李靜，劉佳亮，曹學(xué)彬*，王福辰，李君華，鄭龍華，郭治誠，孫路平，劉石林

(1.山東東方海洋科技股份有限公司 國家海藻與海參工程技術(shù)研究中心，山東 煙臺 264003；2.中國科學(xué)院海洋研究所 海洋生態(tài)與環(huán)境科學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 青島 266071)

刺參ApostichopusjaponicusSelenka主要分布于35°N～44°N的西北太平洋沿岸[1-2]。刺參棲息于淺海,多在大型藻類著生巖礁附近爬行,以生物碎屑、微藻、各種細(xì)菌和原生動物等為食[3-4]。

刺參體色變化較大，背面一般為黃褐色或棕褐色，腹面為淺黃褐色，此外還有黃綠色、赤褐色和灰白色，而背腹體色均為白色的刺參被稱為白刺參，背腹體色均為紫色的刺參被稱為紫刺參，這兩種刺參品系均為刺參的體色遺傳變異，在自然條件下極為罕見。一般認(rèn)為，刺參體色的深淺與生活環(huán)境有關(guān)，為了更好地保護(hù)自身，刺參的體色接近于周圍的環(huán)境，這也是自然條件下白刺參、紫刺參稀少的原因。目前，白刺參已實(shí)現(xiàn)了規(guī)?；B(yǎng)殖，有學(xué)者已進(jìn)行了初步研究。本研究團(tuán)隊(duì)收集的野生紫刺參親本，并進(jìn)行累代人工繁育，發(fā)現(xiàn)紫色這一體色特征可以穩(wěn)定遺傳。

光照是生物生長環(huán)境中不容忽視的生態(tài)因子，光照明顯影響水生動物的趨光性、集群性和晝夜活動節(jié)律[5-6]。對于刺參而言，其生長存活的光照強(qiáng)度對其生長、行為有明顯影響，且具有生長所需的最低和最適光照周期。自然條件下的刺參行為節(jié)律具明顯光周期，光照較強(qiáng)時在陰影處棲息，弱光條件時爬行覓食[7]，這是在長期進(jìn)化過程中形成的對其生活環(huán)境的一種適應(yīng)。目前，國內(nèi)外學(xué)者對魚類、甲殼類在光場中的反應(yīng)已有較多研究[8-12]，但有關(guān)光照對刺參特別是白刺參、紫刺參生長的影響報(bào)道較少。本試驗(yàn)在前期工作的基礎(chǔ)上，研究了光照強(qiáng)度對白刺參、紫刺參及普通刺參幼參生長、消化酶活性、免疫酶活性的影響，以期對其健康養(yǎng)殖提供有益的數(shù)據(jù)資料。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)用刺參為山東東方海洋科技股份有限公司海參研究中心于2016年4月繁育的白刺參、青刺參和紫刺參，試驗(yàn)開始時各品系刺參初始體質(zhì)量為白刺參(5.39±0.46)g、青刺參(5.36±0.51)g、紫刺參(5.29±0.37)g，各200頭。試驗(yàn)階段飼料為刺參配合飼料。

1.2 方法

1.2.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì) 試驗(yàn)于2017年春季進(jìn)行,周期為90 d，試驗(yàn)地點(diǎn)設(shè)在有暖氣的鋼結(jié)構(gòu)玻璃陽光房內(nèi),刺參暫養(yǎng)在透明玻璃水缸中。試驗(yàn)設(shè)置4個光照強(qiáng)度組(5～10、25～50、1000、20 000 lx)和1個全黑對照組(0 lx)，每組設(shè)4個平行，每個平行放10頭白刺參、10頭青刺參、10頭紫刺參。其中，20 000 lx相當(dāng)于養(yǎng)殖池塘(水深1.5 m)春季正午水底光照強(qiáng)度；1000 lx相當(dāng)于圍堰淺灘(水深3～5 m)春季正午水底光照強(qiáng)度；25～50 lx相當(dāng)于春季正午養(yǎng)殖車間無附著基水體光照強(qiáng)度；5～10 lx相當(dāng)于春季正午養(yǎng)殖車間附著基下水體光照強(qiáng)度；0 lx為全黑狀態(tài)。光照強(qiáng)度通過調(diào)節(jié)養(yǎng)殖水槽與室內(nèi)陽光距離及利用遮陽網(wǎng)來獲得。白天光照周期為春季陽光周期，夜間無燈光照明，為自然狀態(tài)。用水下照度計(jì)(美國LI-COR公司，型號LI-250A)測定光照強(qiáng)度。

1.2.2 試驗(yàn)管理 試驗(yàn)期間每天投餌一次，投餌量為刺參體質(zhì)量的2%～3%，根據(jù)刺參的攝食情況適當(dāng)調(diào)節(jié)投喂量。每天換水一次，日換水量為原水體的1/2，換水后投餌，每兩天清理一次糞便及殘餌。試驗(yàn)期間海水pH為7.8～8.1，養(yǎng)殖水溫為14～16 ℃，鹽度為28～30。

1.2.3 生長指標(biāo)的測定與計(jì)算 刺參特定生長率(SGR，%/d)計(jì)算公式為

SGR=(lnW1-lnW2)/t×100%。

其中：W1為試驗(yàn)結(jié)束時刺參的體質(zhì)量(每個平行刺參總質(zhì)量)(g)；W2為試驗(yàn)初始刺參的體質(zhì)量(g)；t為試驗(yàn)持續(xù)時間(d)。

1.2.4 免疫酶和消化酶活性的測定 在試驗(yàn)結(jié)束時，從每個平行取刺參1～2頭，稱取個體質(zhì)量，用醫(yī)用注射器抽取體腔液，在4 ℃下以3000 r/min冷凍離心15 min，取上清分裝于1 mL的離心管中，-20 ℃下保存，用于測定免疫酶指標(biāo)[13]。將抽取了體腔液的刺參置于冰盤上解剖并取出腸道，稱重，轉(zhuǎn)移至凍存管內(nèi)并加入pH為 7.0的磷酸緩沖液(Na2HPO4-NaH2PO4)，于-20 ℃下保存待測。

采用福林-酚試劑法和淀粉-碘顯色法[14]測定刺參腸道內(nèi)蛋白酶和淀粉酶活力。蛋白酶活力單位定義為：在pH 7.2和溫度40 ℃條件下保溫20 min，1 g刺參腸道1 min水解0.5%的酪蛋白產(chǎn)生1 g酪氨酸為1個蛋白酶活力單位。淀粉酶活力單位定義為：40 ℃條件下，30 min內(nèi)100 mL酶液中的淀粉酶完全水解可溶性淀粉10 mg為1個淀粉酶活力單位。采用考馬斯亮藍(lán)G-250法測定樣品的蛋白質(zhì)濃度。使用南京建成生物技術(shù)公司相應(yīng)試劑盒測定刺參腸道內(nèi)堿性磷酸酶(AKP)、酸性磷酸酶(ACP)及體腔液中超氧化物歧化酶(SOD)活力。

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)值以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±S.D.)表示，采用SPSS 19.0軟件對試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行單因素方差分析(ANOVA)和組間多重比較分析，顯著性水平設(shè)為0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同光照強(qiáng)度下刺參生長指標(biāo)的變化

從圖1可見：光照強(qiáng)度顯著影響刺參的特定生長率(P<0.05),隨著光照強(qiáng)度由高至低變化，各品系刺參特定生長率呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢；強(qiáng)光(20 000 lx)不利于3個品系刺參的生長，尤其對白刺參影響更為明顯(P<0.05)；全黑狀態(tài)亦不利于刺參生長，但對白刺參影響較小(P>0.05)；青、紫品系刺參均在25～50 lx時表現(xiàn)出最大增長率，而白刺參特定生長率在5～10 lx時表現(xiàn)最大。

2.2 不同光照強(qiáng)度下刺參腸道消化酶活性的變化

從圖2可見：光照強(qiáng)度對刺參腸道消化酶活性有顯著性影響(P<0.05)，隨著光照強(qiáng)度從20 000 lx降至0，各品系刺參腸道蛋白酶和淀粉酶活性均呈先升高后降低的趨勢；3個品系刺參均在25～50 lx光照強(qiáng)度時蛋白酶活性出現(xiàn)最大值，其中，青刺參蛋白酶活性最高；白、青刺參均在5～10 lx光照強(qiáng)度時淀粉酶活性出現(xiàn)最大值，紫刺參在25～50 lx光照強(qiáng)度時淀粉酶活性出現(xiàn)最大值；在所有光照強(qiáng)度試驗(yàn)組中，白刺參體內(nèi)淀粉酶活力均較高，在5～10 lx即白刺參特定生長率最為明顯的光照強(qiáng)度條件下，其淀粉酶活性顯著高于青、紫刺參(P<0.05)，而在每個光照強(qiáng)度條件下，白刺參腸道蛋白酶均低于同光照強(qiáng)度條件下青、紫刺參，這表明白刺參對蛋白質(zhì)的需求不如青、紫刺參高，能夠較多地利用淀粉類物質(zhì)。

2.3 不同光照強(qiáng)度下刺參腸道和體腔液中免疫酶活性的變化

從圖3可見：隨著光照強(qiáng)度由高至低變化，在青、紫刺參腸道中AKP和ACP活性呈先升高后降低的趨勢；光照強(qiáng)度對不同品系刺參腸道內(nèi)AKP和ACP的影響與對特定生長率的影響規(guī)律類似，青、紫刺參酶活力在25～50 lx光照強(qiáng)度下最大，白刺參在5～10 lx條件下酶活力最大；在不同光照強(qiáng)度下，3個品系刺參體腔液中SOD活性有所差異，在0 lx光照強(qiáng)度下，白刺參SOD活性顯著高于青刺參(P<0.05)，其他光照強(qiáng)度下3個品系刺參酶活力無顯著性差異(P>0.05)。

3 討論

3.1 光照強(qiáng)度對刺參行為特征的影響

在自然條件下，光照隨季節(jié)及晝夜變化而變化。刺參在長期的進(jìn)化過程中，對光照變化形成了一系列適應(yīng)性特征。在車間、池塘和海區(qū)養(yǎng)殖條件下，研究光照對刺參生長和攝食的影響，找出適合其生長發(fā)育的光照條件，及時提供必要遮光掩體，對于加速刺參生長具有十分重要的意義。

光照能直接或間接影響水生生物的攝食、發(fā)育、生長和生存等[15-16]。目前，國外對刺參的研究主要包括幼參的種群結(jié)構(gòu)、生長、發(fā)育、死亡等[17-19]，國內(nèi)則主要研究了刺參苗種培育、增殖技術(shù)及環(huán)境影響因子溫度、鹽度等[20-21]。其中，Olmsted[22]研究發(fā)現(xiàn), 刺參通過其存在于肉刺和觸手基部的感光點(diǎn)感知光照并做出反應(yīng)。Millot[23]發(fā)現(xiàn), 刺參利用散布于真皮上的感光點(diǎn)來感知光照。Mercier等[24]發(fā)現(xiàn)，糙海參HolothuriascabraJaeger 在發(fā)育至五觸手幼體階段出現(xiàn)避光性, 在較強(qiáng)光照強(qiáng)度下喜歡棲息在底層附著物的陰影下。一些學(xué)者也研究了光照強(qiáng)度及光照周期對刺參的影響，發(fā)現(xiàn)兩者都能直接影響刺參的生長和行為[25]。光也能夠?qū)λ鷦游锏臅円够顒庸?jié)律、遷移和集群行為產(chǎn)生影響。在長期的進(jìn)化過程中, 海參受敵害攻擊時能吐臟逃逸，或在白天躲避于狹小的縫隙內(nèi), 調(diào)整其晝夜節(jié)律以避開捕食者, 用以實(shí)現(xiàn)躲避敵害的目的[26]。張碩等[27]在研究光照強(qiáng)度對刺參的行為影響時發(fā)現(xiàn)，刺參在黑暗或者光照強(qiáng)度低的條件下頻繁活動，基本不在人工礁模型上聚集；而在光照強(qiáng)度較高時，刺參會躲藏在人工礁模型陰影處棲息或附著在礁上。工廠化養(yǎng)殖的刺參無論在車間或者池塘，也出現(xiàn)同樣的行為節(jié)律, 在黑暗或光照強(qiáng)度較低的條件下活動；而在強(qiáng)光下,刺參選擇在附著基下棲息或在附著基內(nèi)覓食。

3.2 光照強(qiáng)度對3個品系刺參生長的影響

研究表明，光照明顯影響刺參的生長。Ramofafia等[28]研究指出，由于光照強(qiáng)度的減弱而引起微藻種類及數(shù)量減少時，會限制刺參的生長；薛素燕等[29]研究表明，強(qiáng)光照(2700～110 00 lx)下刺參生長較快；張鵬等[30]認(rèn)為，光照強(qiáng)度可顯著影響刺參的攝食、消化吸收食物效率，試驗(yàn)利用的不同光源和光照周期差異會影響附著在試驗(yàn)水槽壁的微藻的優(yōu)勢藻種類、生物量及其比例, 從而影響刺參的生長；陳勇等[31]認(rèn)為，在全光照、全黑暗和自然光照條件下，相對于半光照半黑暗組，刺參的活動不頻繁，差異也不大。本試驗(yàn)結(jié)果表明, 3個品系刺參在5～50 lx 下生長速度較快, 強(qiáng)光(200 00 lx)或全黑(0 lx)條件下生長速度顯著減慢(圖1), 在弱光照條件下，刺參活動頻繁，攝食較強(qiáng)光或全黑旺盛。車間養(yǎng)殖刺參定期投喂，不存在光照引起藻類生長變化進(jìn)而影響刺參生長的情況，但在池塘、圍堰及海區(qū)底播增殖刺參，光照對刺參的生長應(yīng)有明顯影響，其不僅影響底棲硅藻的生長，在光照較強(qiáng)的春夏兩季，也會引起大型有害藻類的生長，大型藻類死亡后，藻體腐爛變質(zhì)、水體溶氧減少進(jìn)而威脅刺參生長甚至生存。

3.3 光照強(qiáng)度對3個品系刺參消化酶活性的影響

消化酶是生物體內(nèi)各種生化反應(yīng)的催化劑，主要作用是消化和分解生物體從外界所攝取的食物，為其提供生長、發(fā)育、繁殖等所需的各種營養(yǎng)物質(zhì)。雖然光照并不是影響刺參腸道消化酶活性的第一因素，但其可通過影響刺參攝食進(jìn)而顯著影響消化酶活力。魏子仲等[32]研究了光照強(qiáng)度對不同養(yǎng)殖方式下幼參生長和消化酶的影響，認(rèn)為光照對刺參幼參的消化酶活性影響顯著。本試驗(yàn)表明，蛋白酶活性基本上反映了青、紫刺參特定生長率大小的變化，在25～50 lx光照強(qiáng)度時，這兩個品系刺參蛋白酶活力最高，與這兩種刺參特定生長率最高一致，淀粉酶活性與特定生長率表現(xiàn)不一致，在5～10 lx時酶活力最高，原因可能是餌料中淀粉含量較低，并不是影響青、紫刺參生長的主要因素。而白刺參在5～10 lx時明顯表現(xiàn)出淀粉酶活性較高，與其特定生長率最高表現(xiàn)一致，說明其餌料中淀粉需求較高，這也為工廠化養(yǎng)殖白刺參的餌料配方提供了新的思路。

3.4 光照強(qiáng)度對3個品系刺參免疫酶活性的影響

3.5 刺參體色變化的探討

薛素燕等[29]研究認(rèn)為，在弱光照條件下，刺參在試驗(yàn)結(jié)束后體色加深，其他光照組刺參體色變淺，并認(rèn)為刺參體色的深淺與生活環(huán)境相關(guān)，體色深的刺參生活在光照強(qiáng)度較低的深水區(qū)，對較強(qiáng)的光照強(qiáng)度敏感，而體色淺的刺參生活在光照強(qiáng)度較高的淺水區(qū)，可耐受較強(qiáng)的光照強(qiáng)度；張碩等[27]研究認(rèn)為，體色淺的刺參可以耐受較強(qiáng)的光照強(qiáng)度，而體色深的刺參遇到強(qiáng)光的照射會迅速避開。本試驗(yàn)中利用色度計(jì)比色發(fā)現(xiàn)，在較低光強(qiáng)下，試驗(yàn)組刺參體色在試驗(yàn)前后基本保持不變，在強(qiáng)光照條件下，紫刺參體色變淡(體色向普通刺參靠近)，白刺參體色變深(略顯淡黃、淡綠色)。通過對刺參體色變化跟蹤測定表明，本試驗(yàn)條件下，白刺參、紫刺參在光照強(qiáng)度高的試驗(yàn)組中體色變化大于光照強(qiáng)度低的試驗(yàn)組。在自然海域及池塘養(yǎng)殖環(huán)境下，由于一年四季有強(qiáng)烈的光照，觀察到隨著時間及刺參年齡推移，部分紫刺參、白刺參體色向青刺參靠近，這也是自然環(huán)境中白刺參、紫刺參稀少的一個原因。在工廠化養(yǎng)殖系統(tǒng)中，車間養(yǎng)殖在光照強(qiáng)度方面控制較好，青刺參、紫刺參體色變化不大，白刺參體色對光照更為敏感。

4 結(jié)論

本研究團(tuán)隊(duì)已經(jīng)初步建立了白刺參、青刺參及紫刺參種質(zhì)資源庫，并探索出了一套穩(wěn)健的3個品系刺參種參培育和苗種繁育技術(shù)方法，并在此基礎(chǔ)上，進(jìn)行了模擬海區(qū)、池塘和車間條件下光照對3個品系刺參生長影響試驗(yàn)，結(jié)果顯示，光照強(qiáng)度能夠顯著影響刺參生長，強(qiáng)光或全黑暗均不利于刺參生長，青刺參及紫刺參最適宜光照強(qiáng)度為25～50 lx，白刺參最適宜光照強(qiáng)度為5～10 lx。下一階段的工作中將積極進(jìn)行3個品系刺參基礎(chǔ)生物學(xué)及其體成分的研究，為刺參良種培育提供參考數(shù)據(jù)。