喻禮懷 郝志敏 付 聰 王夢芝 王洪榮

（揚(yáng)州大學(xué)動物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，江蘇揚(yáng)州225009）

近年來，關(guān)于硫胺素在反芻動物方面的研究已有相關(guān)的報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)室的前期研究表明，奶牛在常規(guī)日糧(精粗比為3∶7)條件下飼喂可以不添加硫胺素。而在高精料日糧下反芻動物日糧中有必要添加硫胺素。因此有必要通過試驗(yàn)來確定硫胺素的適宜添加量。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

鹽酸硫胺素：純度≥99%（Solarbio）。

1.2 試驗(yàn)動物及底物組成

從揚(yáng)州大學(xué)試驗(yàn)?zāi)翀鲞x取體重接近、身體健康及安裝永久性瘤胃瘺管的荷斯坦奶牛4頭。試驗(yàn)底物及硫胺素添加量見表1，人工唾液鹽的配制見表2。

表1 底物組成與硫胺素的添加量

1.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)及飼養(yǎng)管理

試驗(yàn)采用單因子試驗(yàn)設(shè)計(jì)，5個硫胺素水平，分別是0、60、120、180和240 mg/kg。對照組不添加鹽酸硫胺素，試驗(yàn)組分別添加不同劑量的鹽酸硫胺素（純度≥99%，硫胺素的有效含量分別為0、53.5、107.0、160.5、214.0 mg/kg），每組3個重復(fù)。

表2 人工唾液鹽緩沖液組成含量（g/l）

采集瘤胃液用于體外培養(yǎng)，培養(yǎng)底物是半純合日糧，其精粗比設(shè)計(jì)為6∶4。培養(yǎng)時間72 h。分別在0、1、3、6、10、24、48、72 h采集培養(yǎng)液。試驗(yàn)期間每日7:00和19:00兩次等量飼喂，自由飲水，用于采集瘤胃內(nèi)容物樣品。

人工唾液鹽緩沖液在使用前1 d配制（見表2）并通入CO2待用。

1.4 體外培養(yǎng)步驟

早晨飼喂前采集奶牛瘤胃液，裝在自制真空負(fù)壓裝置。每頭瘺管牛采集100 ml瘤胃液，過濾后裝入保溫瓶。往保溫瓶通入CO2，并置于恒溫水浴中保溫。

培養(yǎng)試驗(yàn)前3 h配制人工唾液鹽，即配即用。每個重復(fù)（培養(yǎng)瓶）添加1.2 g配制好的底物，并按上述試驗(yàn)設(shè)計(jì)添加硫胺素；之后添加配制好的人工唾液鹽80 ml，再各加入采集好的并經(jīng)過過濾的瘤胃液40 ml，通入CO2至飽和，置于恒溫水浴中保溫。另設(shè)只含有人工唾液鹽和瘤胃液的空白對照，培養(yǎng)72 h。分別在0、1、3、6、10、24、48、72 h采集培養(yǎng)液，每次采集15 ml，分裝在5 ml和10 ml的離心管中，測定pH值，并將樣品置于-20℃保存，測定相關(guān)指標(biāo)。培養(yǎng)72 h后，收集培養(yǎng)液，分裝在10 ml離心管，-20℃保存，進(jìn)行微生物分離及指標(biāo)測定。

1.5 指標(biāo)測定

使用pHS-3C型pH計(jì)測定pH值；使用苯酚-次氯酸鈉比色法測定氨氮濃度；微生物的分離采用Mar?tin-Orue等的方法進(jìn)行測定；微生物蛋白的測定采用三氯乙酸沉淀蛋白法進(jìn)行測定。

1.6 數(shù)據(jù)處理

用Excel軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)整理，用SPSS Statistics 17.0統(tǒng)計(jì)軟件分析數(shù)據(jù)。方差分析采用比較均值中的單因素ANOVA分析，顯著性檢驗(yàn)采用LSD多重比較。數(shù)據(jù)以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤”表示，標(biāo)準(zhǔn)誤用SEM表示，顯著性用P表示。

2 結(jié)果

2.1 高精料日糧條件下硫胺素對培養(yǎng)液pH值的影響（見表3、圖1）

表3 高精料日糧條件下不同硫胺素水平對培養(yǎng)液pH值的影響

圖1 高精料日糧條件下硫胺素對培養(yǎng)液pH值的影響

由表3可見，除24 h時間點(diǎn)外，各試驗(yàn)組與對照組相比，培養(yǎng)液pH值差異不顯著（P＞0.05）。培養(yǎng)液中瘤胃微生物降解營養(yǎng)物質(zhì)，生成揮發(fā)性脂肪酸，致使各組pH值隨時間呈下降趨勢，基本在72 h時降到最低點(diǎn)。24 h時，B試驗(yàn)組與對照組相比，培養(yǎng)液pH值差異極顯著（P＜0.01)，B試驗(yàn)組與D試驗(yàn)組相比，培養(yǎng)液pH值差異極顯著（P＜0.01)。

2.2 高精料日糧條件下不同硫胺素水平對培養(yǎng)液氨氮濃度的影響（見表4、圖2）

表4 高精料日糧條件下不同硫胺素水平對培養(yǎng)液氨氮濃度的影響(mg/100 ml)

圖2 高精料日糧條件下硫胺素對氨氮濃度的影響

由表4可見，隨著硫胺素添加量的增加，各試驗(yàn)組氨氮濃度整體上均低于對照組A組，且各個試驗(yàn)組之間整體上差異均不顯著（P＞0.05），在培養(yǎng)1 h時，D、E試驗(yàn)組極顯著低于對照組，B、C試驗(yàn)組與對照組相比差異不顯著（P＞0.05）。

從同一時間點(diǎn)看，相比于對照組，試驗(yàn)各組培養(yǎng)液的氨氮濃度均呈現(xiàn)下降的趨勢，NH3-N濃度隨時間點(diǎn)的變化來看，試驗(yàn)各組氨氮濃度的變化趨勢與對照組大體上都相似，隨培養(yǎng)液培養(yǎng)時間的延長呈先升高后緩慢下降然后又緩慢上升的趨勢。1 h時，對照組極顯著高于D組和E組（P＜0.01）。

2.3 高精料日糧條件下硫胺素對培養(yǎng)液原蟲蛋白產(chǎn)量的影響（見表5、圖3）

表5 高精料日糧條件下硫胺素對培養(yǎng)液原蟲蛋白產(chǎn)量的影響(mg/ml)

圖3 高精料日糧條件下硫胺素對原蟲蛋白產(chǎn)量的影響

由表5可見，隨著硫胺素水平增加,各組原蟲蛋白產(chǎn)量總體上表現(xiàn)為先下降后上升的趨勢,72 h時的原蟲蛋白產(chǎn)量最高。在48 h時,D試驗(yàn)組原蟲蛋白產(chǎn)量極顯著低于對照組(P＜0.01)，而其它各試驗(yàn)組的原蟲蛋白產(chǎn)量與對照組相比差異均不顯著；在72 h時，D試驗(yàn)組原蟲蛋白產(chǎn)量和E試驗(yàn)組原蟲蛋白產(chǎn)量極顯著低于對照組(P＜0.01)。

2.4 高精料日糧條件下硫胺素對培養(yǎng)液細(xì)菌蛋白產(chǎn)量的影響（見表6、圖4）

表6 高精料日糧條件下硫胺素對培養(yǎng)液細(xì)菌蛋白產(chǎn)量的影響(mg/ml)

圖4 高精料日糧條件下硫胺素對細(xì)菌蛋白產(chǎn)量的影響

由表6可見。隨著硫胺素水平增加，細(xì)菌蛋白產(chǎn)量呈現(xiàn)上升趨勢，各試驗(yàn)組的細(xì)菌蛋白產(chǎn)量與對照組的細(xì)菌蛋白產(chǎn)量相比差異不顯著(P＞0.05)。各組細(xì)菌蛋白產(chǎn)量總體上表現(xiàn)為先上升后下降的趨勢，總體上看，6～10階段較高，而48～72 h階段較低。在72 h時，B試驗(yàn)組細(xì)菌蛋白產(chǎn)量和D試驗(yàn)組細(xì)菌蛋白產(chǎn)量極顯著高于對照組(P＜0.01)，而其它各試驗(yàn)組的細(xì)菌蛋白產(chǎn)量與對照組相比差異不顯著(P＞0.05)。

3 討論

3.1 高精料日糧條件下硫胺素對瘤胃培養(yǎng)液pH值的影響

在反芻動物養(yǎng)殖中，飼喂方法、日糧組成、瘤胃內(nèi)乳酸及揮發(fā)性脂肪酸等其它有機(jī)酸產(chǎn)生、吸收利用等因素均會影響瘤胃液的pH值，因此，我們通常所認(rèn)為衡量瘤胃發(fā)酵水平和內(nèi)環(huán)境綜合指標(biāo)的是瘤胃液的pH值。

本試驗(yàn)中對照組和各個試驗(yàn)組所記錄的所有的培養(yǎng)液pH值的變動范圍分別是6.00～7.30，5.98～7.32，6.03～7.34，6.03～7.35和6.01～7.32。體外發(fā)酵開始后，錐形瓶中的底物慢慢被瘤胃微生物降解生成乳酸、大量的揮發(fā)性脂肪酸以及其它一些有機(jī)酸，這些酸產(chǎn)生速度遠(yuǎn)高于微生物利用速度，以致pH值下降。隨培養(yǎng)時間增加，瘤胃中相關(guān)微生物活動能力減弱，利用酸性物質(zhì)能力降低，以致之前產(chǎn)生的酸性物質(zhì)等其它次生代謝產(chǎn)物又不能及時外排，所以導(dǎo)致培養(yǎng)液pH值緩慢下降。培養(yǎng)結(jié)束后，與對照組相比，其它各試驗(yàn)組pH值都不同程度地升高，說明高精料日糧條件下模擬體外發(fā)酵試驗(yàn)中添加硫胺素有提高pH值的趨勢。

3.2 高精料日糧條件下不同硫胺素水平對瘤胃液氨氮濃度的影響

飼料中蛋白質(zhì)的含量、飼料中蛋白質(zhì)在瘤胃內(nèi)降解的特性、能量供應(yīng)以及微生物蛋白的合成情況可以由瘤胃液中氨氮水平來反映。瘤胃內(nèi)氨氮是非纖維分解菌的部分氮源，更是纖維分解菌的必需氮源，因此氨氮濃度也是體現(xiàn)瘤胃中微生物活力的一個很重要的指標(biāo)，微生物蛋白高效率的合成一定要微生物提供充足的氮源。

本試驗(yàn)中瘤胃液氨氮濃度的變動范圍是17.29～37.81 mg/100 ml。體外培養(yǎng)72 h后，各試驗(yàn)組的氨氮濃度均高于對照組。5組氨氮濃度隨培養(yǎng)時間的變化規(guī)律相似，培養(yǎng)1 h后，各試驗(yàn)組瘤胃液氨氮濃度達(dá)到一個最高點(diǎn)，這其中主要的一個原因是瘤胃中尿素酶的活性高，這種酶能降解尿素釋放氨氮，這樣氨氮濃度就會上升；隨后濃度開始下降，這是因?yàn)榱鑫肝⑸镩_始吸收和利用氨氮；在發(fā)酵快結(jié)束的時候氨氮濃度又開始緩慢回升，這其中一個可能的原因是纖毛蟲自溶或細(xì)菌溶菌作用開始釋放氨所導(dǎo)致的。

3.3 高精料日糧條件下硫胺素對微生物真蛋白產(chǎn)量的影響

瘤胃微生物利用發(fā)酵產(chǎn)生的揮發(fā)性脂肪酸、糖類以及ATP等作為生長所需的能源，再利用日糧中粗飼料蛋白及精料中玉米等的蛋白通過降解而產(chǎn)生的各種氨基酸等作為氮的來源來合成MCP，可以給動物機(jī)體提供充足的能量。MCP的合成受碳水化合物(NFC)的種類和含量、動物飼糧中可降解蛋白、瘤胃內(nèi)環(huán)境、飼糧中的蛋白水平以及能氮釋放等的影響。

本試驗(yàn)中尿素為微生物發(fā)酵提供充足氮源，但微生物合成蛋白需要其它可利用能量。隨硫胺素添加，原蟲蛋白產(chǎn)量下降。這其中主要的原因是添加硫胺素后，瘤胃液的滲透壓發(fā)生改變，種屬原蟲的細(xì)胞壁比較薄，對滲透壓的敏感性較強(qiáng)而對存活率造成了一定的影響。細(xì)菌蛋白產(chǎn)量各個試驗(yàn)組整體上均高于對照組，細(xì)菌蛋白產(chǎn)量有所提高，因?yàn)榱虬匪厥翘妓衔锎x中必不可少的一種水溶性維生素。添加硫胺素促進(jìn)碳水化合物代謝，飼料能量的利用率也隨之提高，其中以180 mg/kg的添加量效果最顯著。

4 結(jié)論

①高精料日糧條件下添加硫胺素有提高瘤胃液pH值的趨勢，可以提高細(xì)菌蛋白產(chǎn)量，但降低了培養(yǎng)液的氨氮濃度。

②結(jié)合奶牛瘤胃內(nèi)環(huán)境指標(biāo)，本試驗(yàn)推薦硫胺素最佳添加水平為180 mg/kg。

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