沈維高， 趙麗晶， 蓋曉東， 蘆麗莉， 葛 賀， 陳立松， 劉艷波△， 趙雪儉△

(1北華大學基礎醫(yī)學院病理生理學教研室，吉林 吉林132013;2吉林大學前列腺疾病防治研究中心，吉林 長春130021)

存活蛋白(survivin)屬于凋亡抑制蛋白，其表達強弱與前列腺癌的發(fā)生、發(fā)展、轉移及預后密切相關，可作為前列腺癌預后的分子標志物［1－2］。利用RNA 干擾技術抑制細胞內survivin 的過度表達可抑制腫瘤的生長，從而起到抗腫瘤作用［3］。GRIMs(genes associated with retinoid－interferon－induced mortality)屬于維甲酸(retinoic acid，RA)－ 干擾素(interferon，IFN)誘導 死亡 的相 關 基 因 家 族［4］。GRIM－19 是GRIMs 家族重要成員，在正常細胞內高表達，而在癌細胞內表達降低或缺失，而其高表達能抑制腫瘤細胞的增殖，并促進其凋亡［5－6］。RNA干擾并不能100%抑制目的基因的表達，于是我們嘗試沉默survivin 同時高表達GRIM－19，而有關其對腫瘤的生長抑制作用國內外未見報導。本研究擬構建siRNA－survivin 和GRIM－19 共表達質粒，在降低細胞癌基因同時增強死亡調節(jié)因子的表達，從而增強抗腫瘤效應，為前列腺癌的基因治療提供新的策略。

材 料 和 方 法

1 細胞培養(yǎng)

人前列腺癌DU145 細胞株由吉林大學前列腺防治研究中心饋贈。細胞用含有10% 胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)液37 ℃、5% CO2的孵箱內培養(yǎng)，以0.25%的胰酶消化傳代。

2 主要試劑

T4 DNA 連接酶購自Promega;Bgl Ⅱ、Nru Ⅰ、BamH Ⅰ、Hind Ⅲ和DNA 凝膠回收試劑盒購自大連寶生物工程公司;DNA purification system 為Promega產品;DNA DL2000 marker 和DL15000 marker 均為TaKaRa 產品。引物合成及測序由上海生工生物工程技術服務公司完成。溴化乙啶、瓊脂糖、MTT 和DMSO 購自Sigma;DEPC 購自Merk;高保真Taq DNA聚合酶、dNTP、MMV 逆轉錄酶及質粒提取和純化試劑盒購自Promega;RNA 酶及蛋白酶K 購于Ambion;Lipofectamine 2000 及Trizol 為Invitrogen 產品;胰酶、DMEM 培養(yǎng)基和胎牛血清為Hyclone 產品;其它常規(guī)化學試劑均為國產分析純產品。

3 主要方法

3.1 真核表達質粒siRNA－survivin 和GRIM－19的構建 在本課題組前期工作的基礎上，擴增已構建成功的pGCsilencer－U6－siRNA－survivin 質粒(簡稱pGCsi－sur)的U6 啟動子及siRNA－survivin［7］，在其上、下游分別引入BglⅡ和NruⅠ雙酶切位點，與線性化的TA 載體連接，然后進行擴增，其上游引物為5'－GC (AGATCT)TGCTTCGCGATGTACGGGCC－ 3';下游引物為5'－CG(TCGCGA)GGGCTATGAACTAATGACCC－3';PCR 擴增條件:94℃5 min，94 ℃30 s，55 ℃45 s，72 ℃45 s，72 ℃45 s，35 個循環(huán);擴增片段長度為585 bp。PCR 產物電泳、回收、連接后測序。用限制性內切酶BglⅡ和NruⅠ雙酶切pcDNA3.1－GRIM－19 質粒(由美國胡嘉娣老師饋贈)，使其線性化，回收，將U6－siRNA－survivin 與線性化的pcDNA3.1－GRIM－19(簡稱pGRIM－19)連接，插入pcDNA3.1－GRIM－19 多克隆酶切位點內，共表達基因質粒構建成功，命名為pcDNA3.1－GRIM－19/siRNA－survivin (簡 稱pGRIM－19－si－survivin)，將重組質粒轉化到大腸桿菌，挑取單克隆后擴增，提取質粒并測序鑒定。共表達質粒的構建過程如圖1 所示。

3.2 細胞轉染 應用脂質體Lipofectamine 2000 將重組質粒psi－scramble、psi－survivin、pGRIM－19 和pGRIM－19－si－survivin 分別轉染人前列腺癌細胞DU145 中，48 h 后提取RNA，檢測survivin 和GRIM－19 mRNA 表達水平。

Figure 1. The construction process of pGRIM－19－si－survivin co－expression plasmid圖1 表達質粒pGRIM－19－si－survivin 的構建

3.3 Survivin 和GRIM－19 mRNA 表達的檢測 應用Trizol 試劑提取轉染后各組細胞的總RNA，然后逆轉錄生成cDNA，應用人β－actin 引物進行擴增，鑒定模板質量。β－actin 的引物序列為:sense:5'－CTGGGACGACATGGAAAA－3'，antisense:5'－AAGGAAGGCTGGAAGAGTGC－3'，擴增片段長度為600 bp;survivin 引物序列:sense:5'－GAATTCATGGGTGCCCCGACGTTGCC－3'，antisense:5'－AGATCTTTCTTCTTATTGTTGGTTTCC－3'，擴增片段長度為415 bp;GRIM－19 引物序列:sense:5'－CTGGGACGACATGGAGA-AA－3'，antisense:5'－AAGGAAGGCTGGAAGAGTGC－3'，擴增片段長度為485 bp。所有引物均由上海生工生物技術有限公司合成。PCR 產物瓊脂糖凝膠電泳后拍照，并進行定量分析。

3.4 細胞增殖活性檢測 將實驗分為5 組，即mock、psi－scramble、psi－survivin、pGRIM－19 和pGRIM－19－si－survivin，每組設5 個復孔。取對數(shù)生長期細胞進行轉染，在培養(yǎng)細胞44 h 和68 h 后，各孔加入濃度為5 g/L MTT，常規(guī)方法檢測各孔的吸光度(absorbance，A)，按公式:抑制率(%)= (對照組A 值－實驗組A 值)/對照組A 值×100%，計算各組抑制率。

4 統(tǒng)計學處理

采用SPSS 12.0 統(tǒng)計學軟件進行分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差(± s)表示，組間比較采用One－way ANOVA，以P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

1 pGRIM－19－si－survivin 共表達質粒的鑒定

根據(jù)前期的研究結果，以pGCsi－sur 為模板擴增U6－siRNA－survivin 片段，見圖2，然后與TA 載體連接，用BglⅡ和NruⅠ雙酶切，獲得約585 bp 長度的片段，見圖3，測序結果與設計完全吻合，U6－siRNA－survivin 測序結果見圖4。

用BglⅡ和NruⅠ雙酶切pGRIM 和pGRIM－19－si－survivin，其電泳圖見圖5、6，證明共表達質粒構建成功。

Figure 2. Electrophoretic identification of specific U6－siRNAsurvivin PCR product. M:DL2000 DNA marker.圖2 U6－siRNA－survivin PCR 產物的電泳鑒定結果

Figure 3. Electrophoretic identification of pMD18－U6－survivin plasmid digested with BglⅡand NruⅠ. M:DL15000 DNA marker;Lane 1，3:pMD18－U6－survivin recombinant plasmid;Lane 2，4:pMD18－U6－survivin recombinant plasmid digested with BglⅡand NruⅠ;M2:DL2000 DNA marker.圖3 pMD18－U6－survivin 質粒的雙酶切鑒定結果

2 共表達質粒對DU145 細胞survivin 和GRIM－19 mRNA 表達影響

與mock 組比較，psi－scramble、psi－survivin、pGRIM－19 組及pGRIM－19－si－survivin 組survivin mRNA 表達水平分別為1.02 ± 0.09、0.55 ±0.05、0.62 ± 0.08 和0.35 ± 0.05，mock 與psi－scramble 無顯著差別(P ＞0.05)，而psi－survivin 和pGRIM－19 組survivin 的表達水平降低，共表達組降低更明顯(P ＜0.05，P ＜0.01)。psi－survivin、pGRIM－19 和pGRIM－19－si－survivin 組GRIM－19 表達增強，分別為mock 組的1.93 ±0.14、2.57 ±0.20 和4.12 ±0.21(P ＜0.01)，而psi－scramble 的表達水平為0.94 ±0.14，未有明顯變化(P ＞0.05);與pGRIM－19 組比較，pGRIM－19－si－survivin 增強pGRIM－19 表達的作用更明顯(P ＜0.05)，顯示出協(xié)同作用，見圖7。

Figure 4. The nucleotide base sequence of U6－siRNA－survivin.圖4 U6－siRNA－survivin 的測序結果

3 共表達質粒對DU145 細胞增殖抑制作用

DU145 轉染重組質粒后培養(yǎng)48 h 及72 h，應用MTT 比色法觀察各組細胞的增殖能力，以mock 組的生存率為100%，轉染48 h 后，psi－scramble 組的生存率為94.0% ± 7.3%，兩者之間無差異(P ＞0.05);而psi－survivin、pGRIM－19 和pGRIM－19－si－survivin 3 組細胞生存率分別為58.0% ±7.2%、62.1% ±6.1%和50.2% ±4.8%，與mock 組比較差異顯著(P ＜0.05)，pGRIM－19－si－survivin 組與psi－survivin 和pGRIM－19 組比較差異不明顯(P ＞0.05);轉染72 h 后psi－scramble 組的增殖率為90.1% ±5.5%，psi－survivin、pGRIM－19 和pGRIM－19－si－survivin 3 組分別為43.4% ± 4.3%、51.3% ±6.7%和26.8% ±7.1%，與兩陰性對照組相比，差異明顯(P ＜0.05，P ＜0.01);與psi－survivin 和pGRIM－19 組比較，pGRIM－19－si－survivin 抑制作用明顯增強(P ＜0.05)，顯示出協(xié)同抑制效應，見圖8。

Figure 5. Electrophoretic identification of pGRIM－19 plasmid digested with BglⅡand NruⅠ. M1:DL15000 DNA marker;Lane 1:pGRIM－19 recombinant plasmid;Lane 2:pGRIM－19 recombinant plasmid digested with BglⅡand NruⅠ;M2:DL2000 DNA marker.圖5 pGRIM－19 雙酶切鑒定結果

Figure 6. Electrophoretic identification of pGRIM－19－si－survivin recombinant plasmid digested with BglⅡand NruⅠ.M1:DL15000 DNA marker;Lane 1:pGRIM－19－si－survivin recombinant plasmid;Lane 2:pGRIM－19－si－survivin recombinant plasmid digested with BglⅡand NruⅠ;M2:DL2000 DNA marker.圖6 pGRIM－19－si－survivin 重組質粒雙酶切鑒定結果

討 論

凋亡抑制蛋白survivin 可特異性表達在人和鼠的胚胎發(fā)育組織，也可表達于人類多種腫瘤組織，在成人的正常組織中幾乎不表達［8］。我們前期研究表明survivin 在前列腺癌組織高表達，其異常激活導致細胞凋亡減少，進而參與了前列腺癌的發(fā)生和發(fā)展［9］。而且，針對survivin 的小干擾RNA，體內外均可下調前列腺癌survivin 基因表達并具有抑瘤效應［10］。但在哺乳動物細胞中，RNAi 并不能完全阻斷基因表達，尤其是異常高表達的基因。RNAi 只能降解與其序列同源的mRNA，對已經表達的蛋白，應用RNAi 方式是無法清除的。為了提高抗腫瘤作用，我們選擇聯(lián)合基因治療手段，即沉默survivin 同時增加另一種抗腫瘤基因(GRIM－19)的表達。

Figure 7. RT－PCR analysis of survivin and GRIM－19 mRNA expression in DU145 cells transfected with recombinant plasmids. ±s. n =3. * P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs mock or psi－scramble;#P ＜0.05 vs psi－survivin or pGRIM－19.圖7 pGRIM－19－si－survivin 重組質粒轉染DU145 細胞后survivin 和GRIM－19 基因表達情況

Figure 8. Growth inhibition of DU145 cells transfected with different plasmids. ± s. n = 3. * P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs mock or psi－scramble;#P ＜0.05 vs psi－survivin or pGRIM－19.圖8 pGRIM－19－si－survivin 重組 質粒對前列腺癌DU145 細胞增殖抑制作用

GRIM－19 是由IFN－β 聯(lián)合RA 誘導表達的死亡調節(jié)因子，在大多數(shù)正常組織中高表達，但在多數(shù)腫瘤組織表達降低或缺失。劉艷波等［10］研究發(fā)現(xiàn):前列腺癌組織及前列腺癌細胞GRIM－19 表達為陰性，這種差異性使得GRIM－19 作為靶基因進行治療成為可能。GRIM－19 高表達后可明顯抑制STAT3 的表達，而抑制STAT3 的信號轉導，可影響其對survivin 的表達調控，進而抑制腫瘤細胞的增殖過程［11］。根據(jù)前期工作，在增強GRIM－19 表達的同時抑制survivin 表達，有望成為腫瘤基因治療的新策略。本研究應用基因重組技術成功構建了真核共表達質粒pGRIM－19－si－survivin，應用RT－PCR 技術檢測發(fā)現(xiàn):該質粒在下調survivin 表達同時增強了GRIM－19 的表達。應用MTT 法檢測了其對細胞增殖作用的影響，發(fā)現(xiàn)該質?？蓞f(xié)同性地抑制前列腺癌DU145 細胞的增殖，并呈現(xiàn)時間依賴關系。上述結果為研究該質粒的作用機制奠定了基礎，為前列腺癌的基因治療指明了方向。

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