龔輝，程薇，毛紅霞

(南昌大學(xué)第四附屬醫(yī)院感染性疾病科，南昌 330003)

肝細(xì)胞肝癌 (hepatocellular carcinoma,HCC)(以下簡稱肝癌)是威脅人類生命的惡性腫瘤，死亡率很高，我國肝癌發(fā)病率居世界之首，肝癌是我國第2位癌癥殺手[1]。腫瘤的一大特點(diǎn)是伴有癌基因活化和抑癌基因失活的細(xì)胞周期紊亂。而p21是細(xì)胞周期抑制蛋白，可以通過抑制細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶(cyclin-dependent kinase,CDK)的活性來控制細(xì)胞由G期進(jìn)入S期 抑制增殖細(xì)胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen，PCNA)的活性，從而抑制DNA的合成，使細(xì)胞停止分化，出現(xiàn)凋亡[2]。本試驗(yàn)組將p21基因通過逆轉(zhuǎn)錄病毒載體導(dǎo)入肝癌Hep3B細(xì)胞，轉(zhuǎn)染肝癌Hep3B細(xì)胞,并觀察其對(duì)肝癌細(xì)胞生物活性的影響。

l 材料和方法

1.1 細(xì)胞及試劑 PA317系包裝細(xì)胞及肝癌Hep3B系細(xì)胞由分子實(shí)驗(yàn)室保存，MMLV-p21質(zhì)粒由本課題組構(gòu)建。1640細(xì)胞培養(yǎng)基、脂質(zhì)體為Gibco BRI公司產(chǎn)品，胎牛血清為杭州四季青公司產(chǎn)品，MTT、G4l8、多聚賴氨酸、聚凝胺為 Sigma 公司產(chǎn)品，各種限制性核酸內(nèi)切酶、聚合酶購自Promega公司，RNA抽提試劑盒為TianGEN公司產(chǎn)品。

1.2 逆轉(zhuǎn)錄病毒的包裝、收集及轉(zhuǎn)染 使用脂質(zhì)體按照操作說明進(jìn)行轉(zhuǎn)染，將PA317細(xì)胞接種于多聚賴氨酸處理后的培養(yǎng)瓶中，在脂質(zhì)體的介導(dǎo)下將MMLV-P21轉(zhuǎn)入PA317細(xì)胞，48h后加入 G4l8(500μg/mL)選擇培養(yǎng)，3d后換為不含G418的普通培養(yǎng)液培養(yǎng)，此后每2d換液1次，14d后出現(xiàn)PA317篩選克隆，大量培養(yǎng)PA3I7／p21細(xì)胞，收集的細(xì)胞上清液用0.45μm濾器過濾，去除雜質(zhì)。取其上清液測算病毒滴度，以克隆形成單位(CFU)/ml來表示。用含病毒上清在Polybrene條件下轉(zhuǎn)染Hep3B細(xì)胞，再用G418篩選14d，獲得穩(wěn)定陽性轉(zhuǎn)染Hep3B-p21細(xì)胞株。

1.3 實(shí)驗(yàn)步驟

1.3.1 陽性轉(zhuǎn)染Hep3B-P21細(xì)胞的鑒定 應(yīng)用RT-PCR鑒定Hep3B-P21細(xì)胞中p21的表達(dá)情況:用RNA抽提試劑盒提取病毒轉(zhuǎn)染后Hep3B-P21細(xì)胞RNA，以O(shè)ligo dT為引物進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，并取0.5μg逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物對(duì)p21進(jìn)行PCR反應(yīng)，擴(kuò)增片段長度預(yù)期為561bp。

1.3.2 流式細(xì)胞儀進(jìn)行細(xì)胞周期分析(重復(fù)3次)用胰酶消化收集上述各組轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞，應(yīng)用FACSCalibar流式細(xì)胞儀(Beckton Dickinson,USA)分析，氬離子激光器激發(fā)波長為488 nm，在流式細(xì)胞儀上進(jìn)行細(xì)胞周期分析，得出細(xì)胞各周期的百分率。

1.3.3 MTT法 在96孔板中進(jìn)行3組細(xì)胞的轉(zhuǎn)染，每組6孔，每孔1×103個(gè)細(xì)胞，對(duì)照組只加培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)40 h，每孔加入5 mg/mL MTT 10 μl，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄上清，加入100μl DMSO，振蕩10 min，酶標(biāo)儀(Labststems,芬蘭)測定492 nm處各孔吸光度(A)值，取每孔平均值。計(jì)算細(xì)胞抑制率，細(xì)胞抑制率=(1-A實(shí)驗(yàn)組／A對(duì)照組)×100%。

2 結(jié)果

2.1 目的基因的整和及鑒定 提取轉(zhuǎn)染有p21的Hep3B-P21細(xì)胞RNA，經(jīng)RT-PCR反應(yīng)擴(kuò)增，產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳，560bp處有一陽性條帶，說明目的基因已整合入Hep3B細(xì)胞且穩(wěn)定表達(dá)。

2.2 p21重組病毒對(duì)Hep3B細(xì)胞周期的影響Hep3B-p21重組病毒轉(zhuǎn)染細(xì)胞組G1期與兩對(duì)照組G1期明顯增多，S期(23.58±1.91)與兩對(duì)照組S期[(36.34±3.15)，(38.44±2.76)]明顯減少，差異都有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；Hep3B-MMLV空載病毒轉(zhuǎn)染細(xì)胞組與Hep3B細(xì)胞組S期無明顯差異(P>0.05)。因此Hep3B-p21重組病毒轉(zhuǎn)染細(xì)胞進(jìn)入S期出現(xiàn)障礙，停滯在G1期的細(xì)胞增多，抑制肝癌細(xì)胞的增殖，促進(jìn)其凋亡。

2.3 MTT分析 SPSS11.5數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)處理顯示Hep3B細(xì)胞組吸光度平均值為 0.403，Hep3BMMLV細(xì)胞組吸光度平均值為0.411，Hep3B-p21細(xì)胞組吸光度平均值為0.216。Hep3B-p21細(xì)胞組相對(duì)于Hep3B細(xì)胞組抑制率為(44.10±1.87)%(P<0.05)；Hep3B-MMLV細(xì)胞組相對(duì)于Hep3B細(xì)胞組無明顯差別。這說明p21基因降低了Hep3B細(xì)胞代謝，抑制了Hep3B細(xì)胞的增殖。

3 討論

肝細(xì)胞癌是世界范圍內(nèi)最常見、惡性度最高的腫瘤之一，在中國其發(fā)病率已占據(jù)第二位，臨床治療效果差。在我國普遍認(rèn)為肝癌與乙肝病毒感染密切相關(guān)。近年來應(yīng)用抑癌基因p53來治療腫瘤成為基因治療的熱點(diǎn)，其對(duì)肺癌等腫瘤的治療效果較好，而對(duì)肝癌效果欠佳。究其原因，可能與乙肝病毒X蛋白(hepatitis B virus X protein，HBX)導(dǎo)致p53基因易位(translocation)有關(guān)[3]。

p21是el-Deiry于1993年發(fā)現(xiàn)的一種能夠被P53轉(zhuǎn)錄激活的基因.他位于染色體6p21.2，由164個(gè)氨基酸組成，編碼一種相對(duì)分子質(zhì)量為21 kDa的蛋白，因此命名為p21[4]?，F(xiàn)已明確p21基因?yàn)橐吧蚿53的靶基因，是細(xì)胞周期素依賴激酶抑制劑(CKI)家族成員，當(dāng)他與CDK及PCNA結(jié)合，可導(dǎo)致細(xì)胞周期阻滯,發(fā)揮抗細(xì)胞增殖活性，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，達(dá)到抗腫瘤的目的。p21基因啟動(dòng)因子上有野生型p53基因的結(jié)合位點(diǎn)，受p53的調(diào)控，且是p53介導(dǎo)的細(xì)胞周期停止所必須基因。有研究發(fā)現(xiàn)敲除p21cip/WAF后，明顯降低清除受到長期輻射傷害的間質(zhì)分化組織的功能及間質(zhì)干細(xì)胞的分化功能[5]。通常認(rèn)為p21蛋白是一種固有無序蛋白(intrinsically disordered proteins)，缺乏穩(wěn)定的三維空間結(jié)構(gòu)。還有報(bào)道：盡管N-terminal p21比全長p21基因抑制細(xì)胞增殖較差，但C-terminal p21則完全無效[6]。但最近發(fā)現(xiàn)其不穩(wěn)定空間結(jié)構(gòu)是為了更好的實(shí)現(xiàn)其功能：p21蛋白的螺旋亞結(jié)構(gòu)域LH可發(fā)生結(jié)構(gòu)變化，LH的結(jié)構(gòu)可變性確保了在與Cdk–cyclin復(fù)合物結(jié)合時(shí)，p21的另外兩個(gè)亞結(jié)構(gòu)域D1和D2能夠分別特異性結(jié)合在cyclin和 Cdk亞基保守區(qū)域[7]。

p21基因具高度的保守性,在腫瘤發(fā)生中極少突變,僅有少量多態(tài)性的存在[8]。當(dāng)乙肝X蛋白使得p53失活，會(huì)導(dǎo)致其表達(dá)量下降或不表達(dá),使其功能無法正常發(fā)揮;，從而導(dǎo)致腫瘤的形成，我們把野生型p21通過逆轉(zhuǎn)錄病毒導(dǎo)入表達(dá)乙肝病毒的肝細(xì)胞癌HepG2細(xì)胞株中，觀察其對(duì)肝細(xì)胞癌的影響。逆轉(zhuǎn)錄病毒是介導(dǎo)基因治療最為有效的載體[9]，原因在于病毒基因組結(jié)構(gòu)簡單，分子背景較清楚，易于操作和改造，轉(zhuǎn)染率高，又有一定的靶細(xì)胞特異性，為基因療法提供了有效的基因轉(zhuǎn)移途徑。目前應(yīng)用最廣泛的是逆轉(zhuǎn)錄病毒載體(DWv5Ns)，已達(dá)I期臨床研究階段。由逆轉(zhuǎn)錄病毒介導(dǎo)的抑癌基因p21轉(zhuǎn)染肝癌細(xì)胞后，可直接進(jìn)入細(xì)胞核中，使得細(xì)胞周期停滯，受損基因得到修復(fù)或細(xì)胞凋亡。而p21蛋白在大多數(shù)細(xì)胞中是極不穩(wěn)定的，它的半衰期只有20-60min，導(dǎo)入外源性p21并不有特別影響，腫瘤細(xì)胞中線粒體較正常細(xì)胞明顯減少，其清除p21蛋白也較弱，p21基因能發(fā)揮促其凋亡的功能。

本研究顯示野生p21基因阻止Hep3B系細(xì)胞進(jìn)入S期，停滯在G1期，Hep3B-p21組細(xì)胞增殖比兩對(duì)照組明顯受到抑制 (P<0.05)，為臨床應(yīng)用p21蛋白治療肝癌提供理論參考依據(jù)。

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