王冠明， 陳小華， 林 晨△， 陳少華， 楊力建， 王鵬程， 李揚秋

(暨南大學1醫(yī)學院微生物與免疫學系，2血液研究所，廣東 廣州510632)

分子靶向藥物伊馬替尼能抑制BCR/ABL 激酶的活性，在慢性粒細胞白血病(chronic myeloid leukemia，CML)慢性期的治療中十分有效，但易出現(xiàn)耐藥致使加速期和急變期效果不佳［1－2］。12－肉豆蔻酸－13－乙酸佛波酯(phorbol 12－myristate 13－acetate，PMA)是蛋白激酶C(protein kinase C，PKC)的激活劑，臨床研究顯示:PMA 能明顯改善伊馬替尼耐藥的CML 患者生存期［3－5］，但其作用機制尚不是很清楚。近年發(fā)現(xiàn)Src 激酶家族成員Fyn 參與了伊馬替尼耐受機制［6］。本實驗利用PMA 作用于源自CML的K562 細胞株，實時熒光定量PCR 測定BCR/ABL與Fyn 基因的轉(zhuǎn)錄水平變化，通過分析PMA 對BCR/ABL 與Fyn 基因的影響，探討兩個基因之間的相互關(guān)系及意義。

材 料 和 方 法

1 材料

K562 細胞和Molt－4 細胞由暨南大學血液研究所保存;RPMI－1640 培養(yǎng)基、小牛血清購自健陽生物公司;臺盼藍和PMA 購自Sigma;植物血凝素(phytohemagglutinin，PHA)購自廣州白云試劑公司;TRIzol 購自康為世紀公司;逆轉(zhuǎn)錄和實時熒光定量PCR 試劑盒購自東洋紡公司;CCK－8 試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司;DNA marker (DL2000)購自廣州東盛生物科技有限公司;引物由上海英駿公司合成。

2 細胞培養(yǎng)

將K562 細胞和Molt－4 細胞置于含10%小牛血清的RPMI－1640 培養(yǎng)基中(青霉素1 ×105U/L，鏈霉素100 mg/L)，于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。取對數(shù)期的K562 細胞和Molt 4 細胞離心去除上清液，用PBS 洗滌2 次，細胞計數(shù)后分別接種于24 孔板中，每孔2 mL，含3 ×106個細胞。K562 細胞株反應(yīng)體系:PMA 刺激組:濃度分別為1 μg/L、10 μg/L、100 μg/L 和250 μg/L;陽性對照組:PHA 濃度為25 mg/L;空白組。Molt－4 細胞株反應(yīng)體系:PMA 刺激組:濃度為100 μg/L;陽性對照組:PHA 濃度為25 mg/L;空白組。各組復孔。持續(xù)刺激24 h 后，采用異硫氰酸胍－苯酚－氯仿一步提取法提取RNA，并參照試劑盒說明書，用隨機引物進行cDNA 第1 鏈合成。

3 計算細胞存活率

用PBS 配制成0. 4% 臺盼藍，向培養(yǎng)24 h 的K562 各組細胞懸液滴加臺盼藍，使其終濃度為0.04%，3 min 內(nèi)在顯微鏡下計數(shù)。細胞存活率=不染色細胞/細胞總數(shù)。

4 細胞增殖活性測定

將各實驗組K562 細胞懸液滴入96 孔板中，每孔100 μL，同時設(shè)不加藥的陰性對照與只加培養(yǎng)基無細胞和藥的空白對照。37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h、36 h、48 h 后，各孔加入10 μL CCK－8，溫箱中繼續(xù)孵育2 h 后，用酶標儀檢測450 nm 處吸光度(A)，每組實驗重復3 次。

5 實時熒光定量PCR

用NCBI 數(shù)據(jù)庫及Primer Premier 5.0 軟件設(shè)計引物，見表1。反應(yīng)體系20 μL，其中含cDNA 1 μL，上、下游引物濃度為0. 3 μmol/L，RNAfree 水12.8 μL，MasterMix 10 μL。反應(yīng)條件為預變性95 ℃2 min，擴增40 個循環(huán)，每循環(huán)包括95 ℃1 min，60 ℃30 s，72 ℃30 s，于68 ℃讀板1 次，最后以0.15 ℃/s的速度從55 ℃～95 ℃每隔1 s 記錄1 次熒光值，得到融解曲線。所有反應(yīng)在Bio－Rad MiniOpticon 實時熒光定量PCR 儀上進行。

表1 實時熒光定量PCR 引物Table 1. Primers for real－time fluorescence quantitative PCR

6 相對定量分析

用2－ΔΔCt公式計算基因的相對表達量，Ct 值為擴增曲線達到熒光閾值所需循環(huán)數(shù)，ΔCt 為組內(nèi)目的基因與內(nèi)參照Ct 值之差，ΔΔCt 為組間ΔCt 之差。2－ΔΔCt值小于1 表示基因轉(zhuǎn)錄下調(diào)，大于1 則表示上調(diào)［7］。

7 PCR 產(chǎn)物鑒定

取PCR 產(chǎn)物置于2%脂糖凝膠中，以10 V/cm的電壓電泳。

8 統(tǒng)計學處理

結(jié) 果

1 細胞存活率和增殖活性

臺盼藍拒染法檢測空白組及1 μg/L、10 μg/L、100 μg/L、250 μg/L PMA 刺激組在培養(yǎng)24 h 后的細胞存活率分別為99.5%、99.2%、98.7%、96.5%和68.7%。CCK－8 結(jié)果顯示250 μg/L PMA 對K562細胞增殖有明顯抑制作用，而100 μg/L 濃度下48 h后才出現(xiàn)明顯的抑制作用，見圖1。

Figure 1. The growth curves of the K562 cells treated with different concentrations of PMA. ±s. n =3. * P ＜0.05 vs control group.圖1 不同濃度PMA 作用下K562 細胞的生長曲線

2 PCR 產(chǎn)物鑒定

實時熒光定量PCR 擴增曲線平滑完好，各基因熔解曲線均只有單一峰，顯示出良好的特異性，見圖2。瓊脂糖電泳顯示目的基因大小與預期一致，說明PCR 結(jié)果準確無誤，見圖3。

Figure 2. Real－time fluorescence quantitative PCR amplification curves (A)and melting curves (B).圖2 實時熒光定量PCR 擴增曲線和熔解曲線

Figure 3. Identification of PCR products.圖3 PCR 產(chǎn)物的鑒定

3 不同劑量PMA 對K562 細胞BCR/ABL 和Fyn mRNA 表達的影響

不同濃度PMA 作用K562 細胞株24 h 后，BCR/ABL 和Fyn mRNA 表達水平明顯下調(diào)。PMA 在1 ～250 μg/L 范圍內(nèi)，抑制BCR/ABL mRNA 表達具有明顯的量效關(guān)系(P ＜0.01)。同樣，在1 ～100 μg/L 的范圍內(nèi)，抑制Fyn mRNA 表達具有量效關(guān)系(P ＜0.01)。PMA 在1 ～100 μg/L 的范圍內(nèi)，F(xiàn)yn 和BCR/ABL mRNA 水平的下調(diào)具有明顯相關(guān)性(r =0.929，P ＜0.01)，見圖4。

4 PMA 特異性下調(diào)K562 細胞Fyn 轉(zhuǎn)錄水平

以100 μg/L PMA 作用于K562 細胞株24 h，F(xiàn)yn轉(zhuǎn)錄水平下調(diào)約55%，與空白對照組有明顯差異(P ＜0.01);而PMA 作用于Molt－4 細胞株后Fyn 轉(zhuǎn)錄水平基本沒有變化，均值為0.92，接近1，與空白對照組比較無明顯差異(P ＞0.05)，見圖5。

Figure 4. The changes of BCR/ABL and Fyn mRNA expression in K562 cells stimulated by the different concentrations of PMA. ±s.n=4.圖4 不同濃度的PMA 作用下K562 細胞BCR/ABL 和Fyn mRNA 的表達變化

Figure 5. Comparison of the effects of PMA on Fyn mRNA expression in K562 and Molt－4 cell lines. ± s.n=4. * P ＜0.05 vs control group.圖5 比較PMA 作用于K562 和Molt－4 細胞對Fyn 改變的影響

5 PMA 刺激K562 細胞的形態(tài)變化

100 μg/L PMA 刺激36 h 后，部分K562 細胞呈現(xiàn)貼壁生長，胞體梭形或多角形，見圖6。

Figure 6. The differentiation of K562 cells induced by PMA for 36 h. A:0 h;B:36 h.圖6 PMA 誘導K562 細胞分化情況

討 論

CML 是由于第9 號染色體上的ABL 基因易位到第22 號染色體BCR 斷裂點處形成特異性的BCR/ABL 融合基因［5］，其產(chǎn)物BCR/ABL 融合蛋白中ABL激酶活性高表達，最終導致CML 的發(fā)生。目前，分子靶向藥物是臨床治療CML 的一線藥物，其作用靶點就是特異性抑制融合蛋白中的ABL 激酶。

臨床最常用的分子靶向藥物伊馬替尼治療CML的耐藥機制大致可以分為BCR/ABL 依賴型和非BCR/ABL 依賴型［8］。前者最常見的原因是ABL 激酶點突變，而非BCR/ABL 依賴型的耐藥機制則與Src 家族激酶有關(guān)［8］。Src 家族在調(diào)節(jié)細胞增殖、分化、黏附及運動方面起非常重要的作用［9］，其9 個家族成員分別是Src、Yes、Fyn、Yrk、Fgr、Hck、Lyn、Lck和Blk，其中Src、Fyn 和Yes 表達廣泛，而其它成員的表達具有細胞選擇性［10］。近來研究逐漸發(fā)現(xiàn)Fyn 在耐藥機制中起到較為重要的作用。Fyn 同BCR/ABL的關(guān)系非常密切，Src 激酶抑制劑PP2 能使伊馬替尼耐藥的K562 細胞恢復藥物敏感性［5］。Fyn 通過磷酸化BCR/ABL 的SH3－SH2 區(qū)域，穩(wěn)定其活化構(gòu)象從而增強其活性［11］。Ban 等［12］報道，在CML 急變期，BCR/ABL 能上調(diào)Fyn 蛋白表達水平。這提示在急變期耐藥機制中，F(xiàn)yn 可能扮演了重要角色。

PMA 是一種強誘導劑，本實驗結(jié)果顯示，PMA能夠下調(diào)BCR/ABL 基因轉(zhuǎn)錄水平，而且細胞形態(tài)上出現(xiàn)巨噬細胞樣改變，這與文獻報道相符［5，13］。同時，PMA 還能導致Fyn 基因的轉(zhuǎn)錄水平下調(diào)。而且，PMA 在一定濃度范圍內(nèi)，降低兩者mRNA 表達水平呈現(xiàn)明顯相關(guān)性。高濃度的PMA 對細胞有一定毒性作用，本實驗結(jié)果表明，250 μg/L 濃度的PMA 有明顯細胞毒作用，但在100 μg/L 濃度以下范圍內(nèi)，24 h 時點上對K562 細胞的毒性作用不明顯。由于Fyn 激酶在機體較多種類細胞中普遍表達［10］，分布沒有十分嚴格的細胞特異性，為進一步探討Fyn 下調(diào)與BCR/ABL 的關(guān)聯(lián)性，我們選取了T 細胞系來源的無BCR/ABL 融合基因的Molt－4 細胞株作比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)PMA 對Molt－4 細胞Fyn 基因轉(zhuǎn)錄表達影響不大。該結(jié)果給我們很重要的提示:異常的BCR/ABL 融合基因參與或者介導Fyn 基因的表達，兩者存在一定程度的因果關(guān)系。因此，深入研究兩者之間的相互作用機制，對于闡明CML 的發(fā)病機制，克服治療過程中的耐藥性，具有十分重要的意義。

綜上所述，PMA 通過抑制白血病K562 細胞株中BCR/ABL 融合基因下調(diào)Fyn 基因的轉(zhuǎn)錄。該作用具有CML 的細胞選擇性。PMA 改善伊馬替尼耐藥性可能是通過誘導白血病細胞分化成熟的途徑。

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