吳曉倩，宜 全，何麗姍

(廣州醫(yī)學(xué)院藥理教研室，廣東 廣州510182)

心腦血管疾病位居人類疾病譜首位，動(dòng)脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)是其主要病理基礎(chǔ)。血漿高密度脂蛋白膽固醇(high－density lipoprotein cholesterol，HDL－C)水平與冠心病的發(fā)病率呈顯著負(fù)相關(guān)，提高血漿HDL－C 已被證實(shí)是防治動(dòng)脈粥樣硬化類疾病的重要策略［1］。內(nèi)皮脂肪酶(endothelial lipase，EL)是HDL 代謝的關(guān)鍵酶［2］，由內(nèi)皮細(xì)胞合成，以旁分泌的方式在血管局部發(fā)揮作用。Ishida等［3］在Apo－E 基因敲除小鼠中研究發(fā)現(xiàn)，EL 介導(dǎo)單核細(xì)胞向發(fā)生粥樣硬化區(qū)域游走并黏附，下調(diào)HDL 水平，EL 與Apo－E 基因雙敲除小鼠發(fā)生動(dòng)脈粥樣硬化的敏感性上升，提示EL 可能通過調(diào)節(jié)HDL代謝參與動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展。EL 在動(dòng)脈粥樣硬化患者冠狀動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞、中膜血管平滑肌細(xì)胞、吞噬細(xì)胞及粥樣斑塊新生血管中都有表達(dá)［4］。然而EL 在動(dòng)脈粥樣硬化中的表達(dá)調(diào)控并不十分明確。氧化低密度脂蛋白(oxidized low－density lipoprotein，ox－LDL)是促動(dòng)脈粥樣硬化形成和發(fā)展的關(guān)鍵因素，參與內(nèi)皮功能損傷、泡沫細(xì)胞形成和炎癥的發(fā)生等。ox－LDL 是否影響EL 的表達(dá)，尚未見國內(nèi)、外文獻(xiàn)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)采用鼠源RAW264.7 巨噬細(xì)胞研究ox－LDL 對(duì)EL 表達(dá)的影響及其可能機(jī)制。

材 料 和 方 法

1 材料與試劑

鼠源RAW264.7 巨噬細(xì)胞由中國科學(xué)院上海生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)研究所細(xì)胞庫提供。DMEM 高糖培養(yǎng)基、胎牛血清和胰蛋白酶購自Gibco。BCA 蛋白定量試劑盒和增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光(enhanced chemiluminescence，ECL)試劑盒購自Pierce。蛋白電泳分子量(7 ～175 kD)標(biāo)記和EL 抗體、α－tubulin 抗體、NF－κB p65 抗體和IκBα 抗體購自Cell Signaling。核蛋白抽提試劑盒(cell nuclear extraction kit)和PDTC購自Sigma。Histone H1 抗體、抗兔Ⅱ抗和抗小鼠Ⅱ抗購自Santa Cruz。其余試劑均為分析純產(chǎn)品。

2 ox－LDL 的制備和鑒定［5］

采用序列超速離心法分離健康人新鮮血漿低密度脂蛋白，經(jīng)瓊脂糖電泳、十二烷基磺酸鈉－聚丙烯酰胺凝膠電泳均顯示為單一蛋白條帶。提純的LDL用不含EDTA 的PBS 液透析48 h，隨后在含10 μmol/L CuSO4的PBS 液(pH 7.2)中37 ℃溫育透析12 h，最后在含100 μmol/L EDTA 的PBS 中4 ℃透析24 h。過濾除菌、定量，用PBS 調(diào)蛋白濃度至1 g/L，4 ℃保存?zhèn)溆?。取氧化前后的LDL，瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

3 細(xì)胞培養(yǎng)與實(shí)驗(yàn)分組

正常生長(zhǎng)的RAW264.7 巨噬細(xì)胞用高糖DMEM培養(yǎng)基(含10% 胎牛血清)調(diào)節(jié)細(xì)胞密度至1.25 ×108/L，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細(xì)胞同步化24 h。隨機(jī)分組，分別用(0 ～100 mg/L)ox－LDL 孵育細(xì)胞24 h;PDTC 預(yù)孵育細(xì)胞30 min 后再加50 mg/L ox－LDL 孵育24 h。

4 EL 表達(dá)檢測(cè)

細(xì)胞處理后，用細(xì)胞刮刮下細(xì)胞，PBS 洗滌，RIPA 裂解細(xì)胞，10 000 ×g、4 ℃離心30 min，取上清，定量。Western blotting 主要步驟如下:經(jīng)SDS－聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，電轉(zhuǎn)。5%脫脂牛奶于室溫振蕩封閉60 min，Ⅰ抗4 ℃孵育過夜，TBS 緩沖液沖洗，Ⅱ抗室溫孵育2 h，TBS 緩沖液沖洗，曝光，采用Image－Pro Plus 軟件分析條帶A 值，α－tubulin 為內(nèi)參照。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。

5 核蛋白提取與NF－κB、IκBα 檢測(cè)

參照Sigma 公司試劑盒說明書進(jìn)行核蛋白提取，主要步驟如下:收集細(xì)胞，加lysis buffer 冰上孵育15 min，加Igepal CA－630 劇烈渦旋10 s，10 000 ×g、4℃離心30 s，取上清得胞漿蛋白，用于檢測(cè)IκBα 表達(dá);沉淀為細(xì)胞核，加extract buffer 重懸細(xì)胞核，冰上孵育30 min，并不斷劇烈渦旋。20 000×g、4 ℃離心5 min，取上清用于檢測(cè)NF－κB p65 亞基表達(dá)。Western blotting 同上述方法。Histone H1 為核蛋白內(nèi)參照，α－tubulin 為胞漿蛋白內(nèi)參照。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。

6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié) 果

1 ox－LDL 對(duì)RAW264.7 細(xì)胞EL 表達(dá)的影響

不同濃度(0 ～100 mg/L)的ox－LDL 孵育RAW264.7 細(xì)胞使EL 蛋白表達(dá)增加。50 mg/L ox－LDL 達(dá)到高峰，為空白對(duì)照組的(1.92 ±0.34)倍(P＜0.05)，見圖1。

Figure 1. Effect of ox－LDL on EL protein expression in RAW264.7 cells. ±s. n =3. *P ＜0.05 vs control(0 mg/L).圖1 ox－LDL 對(duì)RAW264.7 細(xì)胞EL 表達(dá)的影響

2 ox－LDL 刺激RAW264.7 細(xì)胞NF－κB 活化

50 mg/L ox－LDL 作用于RAW264.7 細(xì)胞15 min IκBα 開始降解，30 min 幾乎降解到最低。同時(shí)NF－κB p65 表達(dá)開始增加，15 ～30 min 增加到最高，見圖2。

3 PDTC 抑制ox－LDL 誘導(dǎo)的RAW264.7 細(xì)胞EL 表達(dá)增加

NF－κB 阻斷劑PDTC 預(yù)孵育細(xì)胞30 min，再用50 mg/L ox－LDL 孵育細(xì)胞24 h 后發(fā)現(xiàn)，PDTC+ox－LDL 組EL 蛋白表達(dá)水平比ox－LDL 組明顯下降(P ＜0.05)，見圖3。

討 論

Figure 2. ox－LDL induced activation of NF－κB in RAW264.7 cells. ±s. n=3. *P ＜0.05 vs control (0 min).圖2 ox－LDL 刺激RAW264.7 細(xì)胞NF－κB 活化

Figure 3. The increased EL expression induced by ox－LDL was inhibited by PDTC. The RAW264.7 cells were treated with 50 mg/L ox－LDL for 24 h with or without pretreatment with 100 μmol/L of PDTC for 30 min. ±s. n =6. ＊＊P ＜0. 01 vs control;#P ＜0. 05 vs ox－LDL.圖3 PDTC 抑制ox－LDL 誘導(dǎo)的RAW264.7 細(xì)胞EL 表達(dá)增加

EL 是1999 年被發(fā)現(xiàn)的甘油三酯脂肪酶家族的新成員。與肝脂肪酶和脂蛋白脂肪酶不同，EL 具有較強(qiáng)的磷脂酶活性。HDL 被證明是EL 的特異性底物［6］。EL 升高會(huì)導(dǎo)致血漿HDL－C、apoA－I 水平明顯下降［7］，而EL 基因突變則會(huì)引起血漿HDL 增高［8－9］。而且，EL 對(duì)HDL 的水解作用存在明顯的劑量依賴性:給小鼠注射不同劑量含EL cDNA 的重組腺病毒后出現(xiàn)劑量依賴性的血漿磷脂酶活性上升和磷脂、HDL、apoA－I 水平下降［10］。這些研究表明，EL 與體內(nèi)HDL 水平密切相關(guān)。HDL－C 負(fù)責(zé)體內(nèi)膽固醇逆向轉(zhuǎn)運(yùn)，提高血漿HDL－C 被證實(shí)是防治動(dòng)脈粥樣硬化類疾病的重要策略。因此，明確EL 表達(dá)的調(diào)控、改善HDL－C 水平可能為治療動(dòng)脈粥樣硬化提供新的思路。

ox－LDL 被認(rèn)為是動(dòng)脈粥樣硬化的關(guān)鍵致病因素，介導(dǎo)巨噬細(xì)胞泡沫化、炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)、內(nèi)皮細(xì)胞損傷、血管平滑肌細(xì)胞遷移等，貫穿動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)展的整個(gè)過程。然而ox－LDL 是否影響EL 表達(dá)尚未見報(bào)道，本研究發(fā)現(xiàn)ox－LDL 劑量依賴性地增加EL 的表達(dá)。也有文獻(xiàn)報(bào)道，AS 相關(guān)炎癥因子TNFα、IL－1β 是通過NF－κB 通路上調(diào)EL mRNA 和蛋白水平及其酶活性［11］。這些研究與我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示EL 可能受到ox－LDL、炎癥因子的調(diào)控參與動(dòng)脈粥樣硬化過程。

NF－κB 是一個(gè)氧化－還原敏感性核轉(zhuǎn)錄因子，主要由p50 和p65 2 個(gè)亞基組成。靜息狀態(tài)下，NF－κB 由于被其天然抑制劑IκBs (IκBα、β、ε、ζ)蛋白包裹在胞漿中處于失活狀態(tài);當(dāng)細(xì)胞受到某些刺激(如氧化應(yīng)激、炎癥等)，IKKα/β 蛋白激酶催化IκBs絲氨酸殘基磷酸化(Ser32 和Ser36)繼而被26S 蛋白酶體降解，使得NF－κB p65 亞單位釋放并從細(xì)胞質(zhì)移位到細(xì)胞核，與靶基因上啟動(dòng)子的特定序列結(jié)合，啟動(dòng)多種靶基因轉(zhuǎn)錄和蛋白質(zhì)表達(dá)，參與動(dòng)脈粥樣硬化過程［12］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，ox－LDL 刺激RAW264.7 細(xì)胞15 min 胞漿中IκBα 降解增多，而核NF－κB p65 亞單位磷酸化增加，提示NF－κB 被激活。為研究NF－κB 是否參與ox－LDL 刺激引起的EL 表達(dá)增加，我們采用NF－κB 抑制劑PDTC 預(yù)處理細(xì)胞1 h 后發(fā)現(xiàn)，ox－LDL 引起的EL 表達(dá)增加被抑制。這提示ox－LDL 可能通過NF－κB 途徑上調(diào)EL 的表達(dá)。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)ox－LDL 能夠劑量依賴性地增加EL 表達(dá)，該作用可能由NF－κB 介導(dǎo)。然而EL 在動(dòng)脈粥樣硬化中的作用以及以EL 為靶點(diǎn)、以HDL 為底物的藥物篩選體系建立的可能性還有待進(jìn)一步研究，以期為開發(fā)以調(diào)節(jié)HDL 水平治療動(dòng)脈粥樣硬化的藥物提供新的思路。

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