曠焱平， 陳 墾△， 何博華， 王林靜， 祝愛珍， 劉成成， 劉革修

(廣東藥學(xué)院1護理學(xué)院，2臨床學(xué)院，3公共衛(wèi)生學(xué)院，廣東 廣州510006;4暨南大學(xué)醫(yī)學(xué)院血液學(xué)研究所，廣東 廣州510632)

姜黃素是活血藥中藥姜黃的主要成分，屬于天 然酚類抗氧化劑，其抗腫瘤作用日益引起人們的重視，已成為腫瘤預(yù)防和治療的一個研究熱點，美國國立腫瘤研究所已將其列為第3 代癌化學(xué)預(yù)防藥。姜黃素通過誘導(dǎo)細胞凋亡達到抗腫瘤作用已被不少文獻報道［1－2］。而且陳瑞川等［3］首次發(fā)現(xiàn)姜黃素在光照條件下可降低姜黃素誘導(dǎo)人胃腺癌MGC－803 細胞凋亡所需要的濃度，即15 W、光距20 cm 的日光燈照射下有促進姜黃素誘導(dǎo)細胞凋亡的效應(yīng)，但是沒有研究其機制。本研究以人胃腺癌MGC－803 細胞為研究對象，探討了激光照射姜黃素(光敏化)誘導(dǎo)細胞凋亡及其機制。

材 料 和 方 法

1 材料

1.1 材料 人胃腺癌MGC－803 細胞株(中山大學(xué)動物實驗中心提供)，姜黃素(Sigma)，小牛血清和RPMI－1640 培養(yǎng)液(華美公司)。

1.2 細胞培養(yǎng)及藥物處理 人胃腺癌MGC－803細胞于含10%小牛血清、1 ×105U/L 青霉素及100 mg/L 鏈霉素的RPMI－1640 培養(yǎng)液、5%CO2、37 ℃培養(yǎng)傳代。細胞按(1 ～2)×108/L 接種，37 ℃培養(yǎng)24 h 后按實驗要求加入一定濃度的姜黃素，對照組加同量的溶劑，繼續(xù)培養(yǎng)24 h 后即收集細胞。姜黃素0.1842 g 先用100 μL 二甲基亞砜(DMSO)溶解后，用無水乙醇定容至50 mL，即為10 mmol/L 姜黃素母液，分裝0.5 mL/管，－20 ℃避光凍存。應(yīng)用時以細胞培養(yǎng)液稀釋至所需濃度。

2 方法

2.1 姜黃素吸收光譜測定 配成濃度為1、2、3、4、5、6、7、8、9、10 μmol/L 姜黃素溶液，用Lambda 35 紫外/可見分光光度計(Perkin－Elmer)測定姜黃素吸收光譜(波長范圍200 ～1 100 nm)，反復(fù)測定10 個樣本各10 次，統(tǒng)計、擬合光譜曲線，確定光譜峰值所在波長(即可活化姜黃素，發(fā)揮其光敏活性的最佳波長)為本實驗照射所用激光的波長。

2.2 MTT 法測定姜黃素對細胞生長的抑制作用

取對數(shù)生長期MGC－803 細胞，調(diào)整密度為2 ×108/L，每孔100 μL，姜黃素濃度為1、5、10、15、20 μmol/L，設(shè)3 個復(fù)孔，同時設(shè)DMSO 對照孔和不加細胞的調(diào)零孔，5% CO2、飽和濕度、37 ℃孵育72 h，加入MTT 試劑孵育3 h 后在全自動酶標(biāo)儀上檢測各孔的吸光度值(測量波長490 nm)。癌細胞生長抑制率(%)= (1－實驗組平均吸光度值/空白組平均吸光度值)×100%。根據(jù)實驗結(jié)果數(shù)據(jù)計算得IC50=10.9 μmol/L，以此確定后續(xù)實驗姜黃素濃度為5 μmol/L。

2.3 光敏化促進姜黃素對癌細胞的作用觀察 實驗分組:空白組、單純姜黃素組、單純激光照射(pure light)組和姜黃素+激光照射(光動力學(xué)治療，photodynamic therapy，PDT)組。單純光照組和姜黃素+PDT 組都采用功率和波長都連續(xù)可調(diào)的全固態(tài)連續(xù)鈦寶石激光器(COHERENT，model:899－05)照射。單純姜黃素組為5 μmol/L 姜黃素。姜黃素+ PDT組為5 μmol/L 姜黃素和用可發(fā)揮姜黃素光敏活性的波長的激光照射(波長為405 nm 藍光，照射時間為15 min，照射劑量為40 J/cm2)。空白組和單純姜黃素組則不用上述波長的激光照射。

2.4 Annexin V－PI 雙染測定細胞凋亡 取對數(shù)生長的MGC－803 細胞，每孔2.5 ×105個細胞接種至6 孔板內(nèi)，37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h 后分組并進行相關(guān)處理，繼續(xù)培養(yǎng)48 h 后用不含EDTA 的胰酶消化收集細胞，加入200 μL 試劑盒提供的結(jié)合緩沖液，重懸細胞后，加入5 μL Annexin－Ⅴ和10μL PI 染料后充分混勻，避光反應(yīng)15 min 后進行流式細胞儀檢測。含有“亞二倍體”DNA 的細胞被認為是凋亡細胞，并測凋亡細胞比率。其結(jié)果用ModFitLT for Mac 3.0 軟件分析。

2.5 Hoechst 33258 熒光染色觀察細胞核形態(tài) 將MGC－803 細胞接種于含蓋玻片的培養(yǎng)板中進行細胞爬片，70%匯合時，分組進行藥物處理，48 h 后棄培養(yǎng)液，PBS 清洗2 遍，加入0.5 mL/well 4%多聚甲醛固定液固定20 min，PBS 清洗2 遍，加入Hoechst 33258 染色液染色20 min，PBS 洗2 遍，每次5 min，自然干燥后用中性甘油封片. 熒光顯微鏡下觀察細胞核形態(tài)并拍照。

2.6 流式細胞儀檢測線粒體膜電位、活性氧和細胞內(nèi)Ca2+取對數(shù)生長期細胞，以每孔5 ×104個細胞接種至12 孔板，貼壁培養(yǎng)12 h 后進行處理，之后6 h、12 h、24 h 時收集細胞，PBS 洗滌2 遍。500 μL JC－1(10 mg/L)重懸細胞檢測線粒體膜電位，500 μL DCFH－DA (5 μmol/L)重懸細胞檢測細胞產(chǎn)生的活性氧，10 μmol/L 熒光染料Fluo－3AM 檢測細胞內(nèi)Ca2+濃度，37 ℃避光孵育20 min，PBS 洗3 次，即刻用流式細胞儀檢測線粒體膜電位、活性氧和細胞內(nèi)Ca2+。

2.7 比色法檢測caspase－3、caspase－8 和caspase－9 酶活性 取對數(shù)生長期細胞，以每孔5 ×104個細胞的密度接種至12 孔板，貼壁培養(yǎng)12 h 后進行處理，之后6、12、24 h，按照試劑盒說明收集細胞，預(yù)冷PBS 洗滌后重懸于細胞裂解液中，冰上裂解30 min，4 ℃、10 000 × g 離心10min，取上清加入顯色底物(caspase－3 底物Ac－DEVD－pNA、caspase－8 底物Ac－IETD－pNA 和caspase－9 底物Ac－LEHD－pNA)，終濃度50 μL/L，均勻混合并加入到96 孔板中，每組5 個復(fù)孔，避光孵育4 h，酶標(biāo)儀在波長405 nm 處檢測A 值。

2.8 Western blotting 檢測細胞色素C、Bcl－2、Bax和熱休克蛋白70(heat－shock protein 70，HSP70)表達水平 取對數(shù)生長期細胞，貼壁培養(yǎng)12 h 后進行處理，之后48 h 時收集細胞PBS 洗2 遍，加入蛋白抽提液抽提總蛋白;細胞色素C 測定是按試劑盒抽提胞漿及線粒體蛋白。取蛋白50 μg，經(jīng)10% SDS－PAGE 電泳分離，常規(guī)轉(zhuǎn)移至PVDF 膜，5%脫脂奶粉37 ℃封閉2 h，Ⅰ抗4 ℃孵育過夜，以β－actin 作內(nèi)參照，1∶5 000 稀釋的HRP 標(biāo)記的Ⅱ抗室溫孵育1 h，化學(xué)發(fā)光法分析蛋白表達。

3 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 15.0 for Windows 統(tǒng)計學(xué)軟件進行統(tǒng)計。率的比較采用χ2檢驗，計量資料采用t 檢驗或單因素方差分析，用LSD 法對需要比較的組間均值進行兩兩比較。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，以P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 姜黃素吸收光譜

姜黃素吸收波長在360 ～480 nm 范圍內(nèi)，提示姜黃素在此波長范圍中有明顯的PDT 作用。

2 光敏化姜黃素對人胃腺癌MGC－803 細胞增殖的影響

單純光照對MGC－803 細胞增殖沒有明顯抑制作用，單純5μmol/L 姜黃素對MGC－803 細胞增殖則顯示明顯抑制作用，細胞抑制率為(29.74 ±2.30)%;光敏化則可以進一步增強姜黃素對MGC－803 細胞增殖的抑制作用，細胞抑制率為(44.93 ±3.61)%。單純姜黃素組與空白組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P ＜0.01);姜黃素PDT 組與單純姜黃素組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P ＜0.01)，見表1。

3 光敏化促進姜黃素誘導(dǎo)人胃腺癌MGC－803 細胞凋亡

由圖1 和表2 可知，單純光照對MGC－803 細胞生長及其凋亡沒有明顯作用;單純5 μmol/L 姜黃素能夠影響MGC－803 細胞的周期分布，誘導(dǎo)MGC－803 細胞凋亡:G0/G1期細胞明顯增多，G2/M 期細胞下降，并且出現(xiàn)明顯亞G1二倍體峰，其細胞凋亡率為(12.54 ±1.75)%;光敏化則可以進一步增強姜黃素誘導(dǎo)MGC－803 細胞凋亡，其細胞凋亡率為(26.58 ±2.67)%。單純姜黃素組與空白組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P ＜0.01);姜黃素PDT 組與單純姜黃素組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P ＜0.01)。

表1 光敏化姜黃素對人胃腺癌MGC－803 細胞增殖的影響Table 1. Effects of photoactivated curcumin on proliferation of human gastric cancer MGC－803 cells (%. ±s.n =10)

表1 光敏化姜黃素對人胃腺癌MGC－803 細胞增殖的影響Table 1. Effects of photoactivated curcumin on proliferation of human gastric cancer MGC－803 cells (%. ±s.n =10)

＊＊P ＜0.01 vs control group;△△P ＜0.01 vs curcumin group.PDT:photodynamic therapy.

Croup Inhibitory rate Control 2.85 ±0.87 Pure light 3.38 ±0.94 Curcumin 29.74 ±2.30＊＊Curcumin+PDT 44.93 ±3.61△△

Figure 1. Photoactivation promoted curcumin to induce the apoptosis of human gastric cancer MGC－803 cells(flow cytometry).A:control group;B:pure light group;C:curcumin group;D:curcumin+PDT (photodynamic therapy)group.圖1 光敏化促進姜黃素誘導(dǎo)人胃癌MGC－803 細胞凋亡

表2 光敏化姜黃素對人胃腺癌MGC－803 細胞細胞周期和凋亡的影響Table 2. Effects of photoactivated curcumin on cell cycle and apoptosis of human gastric cancer MGC－803 cells(%. ±s.n=10)

表2 光敏化姜黃素對人胃腺癌MGC－803 細胞細胞周期和凋亡的影響Table 2. Effects of photoactivated curcumin on cell cycle and apoptosis of human gastric cancer MGC－803 cells(%. ±s.n=10)

＊＊P ＜0.01 vs control group;△△P ＜0.01 vs curcumin group.

Group G0/G1 S G2/M Apoptotic rate Control 39.65±4.97 26.92±3.74 33.43±3.95 3.34±0.55 Pure light 38.74±4.95 25.54±3.60 35.72±3.86 2.85±0.48 Curcumin 58.53±5.23 21.41±3.17 20.06±3.84 12.54±1.75＊＊Curcumin+PDT 64.70±5.67 19.71±3.20 15.59±3.02 26.58±2.67△△

Hoechst 33258 染色顯示，空白組、單純光照組基本沒有明顯的形態(tài)學(xué)變化，姜黃素作用48 h 后，在光學(xué)顯微鏡下可見部分人胃腺癌MGC－803 細胞胞體收縮、核濃縮，呈現(xiàn)特異性紫藍色，即判斷為凋亡細胞。姜黃素PDT 組可見明顯的細胞核形態(tài)改變，表現(xiàn)為染色質(zhì)凝集，并有染色質(zhì)的凋亡小體形成，此外也可見到核邊緣模糊，核區(qū)形態(tài)不規(guī)則，熒光微弱且不均勻的壞死細胞，見圖2。

4 姜黃素及其光敏化對MGC－803 細胞線粒體膜電位、活性氧和細胞內(nèi)Ca2+的影響

單純姜黃素作用于MGC－803 細胞，線粒體膜電位在6 h 時已顯著下降，24 h 時下降至最低;細胞內(nèi)活性氧在6 h 時也顯著升高，24 h 時仍然維持高水平;細胞內(nèi)Ca2+在6 h 時顯著升高，24 h 時下降至接近對照組水平。光敏化姜黃素作用MGC－803 細胞，則可進一步影響線粒體膜電位、活性氧和細胞內(nèi)Ca2+的變化，與單純姜黃素作用比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P ＜0.01)，見表3。

Figure 2. Effects of photoactivated curcumin on MGC－803 cell nuclear morphology (Hoechst 33258 staining， ×200).A :control group;B:pure light group;C:curcumin group;D:curcumin+PDT group.圖2 光敏化和姜黃素對MGC－803 細胞核形態(tài)的影響

表3 光敏化姜黃素與單純姜黃素對MGC－803 細胞線粒體膜電位、活性氧和細胞內(nèi)Ca2+的影響Table 3. Effects of photoactivated curcumin or curcumin on mitochondria membrane potential(MMP)，ROS and Ca2+ in MGC－803 cells (%. ±s.n=5)

表3 光敏化姜黃素與單純姜黃素對MGC－803 細胞線粒體膜電位、活性氧和細胞內(nèi)Ca2+的影響Table 3. Effects of photoactivated curcumin or curcumin on mitochondria membrane potential(MMP)，ROS and Ca2+ in MGC－803 cells (%. ±s.n=5)

＊＊P ＜0.01 vs curcumin group.

Group 2+MMP ROS Ca 6 h 12 h 24 h 6 h 12 h 24 h 6 h 12 h 24 h Photoactivated curcumin 79.5±5.5＊＊ 70.8±5.5＊＊ 66.2±5.5＊＊ 134.9±5.8＊＊ 120.4±5.8＊＊ 115.7±5.8＊＊ 127.6±5.6＊＊ 105.3±5.6＊＊ 104.6±5.6＊＊Curcumin 90.9±5.5 80.7±5.5 81.6±5.5 109.7±5.8 106.4±5.8 103.2±5.8 109.9±5.6 102.1±5.6 1 01.8±5.6

5 姜黃素及其光敏化對MGC－803 細胞caspase－3、caspase－8 和caspase－9 酶活性的影響

單純姜黃素作用于MGC－803 細胞，凋亡蛋白caspase－3、caspase－8 和caspase－9 酶活性增加;而光敏化姜黃素作用MGC－803 細胞，則可進一步增加caspase－3、caspase－8 和caspase－9 酶活性的變化，與單純姜黃素比較，差異顯著(P ＜0.01)，見表4。

表4 光敏化姜黃素與單純姜黃素對MGC－803 細胞caspase－3、caspase－8 和caspase－9 酶活性的影響Table 4. Effects of photoactivated curcumin or curcumin on the activity of caspase－3，caspase－8 and caspase－9 in MGC－803 cells(%. ±s.n=5)

表4 光敏化姜黃素與單純姜黃素對MGC－803 細胞caspase－3、caspase－8 和caspase－9 酶活性的影響Table 4. Effects of photoactivated curcumin or curcumin on the activity of caspase－3，caspase－8 and caspase－9 in MGC－803 cells(%. ±s.n=5)

＊＊P ＜0.01 vs curcumin group.

Caspase－3 Caspase－8 Caspase－9 6 h 12 h 24 h 6 h 12 h 24 h 6 h 12 h 24 h Curcumin 107.2±5.3 111.5±5.3 115.9±5.3 115.3±5.7 117.2±5.7 119.4±5.7 112.4±5.3 114.8±5 Group.3 118.7±5.3 Photoactivated curcumin 116.8±5.3＊＊ 126.7±5.3＊＊ 128.5±5.3＊＊ 127.4±5.7＊＊ 126.5±5.7＊＊ 125.4±5.7 ＊＊ 122.7±5.3＊＊ 126.5±5.3＊＊ 125.8±5.3＊＊

6 姜黃素及其光敏化對MGC－803 細胞Bcl－2、細胞色素C、Bax 和HSP70 蛋白水平影響

單純姜黃素作用MGC－803 細胞，可使Bcl－2 和HSP70 蛋白表達水平下調(diào)，增加胞漿細胞色素C，對Bax 蛋白水平影響不明顯;而光敏化姜黃素作用于MGC－803 細胞，則可使Bcl－ 2 和HSP70 蛋白表達水平進一步下降，而且胞漿細胞色素C 上升更高，與單純姜黃素作用比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P ＜0.01)，見圖3。

Figure 3. Effects of photoactivated curcumin and curcumin on levels of cytochrome C，Bcl－2，Bax and HSP70 in MGC－803 cells. Con:control;Cur:curcumin;P－Cur:photoactivated curcumin. ±s.n=5. ＊＊P ＜0.01 vs Con;△△P ＜0.01 vs Cur.圖3 光敏化姜黃素與單純姜黃素對MGC－803 細胞中cytochrome C、Bcl－ 2、Bax 和HSP70 水平的影響

討 論

PDT 是近年來興起的利用選擇性蓄積于腫瘤組織的光敏劑在適當(dāng)波長激光下發(fā)生光敏反應(yīng)定位殺傷組織細胞的新型腫瘤治療方法［3］。隨著光纖技術(shù)、激光醫(yī)學(xué)和內(nèi)鏡技術(shù)發(fā)展而興起的一種治療惡性腫瘤的新方法，專家預(yù)測在2l 世紀光動力治療將成為一種重要醫(yī)療手段。然而現(xiàn)在常用的光敏劑多為卟啉及其衍生物的混合制品、成分復(fù)雜、化學(xué)結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定、易受生物代謝因素的影響，其光敏損傷作用的程度不易控制，影響療效的穩(wěn)定性。近年來國內(nèi)外的研究發(fā)現(xiàn)姜黃素是高效、低毒的新型理想光敏劑［4］。

姜黃素本身具有抗腫瘤、抗炎等多種藥理作用。其作為光敏劑在激光照射后能吸收能量，產(chǎn)生有細胞毒作用的單線態(tài)氧和其它氧自由基等活性氧，這些物質(zhì)和細胞內(nèi)成分發(fā)生光化學(xué)反應(yīng)，誘導(dǎo)細胞凋亡、造成細胞損傷甚至死亡。本研究表明姜黃素在360 ～480 nm 范圍內(nèi)的激光照射具有明顯的PDT 作用。光敏化作用顯著促進姜黃素抑制胃癌MGC－803 細胞的增殖，促進細胞凋亡。從而證實了姜黃素對胃腺癌MGC－803 細胞具有光毒效應(yīng)。本研究還發(fā)現(xiàn)細胞周期主要阻滯于G0/G1期。有研究表明在日光燈照條件下姜黃素誘導(dǎo)MGC－803 細胞凋亡主要阻滯于G2/M 期［3］，析其原因，可能是與光照條件不一致有關(guān)。還有研究表明姜黃素能誘導(dǎo)人胃腺癌BGC－823 細胞、Hep－2 細胞凋亡，使細胞周期阻滯于G0/G1期［5－6］。這說明姜黃素誘導(dǎo)不同的腫瘤細胞，其細胞阻滯的周期有差異。

細胞凋亡是細胞主動參與的自主性死亡過程，可被多種藥物及理化因素誘發(fā)。有研究表明姜黃素能誘導(dǎo)HL－60 細胞凋亡、肺癌NCI－H460 細胞凋亡［7－8］。細胞凋亡程序是一個復(fù)雜的、涉及多基因的過程，主要有線粒體和細胞表面受體介導(dǎo)這2 條途徑。有研究表明南海真菌代謝產(chǎn)物1386A 可能通過線粒體途徑誘導(dǎo)MGC－803 細胞凋亡［9］。bcl－2基因家族是研究最為深入的凋亡調(diào)控基因之一，根據(jù)其不同的生物學(xué)效應(yīng)，主要分為以Bax、Bcl－2 和Bid 為代表的3 類蛋白，其中促凋亡蛋白Bax 和抗凋亡蛋白Bcl－2 在細胞凋亡的調(diào)控過程中發(fā)揮著重要作用［10－11］。細胞是否發(fā)生凋亡及凋亡的嚴重程度取決于Bcl－2/Bax 的比值［12］。Bcl－2 家族、線粒體細胞色素C 及caspase 是細胞內(nèi)凋亡信號通路的基本成分［13］。當(dāng)Bcl－2/Bax 比值降低時，可導(dǎo)致線粒體細胞色素C 的釋放，同時激活凋亡蛋白caspase。Caspase 被認為是哺乳動物細胞凋亡中的關(guān)鍵蛋白，一旦活化發(fā)生級聯(lián)反應(yīng)，凋亡即進入不可逆的階段。而caspase－3 在caspase 家族14 個成員中是最重要的效應(yīng)型。有研究表明姜黃素通過激活白血病HL60 細胞線粒體途徑的caspase－3 等的降解誘導(dǎo)凋亡［14］。也能夠通過caspase－3 等機制誘導(dǎo)肺癌NCI－H460 細胞凋亡［8］。

有研究表明perifosine 誘導(dǎo)胃癌細胞SGC－7901凋亡與caspase 家族和Bcl－2 家族蛋白的表達密切相關(guān)［15］。我們通過Western blotting 分析，姜黃素作用于MGC－803 細胞之后，其抗凋亡蛋白Bcl－2 的表達下調(diào)，而促凋亡蛋白Bax 的表達明顯增加，Bcl－2/Bax 比值顯著降低。同時HSP70 蛋白表達水平下降，細胞色素C 明顯增加。HSP70 能抑制Bcl－2 的表達，起到促凋亡的作用。Bcl－2 抑制線粒體釋放細胞色素C，當(dāng)Bcl－2 水平下降時，細胞色素C 增加，激活凋亡蛋白caspase，促進凋亡。本實驗發(fā)現(xiàn)凋亡蛋白caspase－3、caspase－8 和caspase－9 的活性明顯增高，線粒體膜電位、活性氧和細胞內(nèi)Ca2+及流式細胞分析儀的結(jié)果均顯示細胞凋亡明顯增加，可推測姜黃素通過下調(diào)Bcl－2，上調(diào)Bax 的表達，激活了caspase－3、caspase－8 和caspase－9 的活性，使其觸發(fā)了凋亡程序，導(dǎo)致MGC－803 細胞凋亡。這對于姜黃素的臨床應(yīng)用具有重要意義。

綜上所述，光敏化姜黃素主要通過Bcl－2 和線粒體途徑增強其誘導(dǎo)胃癌MGC－803 細胞凋亡作用，其它的凋亡機制還有待進一步研究。

(致謝:承蒙華南師范大學(xué)生命激光研究所魏華江教授以及廣東藥學(xué)院心血管病研究所亓翠玲教授等的熱心指導(dǎo)和幫助，在此致以衷心的感謝。)

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