張彩鳳， 夏永華， 李貞娟， 周慧聰， 韓 宇， 孫 矗

(新鄉(xiāng)醫(yī)學院1第一附屬醫(yī)院消化內科，2第一附屬醫(yī)院皮膚科，32007 級臨床醫(yī)學系，河南 新鄉(xiāng)453100)

胃癌是最常見的消化道惡性腫瘤，雖其發(fā)生率較過去50 年明顯下降，但它仍然是世界上排名第二的致死性腫瘤［1］，其5 年生存率仍然相當低下［2］。目前隨著診療水平的不斷改善，早期胃癌患者的生存率大幅度提高，但是晚期胃癌患者的預后仍然較差［3］，因此尋找新的分子靶點診斷和治療胃癌顯得十分重要。

微管解聚蛋白stathmin 是一類十分重要的微管調控蛋白，在有絲分裂紡錘體的聚合和解聚中發(fā)揮關鍵作用［4－5］。近來研究發(fā)現(xiàn)，stathmin 在多種不同的人類腫瘤中呈現(xiàn)高表達，包括:子宮內膜癌［6］、肝細胞癌［7］、肺癌［8］、成神經管細胞瘤［9］、宮頸癌［10］等，其可能成為許多腫瘤基因治療中的分子靶點［11］。前期我們的體外研究提示，stathmin 在胃癌SGC－7901 細胞中高表達，干擾其表達后能明顯抑制胃癌SGC－7901 細胞的增殖、誘導細胞周期靜止和細胞凋亡。因此，為進一步證實stathmin 在胃癌體內發(fā)生發(fā)展中的可能作用機制，我們建立胃癌細胞裸鼠移植瘤模型，從體內水平研究其表達下調對胃癌細胞增殖和凋亡的影響，分析其可能的分子機制，為以stathmin 為靶點的胃癌基因治療提供理論依據。

材 料 和 方 法

1 材料

人胃癌細胞株SGC－7901 購自中國科學院上海細胞研究所細胞庫。RPMI－1640 培養(yǎng)基和胰蛋白酶購自Gibco;胎牛血清購自杭州四季青生物公司;Ki－67、stathmin、Bcl－2 和Bax 抗體以及stathmin siRNA(sc－36127)和對照siRNA(sc－37007)均購自Santa Cruz;SP 免疫組化試劑盒購自北京中杉金橋生物技術有限公司;TUNEL 細胞凋亡原位檢測試劑盒和總蛋白提取試劑盒均購自南京凱基生物科技發(fā)展有限公司。

2 方法

2.1 胃癌SGC－7901 細胞培養(yǎng) 人胃癌細胞株SGC－7901 細胞在含有10%胎牛血清、1 ×105U/L青霉素和100 mg/L 鏈霉素的RPMI－1640 培養(yǎng)液中生長，并置于37 ℃、5% CO2相對飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。選取處于對數生長期的細胞用于以下各實驗。

2.2 胃癌SGC－7901 細胞裸鼠皮下移植瘤模型的建立及實驗分組 4 ～6 周鼠齡BALB/c 雌性裸鼠，重18 ～22 g，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司。所有動物在河南省實驗動物中心無菌空氣層流內飼養(yǎng)。取處于對數生長期的胃癌細胞株SGC－7901 細胞，用胰酶消化，PBS 調整細胞懸液密度至5×1010/L。在裸鼠背部一側皮下接種0.1 mL 細胞懸液，1 周后開始腹腔接種治療。隨機將15 只裸鼠分成3 組，每組5 只。3 組動物分別為PBS 組(接種PBS，隔天1 次)、對照siRNA 組(接種對照siRNA，終濃度為100 nmol/L，隔天1 次)和stathmin siRNA 組(接種stathmin siRNA，終濃度為100 nmol/L，隔天1次)。共治療14 d，接種7 次。

2.3 移植瘤體積及體積抑瘤率的計算 從腹腔接種治療開始，每隔1 d 用游標卡尺精確測量腫瘤的長徑a(mm)和短徑b(mm)，利用公式V(mm3)=ab2/2計算腫瘤體積。治療2 周后處死小鼠，取出腫瘤組織，稱重，并繪制各組腫瘤生長曲線。

2.4 免疫組織化學檢測Ki－67 的表達 腫瘤組織經40 g/L 甲醛固定，石蠟包埋、4 ～6 μm 連續(xù)切片，采用免疫組織化學鏈霉菌抗生物素蛋白－過氧化物酶(SP)法檢測。詳細步驟嚴格按SP 試劑盒說明操作，在隨機選取40 個視野中，Ki－67 陽性細胞數與總細胞數的比率即為增殖指數。

2.5 TUNEL 原位檢測細胞凋亡 將取出的腫瘤組織進行固定、石蠟包埋及按4 μm 厚切片，然后按TUNEL 檢測試劑盒說明書操作，檢測腫瘤組織中的細胞凋亡情況。每張切片隨機選取5 個視野(×200)，計數500 個細胞中TUNEL 陽性細胞數。背景無顏色，以細胞核內著棕黃色顆粒為TUNEL 陽性細胞。

2.6 Western blotting 檢測蛋白表達 分別取3 組胃癌裸鼠移植瘤20 mg 組織，加入100 μL 蛋白裂解液，然后12 000 ×g 離心30 min 取上清液，并測定蛋白濃度。采用10% SDS－PAGE 方法進行蛋白分離，蛋白上樣量為每泳道50 μg。電泳后將目的蛋白電轉移至硝酸纖維素膜上，5%脫脂奶粉封閉2 h，分別加入1∶200 稀釋的stathmin、Bcl－2 和Bax 的抗體，4℃反應過夜。洗膜后，加入1∶5 000 稀釋的Ⅱ抗，室溫反應1 h，暗室曝光。結果用Image－Pro Plus 5.0軟件分析目的蛋白的相對表達量。

3 統(tǒng)計學處理

結 果

1 Stathmin 在胃癌裸鼠移植瘤中的表達

轉染stathmin siRNA 后瘤體中stathmin 蛋白的表達顯著低于PBS 組和對照siRNA 組(P ＜0.05)，PBS 組和對照siRNA 組之間stathmin 蛋白表達無顯著差異(P ＞0.05)，見圖1。

Figure 1. Western blotting analysis for expression of stathmin protein in the 3 groups. ±s.n=5. * P ＜0.05 vs PBS and control siRNA.圖1 Western blotting 分析3 組裸鼠腫瘤組織中stathmin蛋白的表達

2 Stathmin siRNA 對胃癌SGC－7901 細胞裸鼠皮下移植瘤生長的影響

在裸鼠皮下注射胃癌SGC－7901 細胞成瘤后，分別注射PBS、對照siRNA 和stathmin siRNA 后，發(fā)現(xiàn)注射stathmin siRNA 后瘤體體積明顯小于PBS 組和對照siRNA 組，見圖2。實驗結束后剝離瘤體并稱重，stathmin siRNA 組中瘤體的重量［(0.46 ±0.11)g］明顯小于PBS 組［(1.80 ±0.28)g］和對照siRNA組［(1.66 ±0.33)g］(P ＜0.05)，PBS 組和對照siRNA 組之間無統(tǒng)計學意義(P ＞0.05)。

Figure 2. The status of tumor growth in nude mice after treatment with stathmin siRNA.圖2 Stathmin siRNA 治療后裸鼠移植瘤的生長情況

3 Stathmin siRNA 抑制胃癌裸鼠移植瘤的增殖

各組裸鼠在治療期間其瘤體的體積不斷增大，但stathmin siRNA 組裸鼠移植瘤瘤體生長緩慢，第5 d 開始顯著小于PBS 組和對照siRNA 組，組間比較差異有統(tǒng)計學意義(P ＜0.05)，PBS 組和對照siRNA組之間無統(tǒng)計學意義(P ＞0.05)，見圖3。

Figure 3. Growth curves of nude mouse transplanted tumors in the 3 groups. ±s.n=5. * P ＜0.05 vs PBS group and control siRNA group.圖3 3 組裸鼠瘤體的生長曲線

4 增殖抗原Ki－67 表達的檢測

Stathmin siRNA 組中Ki－67 的染色強度明顯低于PBS 組和對照siRNA 組，見圖4。隨機選取40 個視野，stathmin siRNA 組的細胞增殖指數(17.23%±2.91%)顯著低于PBS 組(78.68%±4.31%)和對照siRNA 組(74.56%±4.58%)(P ＜0.05)。

5 TUNEL 檢測胃癌裸鼠移植瘤細胞的凋亡

與PBS 組和對照siRNA 組相比，stathmin siRNA 組中凋亡細胞數明顯增加，見圖5。以隨機選取的視野計數，stathmin siRNA 組的細胞凋亡數(85±13)明顯高于PBS 組(18±5)和對照siRNA 組(16±6)(P ＜0.05)。

Figure 4. The result of immunohistochemical staining of Ki－67 protein(×200).圖4 Ki－67 蛋白的免疫組織化學染色結果

Figure 5. Cell apoptosis detected by TUNEL in the 3 groups(×200).圖5 TUNEL 檢測3 組裸鼠腫瘤組織細胞的凋亡

6 Western blotting 檢測Bcl－2 和Bax 蛋白的表達

與PBS 組和對照siRNA 組相比，stathmin siRNA組中Bcl－2 蛋白的表達明顯下調，而Bax 蛋白的表達顯著上調，且差異均具有統(tǒng)計學意義(P ＜0.05)，見圖6。

討 論

微管解聚蛋白stathmin 是從淋巴瘤中篩選出的特征性基因表達產物，其基因主要定位于人染色體1p35 ～36.1 上［12］。近年來，隨著人們對細胞骨架，特別對微管蛋白、微管及紡錘體在細胞分裂和增殖中作用的不斷探索和研究，才逐漸認識到stathmin 蛋白作為細胞信號轉導分子在細胞周期和細胞凋亡，尤其在惡性腫瘤發(fā)生、發(fā)展中的重要作用。目前研究較為深入的是stathmin 在前列腺癌和骨肉瘤細胞中作用［4，13］。此外，在胃癌中發(fā)現(xiàn)stathmin 呈現(xiàn)高表達［14］，但目前關于stathmin 在胃癌細胞體內的分子作用機制還不清楚，為進一步從體內探討stathmin可能的分子作用機制，本研究試圖通過從體內下調stathmin 的表達來探討其在胃癌發(fā)生發(fā)展中的作用。

Figure 6. Western blotting analysis for expressions of Bcl－2 and Bax proteins in the 3 groups. ±s.n=5. * P ＜0.05 vs PBS and control siRNA.圖6 Western blotting 分析3 組裸鼠腫瘤組織中Bcl－2 和Bax 蛋白的表達

本研究首先通過裸鼠皮下接種胃癌SGC－7901細胞，初步成功建立了胃癌的裸鼠移植瘤模型，并利用stathmin siRNA 進行治療后發(fā)現(xiàn)其能明顯抑制胃癌裸鼠移植瘤的生長，并伴隨著stathmin 蛋白表達的顯著降低，提示stathmin siRNA 在裸鼠體內具有明顯抑制stathmin 蛋白表達的作用。眾所周知，Ki－67抗原是一種與細胞增殖特異相關的核抗原。Ki－67在細胞周期的各個時相中表達，但在靜止細胞中不表達［15］。有研究表明，Ki－67 增殖指數高低與許多腫瘤的增殖、分化程度、侵襲轉移以及預后密切相關［16］，因此也能作為某些惡性腫瘤預后的重要參考指標之一。為了進一步闡明stathmin siRNA 介導的胃癌裸鼠移植瘤增殖的抑制效應，我們檢測與增殖相關的Ki－67 抗原的表達，發(fā)現(xiàn)stathmin siRNA 組的細胞增殖指數明顯低于PBS 組和對照siRNA 組(P ＜0.05)，提示stathmin siRNA 能明顯抑制胃癌裸鼠移植瘤的增殖，但具體的分子作用機制還有待于進一步探討。

研究顯示，利用siRNA 靶向作用于stathmin 能在體內外增強三氧化二砷引發(fā)的宮頸癌細胞凋亡，并與PI3K 信號轉導途徑密切相關［17］。Mistry 等［18］研究發(fā)現(xiàn)利用重組腺病毒下調前列腺癌LNCaP 細胞中stathmin 的表達能促使細胞發(fā)生凋亡。上述研究表明stathmin 在腫瘤細胞凋亡中發(fā)揮重要作用，是否該作用能擴展到胃癌細胞?因此我們利用TUNEL檢測發(fā)現(xiàn)stathmin siRNA 組的細胞凋亡數明顯高于PBS 組和對照siRNA 組(P ＜0. 05)，利用Western blotting 方法分析胃癌裸鼠移植瘤中與細胞凋亡密切相關的蛋白Bcl－2 和Bax 的表達，發(fā)現(xiàn)stathmin siRNA 組中抑凋亡蛋白Bcl－2 的表達顯著下調，而Bax蛋白表達明顯升高，表明stathmin siRNA 介導的胃癌裸鼠移植瘤細胞凋亡可能與Bcl－2 表達下降和Bax表達升高密切相關。

總之，stathmin 表達下調能明顯抑制胃癌裸鼠移植瘤的增殖和誘導細胞凋亡。上述研究為以stathmin 為靶點的胃癌基因治療奠定了堅實的基礎。

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