范 俊， 楊成明△， 連繼勤， 曾春雨， 倪振洪， 林德勝， 冉 希

(1第三軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院野戰(zhàn)外科研究所心血管內(nèi)科，重慶400042;2第三軍醫(yī)大學(xué)基礎(chǔ)部生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室，重慶400038)

在高血壓、心肌梗死等心血管疾病的發(fā)生過(guò)程 中，血液中血管緊張素Ⅱ(angiotensinⅡ，AngⅡ)的濃度顯著升高［1］。在高濃度AngⅡ的刺激下，血管內(nèi)皮細(xì)胞(vascular endothelial cell)中活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)產(chǎn)生增加，造成細(xì)胞中氧化蛋白和受損線粒體的大量積累，從而導(dǎo)致細(xì)胞自身?yè)p傷，嚴(yán)重影響了血管內(nèi)皮細(xì)胞的屏障功能以及保持血管內(nèi)膜光滑、調(diào)節(jié)血管舒張和收縮、抑制血栓形成等功能，與心血管疾病的發(fā)生密切相關(guān)［2－4］。

隨著近年對(duì)細(xì)胞自噬(autophagy)研究的深入，發(fā)現(xiàn)自噬可以通過(guò)細(xì)胞溶酶體系統(tǒng)降解有毒物質(zhì)以及受損的蛋白質(zhì)、細(xì)胞器，并在營(yíng)養(yǎng)不足、缺氧等情況下循環(huán)利用降解上述物質(zhì)釋放出的氨基酸、核苷酸、脂肪酸等小分子物質(zhì)及能量以維持細(xì)胞的穩(wěn)態(tài)［5－7］。由此推測(cè)，在由AngⅡ引發(fā)損傷的血管內(nèi)皮細(xì)胞中，自噬可能是防止細(xì)胞損傷的一種潛在機(jī)制，有可能成為心血管疾病治療的新靶點(diǎn)和新策略［6－7］。目前關(guān)于AngⅡ與血管內(nèi)皮細(xì)胞自噬之間關(guān)系的研究尚不多見(jiàn)。本研究中，我們觀察了AngⅡ?qū)ρ軆?nèi)皮細(xì)胞自噬的影響，并初步探討了AngⅡ誘導(dǎo)細(xì)胞自噬的可能機(jī)制。我們發(fā)現(xiàn)AngⅡ能夠增強(qiáng)血管內(nèi)皮細(xì)胞中ROS 的產(chǎn)生，而且AngⅡ促進(jìn)自噬的作用可被抗氧化劑所抑制。因此，AngⅡ可能通過(guò)升高血管內(nèi)皮細(xì)胞中ROS 水平促進(jìn)自噬發(fā)生。

材 料 和 方 法

1 主要材料

人臍靜脈細(xì)胞融合細(xì)胞EA.hy926，由第三軍醫(yī)大學(xué)基礎(chǔ)部生物化學(xué)教研室保存并贈(zèng)送。胎牛血清和DMEM 購(gòu)于Gibco;AngⅡ、N－乙酰半胱氨酸(Nacetyl－L－cysteine，NAC)、吖啶橙(acridine orange，AO)和3－甲基腺嘌呤(3－methyladenine，3－MA)購(gòu)自Sigma;活性氧檢測(cè)試劑盒購(gòu)自中國(guó)江蘇碧云天公司;微管相關(guān)蛋白輕鏈3－Ⅱ(microtubule－associated protein light chain，3－Ⅱ，LC3－Ⅱ)抗體購(gòu)自Cell signaling;Ⅱ抗購(gòu)自Santa Cruz。

2 方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 人臍靜脈細(xì)胞融合細(xì)胞EA.hy926于含10%小牛血清的DMEM 培養(yǎng)基，37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)。2 ～3 d 換1 次液，待細(xì)胞融合至約80%時(shí)，0.25%胰酶消化傳代，2 ～3 代EA 細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

2.2 活性氧檢測(cè) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的EA. hy926 細(xì)胞，以1 ×107/L 的密度接種96 孔板中，待細(xì)胞貼壁后將細(xì)胞分為正常對(duì)照組、Ang Ⅱ(10－7mol/L)、NAC(50 μmol/L)和AngⅡ(10－7mol/L)+NAC(50 μmol/L)，處理24 h 后按照1∶1 000 用無(wú)血清培養(yǎng)液稀釋DCFH－DA，使終濃度為10 μmol/L，在37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育20 min 后，用無(wú)血清細(xì)胞培養(yǎng)液洗滌細(xì)胞3 次，使用熒光酶標(biāo)儀(488 nm 激發(fā)波長(zhǎng)，525 nm 發(fā)射波長(zhǎng))檢測(cè)熒光的強(qiáng)弱。

2.3 吖啶橙染色(acridine orange，AO) 將DMEM(含10 %胎牛血清)培養(yǎng)的EA. hy926 細(xì)胞以5 ×107/L 的密度接種12 孔板中，待細(xì)胞貼壁后將細(xì)胞分為正常對(duì)照組、Ang Ⅱ(10－7mol/L)、Ang Ⅱ(10－7mol/L)+3－MA(2 mmol/L)和AngⅡ(10－7mol/L)+NAC(50 μmol/L)組，細(xì)胞于終止培養(yǎng)24 h 前20 min，加入吖啶橙染液，終濃度100 μmol/L，避光培養(yǎng)20 min后，用PBS 沖洗2 遍，于熒光顯微鏡下觀察并拍照。

2.4 蛋白免疫印跡實(shí)驗(yàn)(Western blotting) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的EA. hy926 細(xì)胞，以5 ×108/L 的密度接種于6 孔板中，待細(xì)胞貼壁后加入相應(yīng)處理因素，處理24 h 后用RIPA 裂解液提取細(xì)胞蛋白，BCA 法測(cè)蛋白濃度，SDS－PAGE 電泳每孔上樣50 μg 的蛋白后經(jīng)轉(zhuǎn)膜、封閉，LC3－Ⅱ抗體(1∶1 000)和羊抗兔Ⅱ抗(1∶5 000)孵育后，顯色曝光。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié) 果

1 EA.hy926 細(xì)胞內(nèi)ROS 水平的檢測(cè)

AngⅡ(10－7mol/L)組較對(duì)照組ROS 熒光值顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0. 05);而Ang Ⅱ(10－7mol/L)+ NAC(50 μmol/L)組較AngⅡ(10－7mol/L)組顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.05)，見(jiàn)圖1。

Figure 1. The influence of AngⅡ(10 －7 mol/L)combined NAC(50 μmol/L)on ROS level in EA.hy926 cells. ±s.n =6. * P ＜0.05 vs control group;△P ＜0.05 vs AngⅡgroup.圖1 AngⅡ?qū)A.hy926 細(xì)胞ROS 水平的影響

2 AngⅡ促進(jìn)EA.hy926 細(xì)胞發(fā)生自噬

2.1 不同濃度AngⅡ?qū)A.hy926 細(xì)胞發(fā)生自噬的影響 與對(duì)照組相比較，不同濃度Ang Ⅱ?qū)A.hy926 細(xì)胞LC3－Ⅱ蛋白表達(dá)有促進(jìn)作用(P ＜0.05)，且與作用濃度有關(guān)，在10－8mol/L 和10－7mol/L 組中，LC3－Ⅱ蛋白表達(dá)量明顯高于10－6mol/L 組(P ＜0. 05)，因此，我們?cè)诤罄m(xù)實(shí)驗(yàn)中均采用10－7mol/L 作為AngⅡ的使用劑量，見(jiàn)圖2。

Figure 2. LC3－Ⅱprotein level detected by Western blotting in EA.hy926 cells after stimulated by different concentrations of AngⅡ. ±s.n=6. * P ＜0.05 vs 0 mol/L;△P＜0.05 vs 10 －6 mol/L.圖2 Western blotting 檢測(cè)不同濃度AngⅡ處理后EA.hy926 細(xì)胞LC3－Ⅱ蛋白的表達(dá)

2.2 AngⅡ不同作用時(shí)間對(duì)EA.hy926 細(xì)胞發(fā)生自噬的影響 以濃度為10－7mol/L 的AngⅡ分別刺激EA.hy926 細(xì)胞0 h、6 h、12 h、24 h 和36 h 后，收集細(xì)胞，用Western blotting 檢測(cè)LC3－Ⅱ蛋白表達(dá)。結(jié)果顯示，6 h、12 h、24 h 和36 h 組的LC3－Ⅱ蛋白表達(dá)均較0 h 組明顯增強(qiáng)(P ＜0.05)，24 h 組LC3－Ⅱ蛋白表達(dá)比6 h、12 h 和36 h 組均明顯增強(qiáng)(P ＜0.05)，見(jiàn)圖3。AngⅡ?qū)A.hy926 細(xì)胞中LC3－Ⅱ蛋白表達(dá)的促進(jìn)作用隨著時(shí)間延長(zhǎng)逐漸增強(qiáng)，24 h后達(dá)到最大。

Figure 3. LC3－Ⅱprotein level detected by Western blotting in EA.hy926 cells after stimulated by Ang Ⅱ(10 －7mol/L)for different time. ± s. n =6. * P ＜0.05 vs 0 h;△P ＜0.05 vs 6 h，12 h or 36 h.圖3 Western blotting 檢測(cè)AngⅡ作用不同時(shí)間后EA.hy926 細(xì)胞LC3－Ⅱ蛋白的表達(dá)

2.3 AO 染色觀察AngⅡ?qū)A. hy926 細(xì)胞自噬的影響 經(jīng)AO 染色后在熒光顯微鏡下觀察EA.hy926 細(xì)胞自噬的變化，胞質(zhì)內(nèi)呈酸性的自噬體囊泡結(jié)構(gòu)被染成明亮的橘紅色，而其它細(xì)胞部位呈綠色。AngⅡ(10－7mol/L)組胞質(zhì)內(nèi)橘紅色自噬體結(jié)構(gòu)較對(duì)照組明顯增多，見(jiàn)圖4。

Figure 4. Evaluation of autophagy in EA.hy926 cells by fluorescence microscopy after stained with acridine orange (×200).A:control group;B:AngⅡ(10 －7 mol/L)group.圖4 AO 染色后熒光顯微鏡下觀察EA.hy926 細(xì)胞自噬

3 AngⅡ引起的EA. hy926 細(xì)胞自噬可以被3－MA 所抑制

Rapamycin(陽(yáng)性對(duì)照)和AngⅡ?qū)A.hy926 細(xì)胞LC3－Ⅱ蛋白表達(dá)有促進(jìn)作用(P ＜0.05)，而3－MA 對(duì)AngⅡ誘導(dǎo)的LC3－Ⅱ蛋白表達(dá)有抑制作用(P ＜0.05)，見(jiàn)圖5。

4 AngⅡ引起的EA. hy926 細(xì)胞自噬可以被NAC所抑制

4.1 Western blotting 檢測(cè)EA.hy926 細(xì)胞自噬的變化

H2O2組的LC3－Ⅱ蛋白表達(dá)均較對(duì)照組明顯增強(qiáng)(P ＜0.05)，而NAC+H2O2組較H2O2組LC3－Ⅱ蛋白表達(dá)有明顯減弱(P ＜0.05)，見(jiàn)圖6A;H2O2(作為陽(yáng)性對(duì)照)組和AngⅡ組的LC3－Ⅱ蛋白表達(dá)均較對(duì)照組明顯增強(qiáng)(P ＜0.05)，NAC 組較對(duì)照組LC3－Ⅱ蛋白無(wú)明顯差異(P ＞0.05)，而NAC+AngⅡ組較AngⅡ組LC3－Ⅱ蛋白表達(dá)有明顯減弱(P ＜0.05)，見(jiàn)圖6B。

4.2 AO 染色觀察EA.hy926 細(xì)胞自噬的變化 AngⅡ處理組胞質(zhì)內(nèi)橘紅色自噬小體較對(duì)照組明顯增多，而AngⅡ+3－MA 組和AngⅡ+NAC 組胞質(zhì)內(nèi)橘紅色自噬小體較AngⅡ(10－7mol/L)組明顯減少，見(jiàn)圖7。

Figure 5. LC3－Ⅱprotein level detected by Western blotting in EA. hy926 cells after treated with Ang Ⅱ(10 －7 mol/L)，3－MA(2 mmol/L)and rapamycin(Rap，1 mg/L，positive control for autophagy). ± s. n = 6.* P ＜0.05 vs control group;△P ＜0. 05 vs Ang Ⅱgroup.圖5 Western blotting 檢測(cè)AngⅡ聯(lián)合3－MA 處理后EA細(xì)胞LC3－Ⅱ蛋白的表達(dá)

Figure 6. Expression of LC3－Ⅱprotein in different groups detected by Western blotting.A:LC3－Ⅱprotein level in EA.hy926 cells after treated with H2O2(200 μmol/L)and/or NAC(50 μmol/L). ± s. n =6. * P ＜0.05 vs control and H2O2 + NAC group.B:LC3－Ⅱprotein level in EA.hy926 cells after treated with AngⅡ(10 －7 mol/L)and/or NAC(50 μmol/L).H2O2(200 μmol/L)served as a positive control for autophagy. ±s. n =6. #P ＜0.05 vs control group;△P ＜0.05 vs AngⅡgroup.圖6 Western blotting 檢測(cè)各組EA.hy926 細(xì)胞LC3－Ⅱ蛋白的表達(dá)

Figure 7. Evaluation of autophagy in EA.hy926 cells by fluorescence microscopy after stained with acridine orange (×200).A:control group;B:AngⅡ(10 －7 mol/L)group;C:AngⅡ+3－MA(2 mmol/L)group;D:AngⅡ+NAC(50 μmol/L)group.圖7 AO 染色后熒光顯微鏡觀察EA.hy926 細(xì)胞自噬

討 論

血管內(nèi)皮細(xì)胞在維持正常的血管功能和結(jié)構(gòu)中具有關(guān)鍵性作用，內(nèi)皮功能損傷是多種心血管疾病的關(guān)鍵環(huán)節(jié)［8］。AngⅡ作為引起氧化應(yīng)激最強(qiáng)烈的刺激物之一，在心血管疾病發(fā)生過(guò)程中明顯升高。AngⅡ在多種酶如黃嘌呤氧化酶、細(xì)胞色素P450、一氧化氮合酶、NADPH 氧化酶等參與下，主要通過(guò)其I型受體介導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生過(guò)多的ROS，從而導(dǎo)致了內(nèi)皮功能損傷［2，4，9］。因此，ROS 水平升高是AngⅡ引起內(nèi)皮功能損傷的主要原因。本研究發(fā)現(xiàn)高于生理濃度(10－7mol/L)的AngⅡ作用于EA 細(xì)胞24h 后，與對(duì)照組相比，細(xì)胞內(nèi)ROS 水平均明顯升高(均P ＜0.05);而NAC 組和AngⅡ+NAC 組，與AngⅡ組相比，細(xì)胞內(nèi)ROS 水平明顯降低(均P ＜0.05)。這些結(jié)果再次證實(shí)了AngⅡ能夠引起血管內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)ROS 的產(chǎn)生增加。

自噬作為真核細(xì)胞通過(guò)溶酶體系統(tǒng)降解自身成分的一個(gè)高度保守的代謝過(guò)程，其對(duì)于清除聚集的氧化蛋白和受損的細(xì)胞器以及維持細(xì)胞的穩(wěn)態(tài)具有非常重要的作用［10］。因此，自噬是保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞免受ROS 損傷的重要機(jī)制。在自噬過(guò)程中LC3蛋白發(fā)揮了重要作用，以LC3－Ⅰ和LC3－Ⅱ2 種形式存在，其中LC3－Ⅰ為非活化形式，主要存在于胞質(zhì)中;LC3－Ⅰ在自噬發(fā)生時(shí)與磷脂酰乙醇胺結(jié)合轉(zhuǎn)變?yōu)長(zhǎng)C3－Ⅱ并結(jié)合于自噬體膜上，對(duì)自噬體的延伸及最終的閉合起著重要作用，且LC3－Ⅱ一直定位在自噬體膜上直至被溶酶體酶降解，是目前反映細(xì)胞內(nèi)自噬水平的特異性蛋白標(biāo)記物［11－13］。為了研究AngⅡ?qū)ρ軆?nèi)皮細(xì)胞自噬的影響，本實(shí)驗(yàn)選擇3 個(gè)高于正常生理濃度的Ang Ⅱ干預(yù)體外培養(yǎng)的EA.hy926 細(xì)胞，同時(shí)以濃度為10－7mol/L 的AngⅡ分別刺激EA. hy926 細(xì)胞不同時(shí)間后，通過(guò)Western blotting 檢測(cè)LC3－Ⅱ蛋白的表達(dá)變化，并通過(guò)AO染色觀察自噬體的形成。我們發(fā)現(xiàn)AngⅡ?qū)A 細(xì)胞LC3－Ⅱ蛋白表達(dá)有促進(jìn)作用，并且能夠促進(jìn)自噬體的形成，這些結(jié)果均證明了AngⅡ能夠誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)生自噬。實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)，與10－6mol/L 作用相比，10－8與10－7mol/L 的AngⅡ?qū)A 細(xì)胞的自噬誘導(dǎo)作用更強(qiáng)烈，表明EA 細(xì)胞自噬水平的強(qiáng)弱與AngⅡ濃度的高低并不完全成正比關(guān)系，相關(guān)機(jī)制尚需進(jìn)一步研究探討。

3－MA 是細(xì)胞內(nèi)I 型與Ⅲ型磷脂酰肌醇3－激酶的特殊性抑制劑，這兩種酶的活性尤其是Ⅲ型磷脂酰肌醇3－激酶的活性與細(xì)胞自噬的發(fā)生密切相關(guān)，因此，3－MA 通常作為細(xì)胞自噬的特異性抑制劑［14－15］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，3－MA 聯(lián)合AngⅡ作用于EA.hy926 細(xì)胞后能夠明顯抑制AngⅡ誘導(dǎo)的細(xì)胞自噬，并且AO 染色也發(fā)現(xiàn)AngⅡ聯(lián)合3－MA 作用EA.hy926 細(xì)胞后，胞質(zhì)內(nèi)自噬體(橘紅色點(diǎn)狀結(jié)構(gòu))較AngⅡ組明顯減少，自噬水平顯著降低，說(shuō)明AngⅡ誘導(dǎo)的EA 細(xì)胞自噬依賴于Ⅲ型磷脂酰肌醇3－激酶的激活。

多項(xiàng)研究表明，氧化應(yīng)激是誘導(dǎo)細(xì)胞自噬發(fā)生的重要原因［13，16－17］。為了確定AngⅡ誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激與細(xì)胞自噬之間是否存在因果關(guān)系，本實(shí)驗(yàn)選擇特異性抗氧化劑NAC［18］聯(lián)合H2O2或AngⅡ作用于EA.hy926 細(xì)胞后檢測(cè)其自噬水平。結(jié)果表明，NAC可以明顯抑制H2O2或AngⅡ誘導(dǎo)細(xì)胞自噬水平，并且AO 染色也發(fā)現(xiàn)AngⅡ聯(lián)合NAC 作用EA. hy926細(xì)胞后，胞質(zhì)內(nèi)自噬體(橘紅色點(diǎn)狀結(jié)構(gòu))較AngⅡ組明顯減少，說(shuō)明ROS 水平升高可能是AngⅡ誘導(dǎo)EA.hy926 細(xì)胞發(fā)生自噬的主要原因。

目前，自噬與心血管疾病關(guān)系的研究已成為一個(gè)新的熱點(diǎn)，雖然還存在很多未知因素，但對(duì)AngⅡ、ROS 和自噬三者間關(guān)系了解的不斷深入，將有助于研究者根據(jù)不同心血管疾病發(fā)生過(guò)程中細(xì)胞自噬水平的特點(diǎn)和變化，發(fā)現(xiàn)新的治療靶點(diǎn)和防治策略。

［1］ De Mello WC，Danser AH. AngiotensinⅡand the heart:on the intracrine renin－angiotensin system［J］. Hypertension，2000，35(6):1183－1188.

［2］ Landmesser U，Spiekermann S，Preuss C，et al. AngiotensinⅡinduces endothelial xanthine oxidase activation:role for endothelial dysfunction in patients with coronary disease［J］. Arterioscler Thromb Vasc Biol，2007，27(4):943－948.

［3］ Cai H，Harrison DG. Endothelial dysfunction in cardiovascular diseases:the role of oxidant stress［J］. Circ Res，2000，87(10):840－844.

［4］ 尤壽江，石際俊，張艷林. ROS 介導(dǎo)的自噬及其在相關(guān)疾病中的作用［J］. 中國(guó)病理生理雜志，2011，27(1):187－190，195.

［5］ Baehrecke EH. Autophagy:dual roles in life and death?［J］. Nat Rev Mol Cell Biol，2005，6(6):505－510.

［6］ Nishida K，Kyoi S，Yamaguchi O，et al. The role of autophagy in the heart［J］. Cell Death Differ，2009，16(1):31－38.

［7］ De Meyer GR，Martinet W. Autophagy in the cardiovascular system［J］. Biochim Biophys Acta，2009，1793(9):1485－1495.

［8］ Cines DB，Pollak ES，Buck CA，et al. Endothelial cells in physiology and in the pathophysiology of vascular disorders［J］. Blood，1998，91(10):3527－3561.

［9］ Doughan AK，Harrison DG，Dikalov SI. Molecular mechanisms of angiotensin Ⅱ－ mediated mitochondrial dysfunction:linking mitochondrial oxidative damage and vascular endothelial dysfunction［J］. Circ Res，2008，102(4):488－496.

［10］ Levine B，Kroemer G. Autophagy in the pathogenesis of disease［J］. Cell，2008，132(1):27－42.

［11］ Kabeya Y，Mizushima N，Ueno T，et al. LC3，a mammalian homologue of yeast Apg8p，is localized in autophagosome membranes after processing［J］. EMBO J，2000，19(21):5720－5728.

［12］Mizushima N，Yoshimori T，Levine B. Methods in mammalian autophagy research［J］. Cell，2010，140(3):313－326.

［13］ He C，Klionsky DJ. Regulation mechanisms and signaling pathways of autophagy［J］. Annu Rev Genet，2009，43:67－93.

［14］ Blommaart EF，Krause U，Schellens JP，et al. The phosphatidylinositol 3－kinase inhibitors wortmannin and LY294002 inhibit autophagy in isolated rat hepatocytes［J］. Eur J Biochem，1997，243(1－2):240－246.

［15］ Petiot A，Ogier－Denis E，Blommaart EF，et al. Distinct classes of phosphatidylinositol 3＇－kinases are involved in signaling pathways that control macroautophagy in HT－29 cells［J］. J Biol Chem，2000，275(2):992－998.

［16］ Zheng L，Marcusson J，Terman A. Oxidative stress and Alzheimer disease:the autophagy connection?［J］. Autophagy，2006，2(2):143－145.

［17］ Kiffin R，Bandyopadhyay U，Cuervo AM. Oxidative stress and autophagy［J］. Antioxid Redox Signal，2006，8(1－2):152－162.

［18］ De Vries N，De Flora S. N－acetyl－L－cysteine［J］. J Cell Biochem Suppl，1993，17F:270－277.