吳業(yè)穎+張國(guó)彬

摘 要：根據(jù)鯉春病毒血癥病毒（spring viraemia of carp virus，SVCV）核蛋白N編碼基因的序列設(shè)計(jì)特異引物，以病毒全基因組RNA為模板，通過對(duì)反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化，成功建立了SVCV的逆轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（RT-LAMP）檢測(cè)方法。結(jié)果表明，本方法可在64℃下1h內(nèi)實(shí)現(xiàn)目標(biāo)核酸區(qū)段的大量擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)凝膠電泳呈現(xiàn)梯形條帶，反應(yīng)體系中添加SYBR Green I熒光染料后，綠色陽性結(jié)果明顯區(qū)別于橙色陰性結(jié)果。該檢測(cè)體系具有極高的特異性，只能檢測(cè)到目標(biāo)病毒，與草魚呼腸孤病毒（GCRV）和斑點(diǎn)叉尾鮰呼腸孤病毒（CCRV）無交叉反應(yīng)，其靈敏度比RT-PCR高100倍。本研究建立的檢測(cè)方法靈敏度及特異性高，且不需要昂貴儀器設(shè)備，為快速檢測(cè)鯉春病毒血癥病毒與診斷鯉春病毒血癥提供了簡(jiǎn)捷快速的技術(shù)手段。

關(guān)鍵詞：鯉春病毒血癥病毒；逆轉(zhuǎn)錄；環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增；檢測(cè)

中圖分類號(hào)：S941 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

鯉春病毒血癥（spring viraemia of carp，SVC）是一種在鯉科魚類中發(fā)生的出血性、高傳染性病毒病，能感染四大家魚和其他幾種鯉科魚類，經(jīng)常在鯉科魚類特別是鯉、錦鯉中流行，并導(dǎo)致患病魚大量死亡，危害嚴(yán)重。該病的病原菌為鯉春病毒血癥病毒（spring viraemia of carp virus，SVCV），又名鯉魚彈狀病毒（Rhabdovirus carpio），屬于彈狀病毒科水泡性口炎病毒屬成員。歷史上，該病主要流行于歐洲、中東地區(qū)和俄國(guó)，自2002年美國(guó)和2003年中國(guó)分離到該病毒的報(bào)道以來，引起了研究者及水產(chǎn)養(yǎng)殖者的廣泛關(guān)注。由于該病發(fā)病快、危害大，因此快速、特異、敏感、簡(jiǎn)便的檢測(cè)SVCV對(duì)鯉春病毒血癥防控具有重要的意義。

目前國(guó)內(nèi)外學(xué)者已建立了多種檢測(cè)SVCV的方法，其中中和試驗(yàn)、免疫熒光（IF）、酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）等免疫學(xué)方法的特異性有待提高，而RT-PCR、實(shí)時(shí)熒光定量PCR等分子生物學(xué)方法雖然特異性強(qiáng)，靈敏度高，但由于需要PCR儀等貴重儀器而不適于其在基層的廣泛應(yīng)用。

2000年Notomi等首次提出了環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（Loop-ediated isothermal amplification，LAMP）技術(shù)，該技術(shù)主要針對(duì)靶基因的6個(gè)區(qū)域設(shè)計(jì)2對(duì)LAMP引物，利用一種具有鏈置換活性和瀑布式核酸擴(kuò)增功能的DNA聚合酶（Bst DNA聚合酶），在恒溫條件下快速、高效、高特異、高靈敏地?cái)U(kuò)增靶序列，不需要模板的熱變性、長(zhǎng)時(shí)間溫度循環(huán)、繁瑣的電泳、紫外觀察等過程。逆轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增（RT-LAMP）是在常規(guī)LAMP反應(yīng)體系中加逆轉(zhuǎn)錄酶，實(shí)現(xiàn)了RNA模板的一步擴(kuò)增。近年來，國(guó)內(nèi)外已將該技術(shù)廣泛應(yīng)用于動(dòng)物醫(yī)學(xué)、人類醫(yī)學(xué)及食品衛(wèi)生等領(lǐng)域，并逐漸成為水產(chǎn)動(dòng)物病原的主要檢測(cè)方法之一。

本文針對(duì)SVCV含量最豐富的病毒粒子蛋白-核蛋白N，建立了鯉魚春季病毒血癥病毒的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增快速檢測(cè)方法，并對(duì)反應(yīng)溫度、時(shí)間等參數(shù)進(jìn)行了優(yōu)化，旨在為基層實(shí)驗(yàn)檢測(cè)鯉魚春季病毒血癥病毒提供無需特殊儀器，更為簡(jiǎn)單、便捷、快速、準(zhǔn)確的檢測(cè)方法。

1 材料與方法

1.1 主要儀器與試劑

超速離心機(jī)（Beckman）；分光光度計(jì)（Eppendorf）；PCR擴(kuò)增儀（Biometra）；電泳儀；凝膠成像儀（Bio-Rad）；Bst DNA聚合酶（New England）；Betaine（Sigma）；Trizol Reagent、RNA酶抑制劑、SYBR Green I（Invitrogen）；dNTP、AMV逆轉(zhuǎn)錄酶（Bio basic inc.）。

1.2 細(xì)胞與病毒

草魚腎臟組織細(xì)胞系（CIK）、斑點(diǎn)叉尾鮰腎組織細(xì)胞系（CCK）、草魚呼腸孤病毒GCRV-104株、斑點(diǎn)叉尾鮰呼腸孤病毒730株（CCRV）、鯉春病毒血癥病毒（SVCV）、鯉上皮瘤細(xì)胞（EPC）來自長(zhǎng)江水產(chǎn)研究所。GCRV在CIK細(xì)胞上增殖培養(yǎng)，CCRV在CCK細(xì)胞上增殖培養(yǎng)， SVCV在EPC細(xì)胞上增殖培養(yǎng)。

1.3 RT-LAMP引物的設(shè)計(jì)及合成

根據(jù)GenBank公布的SVCV毒株的N基因序列（U18101），應(yīng)用PrimerExplorer V4（http：// primerexplorer.jp/e/v4-manual/index.html）在線軟件設(shè)計(jì)1組RT-Lamp引物，委托天一輝遠(yuǎn)生物科技有限公司合成（見表1）。1.4 病毒RNA提取

待SVCV感染的EPC細(xì)胞、CCRV感染的CCK細(xì)胞、GCRV感染的CIK細(xì)胞出現(xiàn)90%病變后收獲，同時(shí)收獲正常的EPC細(xì)胞對(duì)照，于-80℃至室溫反復(fù)凍融3次，5000r/min，4℃離心30 min，取沉淀，經(jīng)Trizol試劑裂解后，采用氯仿、異丙醇抽提病毒RNA，分光光度計(jì)（Eppendorf biophotometer）測(cè)定RNA濃度。

1.5 SVCV陽性模板的確認(rèn)

將上述RNA作為模板，進(jìn)行RT-PCR檢測(cè)，確認(rèn)制備的檢測(cè)模板呈SVCV陽性后，進(jìn)行RT-LAMP檢測(cè)方法的建立。

1.6 RT-LAMP反應(yīng)體系的建立及優(yōu)化

采用25μl反應(yīng)體系，包括：內(nèi)引物FIP和BIP各0.8μM，外引物F3和B3各0.1μM，dNTPs1mM，Betaine0.5M，DTT4mM，MgCl2，Bst DNA聚合酶8U，AMV逆轉(zhuǎn)錄酶5U，模板RNA5μl，1×ThermoPol Reaction Buffer混勻后于不同溫度（60、61、62、63、64、65℃）溫育60 min，80℃滅活2min。確定最佳溫育溫度后，再優(yōu)化反應(yīng)體系中MgCl2濃度（0、2、4、6、8mM）。

1.7 RT-LAMP擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測(cè)

取5μl擴(kuò)增產(chǎn)物，用2%的瓊脂糖凝膠，150V電泳25min后，置于凝膠成像系統(tǒng)中觀察。

1.8 RT-LAMP的特異性試驗(yàn)

檢測(cè)GCRV-104株感染CIK細(xì)胞后的總RNA、SVCV感染EPC細(xì)胞后的總RNA、CCRV感染CCK細(xì)胞后的總RNA，同時(shí)設(shè)立無模板的空白對(duì)照和正常EPC細(xì)胞的總RNA陰性對(duì)照。

1.9 RT-LAMP的靈敏度試驗(yàn)

將提取的SVCV總RNA測(cè)其濃度，按10倍梯度稀釋該RNA作為模板，采用優(yōu)化好的RT-LAMP反應(yīng)體系進(jìn)行擴(kuò)展，同時(shí)以RT-PCR方法進(jìn)行比較。

2 結(jié)果

2.1 SVCV的RT-LAMP檢測(cè)方法條件優(yōu)化

經(jīng)試驗(yàn)優(yōu)化，確定最佳反應(yīng)體系如下：內(nèi)引物FIP和BIP各0.8μM，外引物F3和B3各0.1μM，dNTPs 1mM，Betaine 0.5M，DTT 4mM，MgCl2 6mM，Bst DNA聚合酶8U，AMV逆轉(zhuǎn)錄酶5U，模板RNA 5μl，1×ThermoPol Reaction Buffer。反應(yīng)管于64℃溫育1h后，80℃滅活2分鐘。

2.2 RT-LAMP的特異性試驗(yàn)

用本實(shí)驗(yàn)建立的RT-LAMP（見圖3）方法進(jìn)行檢測(cè)，只有SVCV出現(xiàn)典型的梯形擴(kuò)增條帶，而對(duì)照GCRV-104、CCRV和EPC均無擴(kuò)增條帶，說明設(shè)計(jì)的RT-LAMP引物具有良好的特異性。

2.3 RT-LAMP和RT-PCR的靈敏度檢測(cè)

將10倍系列稀釋的模板分別進(jìn)行RT-LAMP、RT-PCR檢測(cè)，結(jié)果顯示至少能夠檢測(cè)到10-5稀釋度的模板RNA（圖4），而RT-PCR只能檢測(cè)到10-3稀釋度的模板RNA（圖5），說明RT-LAMP檢測(cè)具有很高的靈敏度。

3 討論

SVCV主要由核蛋白（N）、聚合酶（L）、磷蛋白（P）、基質(zhì)蛋白（M）和糖蛋白（G）組成。其中核蛋白N是含量最豐富的病毒粒子蛋白，它與病毒RNA 相互作用形成核衣殼的雙螺旋結(jié)構(gòu)，在轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)中起著重要的作用。Shivappa等和Liu等分別針對(duì)SVCV的G基因和M基因建立了病毒的LAMP檢測(cè)方法。本研究針對(duì)SVCV N蛋白基因序列設(shè)計(jì)引物，為SVCV的檢測(cè)提供新的靶基因。

本研究建立了1種對(duì)SVCV的LAMP快速檢測(cè)方法。根據(jù)目的基因序列設(shè)計(jì)引物，合適的引物對(duì)LAMP反應(yīng)的成功至關(guān)重要，特異性的區(qū)域保證了反應(yīng)的特異性，引物的正確結(jié)構(gòu)保證了莖環(huán)結(jié)構(gòu)DNA的形成和延伸。通過對(duì)反應(yīng)溫度和鎂離子濃度兩個(gè)重要參數(shù)的優(yōu)化，提高了反應(yīng)靈敏度。本研究建立的反應(yīng)體系在64℃恒溫保持1h即可完成擴(kuò)增，不需要昂貴的PCR儀，且反應(yīng)時(shí)間比普通RT-PCR節(jié)省2～3h。反應(yīng)后加入熒光染料SYBR Green I即可肉眼觀察結(jié)果，檢測(cè)靈敏度是RT-PCR方法的100倍。而且與GCRV-104、CCRV等病毒都沒有交叉反應(yīng)，表明設(shè)計(jì)的引物特異性好，能夠滿足檢測(cè)需求。該方法簡(jiǎn)便快速、靈敏特異，可應(yīng)用于鯉春病毒血癥的現(xiàn)場(chǎng)應(yīng)急診斷與檢測(cè)，可為鯉春病毒血癥的有效防控提供有力的技術(shù)支撐。

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（本文審稿 戴定蘭）