā)現(xiàn)其吸盤44%的粘附能力來自于管足吸盤分泌的粘液。綜上所述，仿刺參管足粘液粘附和吸盤吸附對其運(yùn)動能力均有貢獻(xiàn)。

與觸手乳突一樣，管足吸盤表面也有大量微絨毛，并有帶微絨毛環(huán)的纖毛。管足柄部的組織學(xué)結(jié)構(gòu)與觸手柄部類似。管足吸盤的鈣質(zhì)篩板與柄部的縱肌纖維相連，吸盤下方有一層神經(jīng)組織，神經(jīng)細(xì)胞的末端到達(dá)吸盤上皮。Hermans 等（1983） 提出棘皮動物管足上存在著一種雙腺（duo-gland） 粘附-脫粘附機(jī)制來控制管足粘附和脫離附著基。Flammang 等（1998） 發(fā)現(xiàn)海參H.forskali 吸盤表面有5 種細(xì)胞：無纖毛細(xì)胞（NCS，I 型、II 型）、支持細(xì)胞（SC）、有纖毛的非分泌細(xì)胞（CNS）、有纖毛的分泌細(xì)胞（CS）。他認(rèn)為NCS 釋放粘性分泌物，而CS 釋放去粘性分泌物或抑制NCS 釋放粘性分泌物。粘附時，管足表皮和附著基之間形成薄的粘液層；脫粘附時，CS 釋放酶等終止粘性物質(zhì)與粘液層分離，并使管足與基質(zhì)脫離。本研究中（圖7A、B），發(fā)現(xiàn)了細(xì)胞細(xì)長，細(xì)胞核位于神經(jīng)板上方的NCS、細(xì)胞的細(xì)胞核位于上皮表層的SC 和CNS，CNS 細(xì)胞有伸出表皮的纖毛，與SC 細(xì)胞一起被認(rèn)為是與感覺有關(guān)的細(xì)胞，未發(fā)現(xiàn)鞭毛向下著生的CS，但這并不意味著仿刺參沒有該種細(xì)胞。雙腺粘附-脫粘附機(jī)制仍可能作為解釋仿刺參運(yùn)動器官與附著基相互作用的一種學(xué)說。

4 小結(jié)

（1） 仿刺參觸手和管足的組織結(jié)構(gòu)相似，縱肌纖維和水管系統(tǒng)配合完成觸手和管足的伸展、收縮和彎曲；觸手和管足均含酸性粘多糖。

（2） 仿刺參觸手乳突頂端分布有一種含有顆粒囊泡的粘液細(xì)胞，粘液細(xì)胞通過細(xì)胞表面的微絨毛分泌粘液粘附食物顆粒。仿刺參觸手不能主動脫掉食物顆粒，而需在口咽部刮掉食物顆粒。

（3） 仿刺參管足吸盤表層有CNS、SC、NCS 細(xì)胞，它們在管足與附著基結(jié)合過程中起到重要作用。

Binyon J，1972. Effects of Diluted Sea-Water Upon Podial Tissues of Starfish Asterias Rubens L..Comparative Biochemistry and Physiology，41：1-8.

Bouland C，Massin C，Jangoux M，1982.The Fine-Structure of the Buccal Tentacles of Holothuria Forskali（Echinodermata，Holothuroidea）.Zoomorphology，101：133-149.

Burke R D，1980. Podial Sensory Receptors and the Induction of Metamorphosis in Echinoids.Journal of Experimental Marine Biology and Ecology，47：223-234.

Cameron J L，F(xiàn)ankboner P V，1984. Tentacle structure and feeding processes in life stages of the commercial sea cucumber Parastichopus californicus （Stimpson）. Journal of Experimental Marine Biology and Ecology，81：193-209.

Fankboner P V，1978.Suspension-Feeding Mechanisms of Armored Sea-Cucumber Psolus chitinoides Clark. Journal of Experimental Marine Biology and Ecology，31：11-25.

Flammang P，Michel A，Van Cauwenberge，et al，1998. A study of the temporary adhesion of the podia in the sea star Asterias rubens（Echinodermata，Asteroidea） through their footprints. Journal of Experimental Biology，201，2383-2395.

Flammang P，Jangoux M，1992.Functional-Morphology of the Locomotory Podia of Holothuria forskali （Echinodermata，Holothuroida）.Zoomorphology，111：167-178.

Hermans C O，1983. The duo-gland adhesive system. Oceanography and Marine Biology，21：283-339.

Hudson I R，Wigham B D，Solan M，er al，2005. Feeding behaviour of deep-sea dwelling holothurians：Inferences from a laboratory investigation of shallow fjordic species. Journal of Marine Systems，57：201-218.

Paine V L，1926. Adhesion of the tube feet in starfishes. Journal of Experimental Zoology，45：361-366.

Smith N A，1937. The structure and function of thte tube feet in certain echinoderms.Journal of Marine Ecoloy Progress Series，2：257-264.

廖玉麟，1997.中國動物志棘皮動物門海參綱.北京：科學(xué)出版社.

朱峰，2009.仿刺參Apostichopus japonicus 胚胎發(fā)育和主要系統(tǒng)的組織學(xué)研究.碩士學(xué)位論文，青島：中國海洋大學(xué).