楊世斌， 肖隆斌， 許峰峰， 吳文輝， 李守智， 李明哲

(中山大學附屬第一醫(yī)院黃埔院區(qū)普外科，廣東 廣州510700)

上皮細胞黏附因子(epithelial cell adhesion molecule，EPCAM)、白細胞分化抗原44 (cluster of differentiation 44，CD44)和白細胞分化抗原24 (cluster of differentiation 24，CD24)是不同腫瘤干細胞的表面標記。EPCAM+CD44+可作為結(jié)直腸癌干細胞的表面標記［1］。Takaishi 等［2］發(fā)現(xiàn)CD44+可作為胃癌干細胞的表面標記。胃癌AGS 細胞系中CD44+CD24+是胃癌干細胞的表面標記［3］，也有認為EPCAM+CD44+可作為胃 癌 干 細胞表面 標記［4］，EPCAM+CD44+CD24+可作為胰腺癌干細胞的表面標記［5］。目前尚無聯(lián)合檢測胃癌中以上指標的文獻資料，本文聯(lián)合檢測EPCAM、CD44 和CD24 在胃癌組織中的表達，并分析其與臨床病理特點及預(yù)后的關(guān)系。

材 料 和 方 法

1 一般資料

數(shù)據(jù)源于中山大學附屬第一醫(yī)院胃癌診治中心數(shù)據(jù)庫，剔除伴嚴重基礎(chǔ)疾病的病人，選取2003 年5月至2004 年6 月胃癌95 例，同時取25 例癌旁正常黏膜組織作為陰性對照，均行手術(shù)治療，未經(jīng)術(shù)前放化療。病理結(jié)果均由2 名高級別的病理醫(yī)生做診斷。簽署知情同意書。術(shù)后將病理標本蠟塊行免疫組化檢測，同時對95 例患者治療情況進行預(yù)后分析。

2 主要試劑材料

兔抗人CD24 多克隆抗體購自ABGENT，兔抗人CD44 單克隆抗體購自EPITOMICS，兔抗人EPCAM多克隆抗體及抗體稀釋液購自北京博奧森公司。二步法抗兔/鼠通用型免疫組化檢測試劑盒及緩沖稀釋液、原液購自基因科技(上海)有限公司。

3 方法

選取已有病理診斷的胃癌石蠟塊，以每張3 mm厚切片，置于63 ～65 ℃烤箱1 ～2 h。將切片浸于二甲苯中脫蠟3 次，每次5 min;100%、90%、80%、70%梯度乙醇洗2 次，每次3 min;蒸餾水洗3 min;將切片放入盛有檸檬酸鹽緩沖液(pH 6.0)的容器中，置微波爐內(nèi)加熱使容器內(nèi)液體溫度保持在92 ～98 ℃之間并持續(xù)10 ～15 min，室溫下自然冷卻;蒸餾水洗2 次，每次1 min;3%H2O2浸泡切片，室溫靜置10 min;或微波爐低火1 min;PBS 洗3 次，每次3 min;取出切片，甩掉并擦干組織周圍的液體(組織切勿干燥)，平放于濕盒，滴加Ⅰ抗(工作液)100 μL，37 ℃溫箱孵育1 h;孵育完畢，用PBS 洗3 次，每次3 min;滴加Ⅱ抗100 μL，37 ℃溫箱孵育30 min;PBS 洗3 次每次3 min;DAB 工作液顯色1 ～5 min，在顯微鏡下控制顯色程度，當顯色合適時用蒸餾水沖洗終止反應(yīng);Mayer 蘇木素復染3 min，蒸餾水沖洗3 ～5 min;各級濃度乙醇(70%～100%)脫水、二甲苯透明、封片膠封片、鏡檢。

判定原則及標準:(1)必須同時設(shè)對照染色。沒有對照染色的免疫組化染色結(jié)果是不可信的。(2)抗原表達必須在特定部位。不在抗原所在部位的陽性著色，一律不能視為陽性。(3)避開出血、壞死及切片刀痕和界面邊緣細胞的陽性表達。

4 統(tǒng)計學處理

數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS 13.0 軟件進行統(tǒng)計學處理，率的比較用χ2檢驗，多變量分析用Logistic 回歸，累積生存率根據(jù)壽命表法計算，生存曲線用Kaplan－Meier法分析，多因素用Cox 回歸分析，生存率比較用logrank 檢驗。以P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié) 果

1 免疫組化結(jié)果

EPCAM 表達陽性56 例，陽性率58.95%;CD44表達陽性41 例，陽性率43.16%;CD24 表達陽性56例，陽性率58.95%。其中EPCAM+CD44+30 例，陽性率 31. 58%;EPCAM+CD24+45 例，陽 性 率47.37%;CD44+CD24+32 例，陽性率33. 68%;EPCAM+CD44+CD24+25 例，陽性率26.32%。陰性對照組這3 種蛋白的陽性率分別為16.00%、8.00%和20.00%，見圖1。

2 95 例胃癌患者病例多因素Cox 回歸分析

Figure 1. The expression of EPCAM，CD44 and CD24 in tumor tissues and normal gastric mucosae (immunohistochemical staining，×400).A，D，G:positive expression in gastric adenocarcinoma;B，E，H:negative expression in gastric adenocarcinoma;C，F(xiàn)，I:control group.Black arrows referred to positive staining，and the others referred to negative staining.圖1 EPCAM、CD44 及CD24 在胃癌組織及正常黏膜中的表達

對95 例胃癌術(shù)后患者的資料進行Cox 回歸分析，將所有因素納入分析范圍，結(jié)果顯示對其生存率有影響的是腹水、盆結(jié)節(jié)、腹膜侵犯、EPCAM、CD44、三者皆陽性、分化和浸潤程度，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，而根治術(shù)式、組織學分型和腫瘤部位在顯著性水平附近。如果患者合并腹水、盆腔轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)、腹膜種植侵犯、低分化、EPCAM 及CD44 陽性或三指標陽性時相對危險度將明顯增加，而CD24 陽性、印戒細胞癌、BORRMANN Ⅳ型和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移時危險度分別增加55.4%、30.7%、54.3%、10.9%和30.6%，見表1。

3 臨床病理指標的單因素分析結(jié)果

EPCAM 與年齡、腫瘤浸潤深度和WHO 組織學分型有關(guān);CD44 與BORRMANN 分型、WHO 組織學分型和CEA 值有關(guān);CD24 與浸潤深度、腫瘤位置、WHO 組織學分型和臟器侵犯有關(guān);三者陽性與浸潤深度、腫瘤位置和WHO 組織學分型有關(guān)，見表2。

4 與患者術(shù)后生存率分析比較

EPCAM 或CD44 陽性組的術(shù)后生存率較陰性組降低，生存時間縮短CD24 陽性組與陰性組相比差異無統(tǒng)計學意義。CD44+CD24+EPCAM－與EPCAMCD44－CD24－比較差異有統(tǒng)計學意義，其余雙指標組無統(tǒng)計學意義。三指標陽性組與三指標陰性組生存率比較差異有統(tǒng)計學意義(P ＜0.05)，見圖2 ～8。

討 論

本研究同時檢測胃癌組織中的EPCAM、CD44 和CD24 陽性表達，結(jié)果顯示EPCAM 表達率在58.95%(56/95)，而國內(nèi)外學者報道比例在30% ～75%左右［6］。CD44 表達陽性率在43.16%(41/95)，而國內(nèi) 外報道表達比率在19% ～90%不等［7－8］。CD24表達陽性率58.95%(56/95)，與EPCAM 一致，而此蛋白國內(nèi)外報道在50% ～81%左右。

表1 95 例胃癌患者Cox 回歸分析Table 1. Cox regression analysis in 95 gastric cancer patients

CD44 與多種腫瘤有關(guān)，有學者認為其在結(jié)直腸癌中表達高達90%以上，但是陽性組與陰性組在生存率上差異無統(tǒng)計學意義［9］，在小細胞肺癌中患者血清CD44S、CD44V6 水平明顯高于肺良性疾病，可作為鑒別NSCLC 和肺良性疾病的輔助指標［10］。另有學者認為胃癌病例CD24 和CD44v6 表達陽性率明顯高于癌旁組織和不同類型胃良性病變［11］，在胃癌表達陽性率是43.9%，陽性者化療效果好［12］。本研究顯示，CD44 與BORRMANN 分型和WHO 組織學分型和CEA 值有關(guān)。同樣，Bektas 等［13］對93 例胃癌組織行CD24 免疫組化分析，認為CD24 表達陽性率在87%，與淋巴血管侵犯、漿膜浸潤和TNM 分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)。Chou 等［14］認為，CD24 在50%的胃癌細胞質(zhì)中表達，與TNM 分期、漿膜侵犯和淋巴血管侵犯有關(guān)，10 年生存率明顯下降。我們的資料認為CD24 與浸潤深度、腫瘤位置、WHO 組織學分型和臟器侵犯有關(guān)(P ＜0.05)。同時我們認為EPCAM 與年齡、腫瘤浸潤深度和WHO 組織學分型有關(guān)。年輕或年老、T4期及腺癌患者該指標陽性率

高(P ＜0.05)。EPCAM 與胃癌遠處轉(zhuǎn)移有較大關(guān)系，在遠處轉(zhuǎn)移、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及無轉(zhuǎn)移的胃癌中表達率分別為90%、86%和58%［15］。另外，三指標陽性組與3 指標陰性組在侵潤深度、腫瘤位置、WHO 組織學分型上差異有統(tǒng)計學意義。

表2 EPCAM、CD44 和CD24 在胃癌組織中的表達與臨床病理資料之間的關(guān)系Table 2. Correlation between the clinicopathological features and the expression of EPCAM，CD44 and CD24

AC:adenocarcinoma;MC:mucinous carcinoma;SRCC:signet ring cell carcinoma.

Figure 2. Kaplan－Meier curves with univariate analysis for gastric cancer patients with EPCAM expression (P ＜0.05).圖2 胃癌中EPCAM 表達與Kaplan－Meier 生存率曲線

Figure 3. Kaplan－Meier curves with univariate analysis for gastric cancer patients with CD44 expression(P ＜0.01).圖3 胃癌中CD44 表達與Kaplan－Meier 生存率曲線

Figure 4. Kaplan－Meier curves with univariate analysis for gastric cancer patients with CD24 expression (P ＞0.05).圖4 胃癌中CD44 表達與Kaplan－Meier 生存率曲線

Figure 5. Kaplan－Meier curves with univariate analysis for gastric cancer patients with EPCAM，CD44 and CD24 expression (P ＜0.05).圖5 胃癌中EPCAM、CD44 和CD24 表達與Kaplan－Meier 生存率曲線

Figure 6. Kaplan－Meier curves with univariate analysis for gastric cancer patients with EPCAM and CD44 expression(P ＞0.05).圖6 胃癌中EPCAM 和CD44 表達與Kaplan－Meier 生存率曲線

Figure 7. Kaplan－Meier curves with univariate analysis for gastric cancer patients with EPCAM and CD24 expression(P ＞0.05).圖7 胃癌中EPCAM 和CD24 表達與Kaplan－Meier 生存率曲線

Figure 8. Kaplan－Meier curves with univariate analysis for gastric cancer patients with CD44 and CD24 expression(P ＜0.05).圖8 胃癌中CD44 和CD24 表達與Kaplan－Meier 生存率曲線

本研究結(jié)果顯示，CD44、CD24、EPCAM 在癌旁正常黏膜及腫瘤中均有不同程度表達，但癌旁正常黏膜表達較胃癌組織中低，說明從正常黏膜到癌的轉(zhuǎn)變過程中三者表達發(fā)生了重要變化，可作為預(yù)判斷瘤侵襲能力和預(yù)后的指標。CD24、EPCAM、三者陽性的表達與浸潤深度有關(guān)，而且CD24 還與臟器侵犯有關(guān)。同時，三者均與組織學分型有關(guān)，多因素分析顯示分化浸潤程度是影響生存最重要的因素，進一步證實了它們與胃癌的浸潤轉(zhuǎn)移有密切的聯(lián)系，對胃癌的預(yù)后判斷有一定意義。CD44、CD24 及EPCAM 的表達可能存在著協(xié)同作用，或者存在一種機制將其聯(lián)合起來，促進腫瘤細胞的浸潤轉(zhuǎn)移及預(yù)后，而且三者聯(lián)合作用比任何一種黏附分子單獨作用都更能促進腫瘤的浸潤轉(zhuǎn)移。EPCAM 與年齡有關(guān)，說明它可能與胃癌患者的生存時間縮短有關(guān)，年齡上的積累可能與腫瘤干細胞的形成有關(guān)。

我們結(jié)果顯示，EPCAM、CD44 陽性組與陰性組的生存率差異有統(tǒng)計學意義，而CD24 陽性組與陰性組的生存率差異無統(tǒng)計學意義，這與Bektas 等［13］的結(jié)論不同，他們認為CD24 陽性者生存率增加。分析原因，CD44+資料中印戒細胞癌比例較其它兩者高，故與EPCAM 一樣，死亡率高。CD24－病例中T4 占69.23% (27/39)，BORRMANN Ⅲ～Ⅳ占82. 05%(32/39)，與CD24+組比較差異無統(tǒng)計學意義。

綜上所述，聯(lián)合檢測EPCAM、CD44 和CD24 可作為胃癌的初篩實驗，尤其對于胃腺癌有診斷價值，同時可指導針對性的手術(shù)治療，有益于胃癌的綜合治療，提高生存率。

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