周詩(shī)璞，林華，楊健

(1.通江縣人民醫(yī)院感染科，四川 巴中 636700；2.四川省出入境檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心，四川 成都 610041；3.川北醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，四川 南充 637000)

致病性大腸桿菌(enteropathogenic Escherichia coli，EPEC)是發(fā)展中國(guó)家引起嬰幼兒腹瀉的一個(gè)重要病原體[1-2]，EPEC感染宿主細(xì)胞典型的改變是：細(xì)菌先黏附宿主上皮細(xì)胞，接著在細(xì)菌黏附的地方有基墊形成，最后造成小腸上皮細(xì)胞微絨毛脫落損傷，整個(gè)病理過(guò)程簡(jiǎn)稱(chēng)為黏附、脫落損傷(attaching and effacing lesion，A/E)。近年來(lái)，對(duì)EPEC的致病機(jī)制的研究發(fā)現(xiàn)：EPEC是通過(guò)自身編碼表達(dá)的Ⅲ型分泌系統(tǒng)(Type Ⅲ secretion system，T3SS)向宿主細(xì)胞注入毒力分子(比如外膜蛋白受體Tir、分泌蛋白EspF、Map等)發(fā)揮相應(yīng)的生物學(xué)效應(yīng)，盡管對(duì)EPEC的致病機(jī)制研究取得了較大的進(jìn)展，但對(duì)EPEC參與宿主上皮細(xì)胞微絨毛損傷的效應(yīng)分子仍未清楚[3]，本研究用EPEC多種效應(yīng)分子刪除株感染極化培養(yǎng)的結(jié)腸上皮腫瘤細(xì)胞TC-7，用掃描電鏡(scanning electron microscope，SEM)檢測(cè)細(xì)菌黏附和微絨毛脫落損傷，以探討參與細(xì)菌黏附和微絨毛損傷的效應(yīng)分子。

1 材料方法

1.1 材料

菌株、細(xì)胞和質(zhì)粒EPEC野生型(2348/69)、EPEC T3SS刪除株(Δcfm-14)、EPEC束狀菌毛刪除株(ΔbfpA)、EPEC外膜蛋白刪除株(Δeae)、EPEC外膜蛋白轉(zhuǎn)位受體刪除株(Δtir)、效應(yīng)分子Map和EspF聯(lián)合缺失株(Δmap espF)、效應(yīng)分子Map缺失株(Δmap)等由英國(guó)紐卡斯?fàn)柎髮W(xué)Brendan Kenny教授惠贈(zèng)，TC-7細(xì)胞由本實(shí)驗(yàn)室保存、質(zhì)粒pACYC184-espF、pACYC184-bfpA、pACYC184-tir和pACYC184-intimin由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建保存。

試劑和儀器細(xì)胞培養(yǎng)基DMEM購(gòu)自Invitrogen公司，電轉(zhuǎn)儀購(gòu)自BIO-RAD公司，PCR試劑盒購(gòu)自大連寶生物有限責(zé)任公司，掃描電鏡購(gòu)自英國(guó)Cambridge公司，生物安全柜購(gòu)自Thermo公司。

1.2 方法

1.2.1 TC-7細(xì)胞培養(yǎng)與感染 TC-7 細(xì)胞生長(zhǎng)DMEM中(含2 mmol/L的谷氨酰胺，1%的非必須氨基酸，10%加熱滅活的胎牛血清)，待細(xì)胞長(zhǎng)滿(mǎn)培養(yǎng)瓶，消化細(xì)胞，并按1∶1稀釋接種細(xì)胞到Transwell小室中，持續(xù)培養(yǎng)20 d，使細(xì)胞極化(在此期間，每?jī)商鞊Q細(xì)胞基底側(cè)和刷狀緣側(cè)培養(yǎng)液各1次)，感染前2～3 h，用37 ℃預(yù)熱的DMEM洗滌細(xì)胞。

1.2.2 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染 用冰冷蒸餾水洗滌EPEC基因刪除株3次以制備感受態(tài)細(xì)胞，-80 ℃保存?zhèn)溆?。電轉(zhuǎn)前，取1 μL質(zhì)粒和感受態(tài)細(xì)胞相混合，冰上孵育30 min，用電穿孔方式轉(zhuǎn)染EPEC(1 500 v 5 ms)，把細(xì)菌均勻涂布含有25 μg/mL氯霉素的平板上篩選轉(zhuǎn)化子，并用PCR鑒定轉(zhuǎn)化子，PCR陽(yáng)性的轉(zhuǎn)化子用于進(jìn)一步的感染實(shí)驗(yàn)。

1.2.3 SEM檢測(cè)束狀菌毛在EPEC黏附中的作用 實(shí)驗(yàn)分為未感染組、ΔbfpA感染組、ΔbfpA/pACYC184-bfpA感染組和EPEC野毒株感染組，分別接種細(xì)菌到含有25 μg/mL氯霉素的LB培養(yǎng)液中，靜置于37 ℃培養(yǎng)過(guò)夜；次日，接種10 μL過(guò)夜培養(yǎng)物到2 mL無(wú)血清的DMEM培養(yǎng)液中于37 ℃、5%CO2的孵箱誘導(dǎo)培養(yǎng)3 h ；吸出Transwell小室中培養(yǎng)液，加入500 μL誘導(dǎo)后的細(xì)菌感染TC-7細(xì)胞，于37 ℃，5%CO2感染2 h；用預(yù)熱的PBS洗滌細(xì)胞4次，以清除游離的細(xì)菌；用2.5%多聚甲醛和2.5%的戊二醛混合液于4 ℃固定細(xì)胞過(guò)夜；棄去固定液體，并逐級(jí)脫水：順序用20%、30%、50%、70%、90%和100%的乙醇脫水5 min，標(biāo)本臨界點(diǎn)干燥，噴金，SEM檢測(cè)細(xì)菌的黏附，菌落的形成以及微絨毛的脫落。

1.2.4 SEM檢T3SS在細(xì)菌黏附及微絨毛損傷中的作用 分別用T3SS刪除株Δcfm-14、EPEC野生型感染極化的TC-7細(xì)胞，并以未感染組做實(shí)驗(yàn)對(duì)照，感染方法同前，并于感染的15 min、30 min、60 min用SEM檢測(cè)細(xì)菌的黏附及微絨毛脫落損傷。

1.2.5 SEM檢測(cè)Tir和intimin在細(xì)菌黏附及微絨毛損傷中的作用 同樣方法用Δeae刪除株、Δtir刪除株、Δeae/pACYC184-intimin和Δtir/pACYC184-tir互補(bǔ)株感染TC-7細(xì)胞2 h，SEM檢測(cè)細(xì)菌的黏附及微絨毛脫落損傷。

1.2.6 SEM檢測(cè)Map和EspF在細(xì)菌黏附及微絨毛損傷中的作用 同樣的方法用ΔespF、Δmap espF、Δmap刪除株以及Δmap espF/pACYC184-espF互補(bǔ)株感染TC-7細(xì)胞2 h，SEM檢測(cè)細(xì)菌的黏附及微絨毛脫落損傷。

2 結(jié)果

2.1 BfpA在細(xì)菌黏附及微絨毛損傷中的作用

經(jīng)20 d極化培養(yǎng)，TC-7細(xì)胞表面可見(jiàn)大量的微絨毛覆蓋，微絨毛整齊，致密；EPEC野毒株感染2 h，可見(jiàn)細(xì)菌大量緊密黏附在細(xì)胞表面，菌落比較致密而扁平，微絨毛變得紊亂并大量脫落；當(dāng)用ΔbfpA感染時(shí)，可見(jiàn)極小量的細(xì)菌黏附在上皮細(xì)胞表面，上皮細(xì)胞微絨毛完整，沒(méi)有明顯微絨毛脫落；當(dāng)用相應(yīng)質(zhì)粒補(bǔ)充BfpA表達(dá)以后，突變株恢復(fù)到野生型相似的表型(圖1)。

2.2 T3SS在細(xì)菌黏附及微絨毛損傷的作用

當(dāng)用EPEC野毒株感染，在15 min時(shí)可看見(jiàn)大量細(xì)菌黏附在細(xì)胞表面，菌落呈球形，成局限性黏附，在感染30 min可觀(guān)察到細(xì)菌仍局限性黏附在細(xì)胞表面，但在感染1 h，細(xì)菌呈扁平而致密的方式緊密黏附在細(xì)胞表面，并且伴隨大量微絨毛脫落損傷；而Δcfm-14即使到感染后2 h，細(xì)菌仍然成局限性黏附的形式，可以觀(guān)察到微絨毛略顯紊亂，但無(wú)顯著的微絨毛脫落損傷(圖2)。

2.3 外膜蛋白intimin及其受體Tir在細(xì)菌黏附及微絨毛損傷中作用

當(dāng)用Δtir或Δeae刪除株感染TC-7細(xì)胞，可見(jiàn)：細(xì)胞皆局限性黏附在細(xì)胞表面，且大量的微絨毛脫落，而EPEC野毒株感染后形成平坦而緊密的菌落；但當(dāng)用質(zhì)粒補(bǔ)充Intimin和Tir表達(dá)，Δtir或Δeae可以分別恢復(fù)到野毒株相似的表型特征(圖3)。

2.4 效應(yīng)分子EspF和Map在黏附及微絨毛損傷中作用

當(dāng)用ΔespF、Δmap、Δmap espF等刪除株感染細(xì)胞發(fā)現(xiàn)，Δmap能引起與野生型相似的黏附脫落損傷表型，而ΔespF和Δmap espF感染細(xì)胞后，可以觀(guān)察到微絨毛紊亂，而且可以明顯觀(guān)察到細(xì)菌嵌入微絨毛叢中，但微絨毛損傷明顯比野毒株輕微，當(dāng)用質(zhì)粒補(bǔ)充表達(dá)EspF后，ΔespF恢復(fù)到野生型相似的表型(圖4)。

3 討論

TC-7細(xì)胞是從結(jié)腸癌Caco-2細(xì)胞克隆的一個(gè)細(xì)胞株，主要用于物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)、屏障功能和刷狀緣微絨毛等研究[4]。EPEC既不產(chǎn)毒素，也不侵襲腸黏膜上皮細(xì)胞的腸道致病菌，其致病主要靠其攜帶的LEE基因編碼效應(yīng)分子轉(zhuǎn)位到宿主細(xì)胞引起細(xì)胞病變[5]。Cleary等[6-7]報(bào)道：細(xì)菌的黏附是EPEC感染宿主細(xì)胞的第一步，束狀菌毛(bundle forming pili，BFP)與細(xì)菌黏附高度相關(guān)。為了進(jìn)一步探討B(tài)FP的作用，本研究采用ΔbfpA(刪除菌毛的重要亞單位BfpA)感染TC-7細(xì)胞。SEM檢測(cè)發(fā)現(xiàn)：該刪除株只有少數(shù)幾個(gè)細(xì)菌黏附到宿主細(xì)胞表面，與野生型EPEC感染形成鮮明對(duì)比，當(dāng)用質(zhì)粒補(bǔ)充表達(dá)BfpA后，恢復(fù)了ΔbfpA的表型，充分表明BFP是細(xì)菌黏附的重要器官[8]，同時(shí)表明：BfpA是BFP的重要亞單位結(jié)構(gòu)。

Tir是外膜蛋白Intimin的轉(zhuǎn)位受體，Tir被轉(zhuǎn)位以后，被宿主細(xì)胞的蛋白激酶修飾以后插入到宿主細(xì)胞的細(xì)胞膜，通過(guò)其胞外區(qū)和Intimin結(jié)合，從而細(xì)胞緊密黏附到宿主細(xì)胞表面[9]。Humberto等[7]和Ferreira等[10]用細(xì)胞為模型研究發(fā)現(xiàn)：當(dāng)用Intimin抗體處理細(xì)菌以后，細(xì)菌的黏附功能顯著下降，表明Intimin是細(xì)菌的另一個(gè)重要的黏附分子，我們用Δtir和Δintimin突變株感染細(xì)胞，SEM檢測(cè)發(fā)現(xiàn)兩個(gè)突變株細(xì)菌都可以大量黏附宿主細(xì)胞，但呈局限性黏附，意想不到的是：它們引起比野生型更嚴(yán)重的微絨毛脫落損傷，當(dāng)用質(zhì)粒補(bǔ)充表達(dá)Tir和Intimin以后，Δtir和Δintimin恢復(fù)到野生型的緊密黏附表型，表明Tir和Intimin的結(jié)合是細(xì)菌緊密黏附的關(guān)鍵。對(duì)于微絨毛損傷，推測(cè)Tir和Intimin的結(jié)合起保護(hù)作用，與細(xì)菌維持持續(xù)感染有關(guān)系[11]，Δtir和Δintimin感染時(shí)，由于Tir和Intimin不能結(jié)合，反而加重了微絨毛的破壞。當(dāng)用其它效應(yīng)分子刪除株感染細(xì)胞，可以觀(guān)察到：ΔespF刪除株感染時(shí)微絨毛損傷明顯較野生型引起的輕微，但有大量細(xì)菌黏附以及陷入微絨毛叢，但用質(zhì)粒補(bǔ)充表達(dá)EspF以后，ΔespF恢復(fù)到野生型的表型，表明EspF在微絨毛的損傷中扮演重要的角色；而Δmap espF雙刪除株感染組具有和ΔespF刪除株感染組相似的表型，而Δmap感染組具有和野生型感染組相似的表型，進(jìn)一步表明EspF在微絨毛的損傷中其重要作用。關(guān)于EspF的研究還發(fā)現(xiàn)：EspF可以改變細(xì)胞間的緊密連接，破壞細(xì)胞的屏障結(jié)構(gòu)[12]；EspF還可以定位于宿主細(xì)胞線(xiàn)粒體，破壞線(xiàn)粒體功能，從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[13]，這些結(jié)果充分表明：EspF是EPEC感染過(guò)程中的關(guān)鍵的毒力分子[14]。