遲淑艷 譚北平 楊奇慧 董曉慧 劉泓宇

(廣東海洋大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院，廣東湛江524088)

蛋氨酸在肝細胞內(nèi)和三磷酸腺苷（ATP）通過蛋氨酸腺苷轉(zhuǎn)移酶（Methionine adenosyl transferase，MAT）催化形成具有活性甲基的S-腺苷蛋氨酸（S-adenosyl Methionine,SAM），從而在體內(nèi)參與諸多合成和分解代謝的化學(xué)反應(yīng)，MAT是該反應(yīng)的限速酶，屬胞內(nèi)酶。蛋氨酸是凡納濱對蝦的第一限制性氨基酸，但是，晶體蛋氨酸和微膠囊化的蛋氨酸哪種能更有效地被動物吸收、利用還不清楚。本試驗通過在凡納濱對蝦飼料中添加晶體蛋氨酸和微膠囊蛋氨酸，通過放射性同位素檢測方法，研究不同形式的蛋氨酸對凡納濱對蝦蛋氨酸腺苷轉(zhuǎn)移酶活性的影響，以期為晶體氨基酸在對蝦飼料中有效利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗飼料

配制5種等氮、等能的低魚粉飼料（表1）。缺乏的蛋氨酸分別添加晶體L-蛋氨酸（MET,Adisseo，法國）、鄰苯二甲酸醋酸纖維素(Fluka,美國)包被蛋氨酸(CAP)、棕櫚酸甘油酯（Fluka，美國）包被蛋氨酸(TPA)、樹脂（Eudragit П,元升工業(yè)，江蘇連云港）包被蛋氨酸(RES)、羥基蛋氨酸（MHA,Alimet,Novus Internation?al,Inc.上海）5種形式，其中以MET為對照組。將所有粉碎好的飼料原料(過60目篩)按飼料配方(表1)混合均勻，經(jīng)雙螺桿制粒機[F-26(Ⅱ)，華南理工大學(xué)監(jiān)制]擠壓成直徑1.5 mm的條狀，在60℃恒溫下烘干至水分為10%左右，破碎，封裝備用。各處理組飼料氨基酸含量見表2。

表1 飼料配方和營養(yǎng)成分(%干物質(zhì))

表2 飼料中氨基酸含量(%)

1.2 飼養(yǎng)管理

養(yǎng)殖試驗在粵海飼料東海島試驗場進行，選擇健康凡納濱對蝦蝦苗，投喂商業(yè)飼料暫養(yǎng)2周后隨機選擇600尾健康對蝦進行分組。共5個處理組，每個處理3個重復(fù)，每個重復(fù)放養(yǎng)40尾蝦[初始重(0.81±0.01)g]于300 L玻璃鋼養(yǎng)殖桶中，每天投喂4次，飽食投喂，時間7：00、11：00、18：00、21：00，每天記錄投餌量，根據(jù)查餌情況變動投喂量，每次投喂前虹吸除去殘餌和蛻掉的殼。養(yǎng)殖期間24 h供氧，溶解氧10.45～10.5 mg/l，水溫29～30 ℃，pH值7.8～8.0，養(yǎng)殖試驗持續(xù)50 d。

1.3 樣品收集及化學(xué)分析

飼養(yǎng)試驗進行到28 d和50 d時，分別于7：00投料攝食后0.5、1、3、6、12 h進行肝胰腺取樣，以蒸餾水為介質(zhì)進行勻漿，1×104r/min離心取上清液，測定蛋氨酸腺苷轉(zhuǎn)移酶活性（MAT）（檢測方法由美國田納西大學(xué)外科學(xué)院Malak Kotb老師和他的學(xué)生Ramy Attia提供），具體方法如下：取10 μl、5×緩沖液（250 mmol/l TES緩沖液，250 mmol/l KCl，75 mmol/l MgCl2，1.5 mmol/l EDTA，0.5 mg/ml BSA溶液），5 μl 50 mmol/l ATP，1 μl 1 mmol/l14C-L-蛋氨酸（經(jīng)由中國同位素公司購自Amersham），0.2 μl、1 mol/l DTT，加入去離子水，將混合物在37 ℃孵育5 min，取40 μl放入10 μl樣本中反應(yīng)20 min，反應(yīng)結(jié)束后分別取管中溶液20 μl，點樣在經(jīng)冰醋酸處理的2 cm2的P81離子交換紙，在大容器中（4 L）流水沖洗30 min，上液閃儀（Packard,Tri-carb 2900TR,Liquid scitillation analyzer）測定14C-L-蛋氨酸放射活性。MAT活性的測定在廣州中山大學(xué)中山醫(yī)學(xué)院放射核醫(yī)學(xué)教研室完成。

2 結(jié)果分析

養(yǎng)殖第28 d、第50 d攝食不同形式氨基酸凡納濱對蝦肝胰腺MAT活性見圖1及圖2。

圖1 養(yǎng)殖第28 d攝食不同形式蛋氨酸后12 h內(nèi)凡納濱對蝦肝胰腺蛋氨酸腺苷轉(zhuǎn)移酶活性

由圖1看出，養(yǎng)殖試驗進行到第28 d時，攝食后0.5 h時CAP處理組MAT活性最高，1 h時RES處理組MAT活性上升至最高，而0.5 h和1 h時，TPA處理組均保持最低；3 h時RES組回落而TPA組和CAP組上升，并且TPA組在6 h時升至最高后于12 h時回落。MET組在0.5、3 h和6 h時MAT活性均較低，但是在12 h時驟然升高，不僅高于其他各組，還高于該組在整個取樣點時的MAT活性。MHA處理組在3 h時MAT活性最高。

圖2 養(yǎng)殖第50 d攝食不同形式蛋氨酸后6 h內(nèi)凡納濱對蝦肝胰腺蛋氨酸腺苷轉(zhuǎn)移酶活性

在養(yǎng)殖第50 d時，凡納濱對蝦攝食不同形式蛋氨酸飼料6 h內(nèi)，MAT活性發(fā)生了變化。攝食后0.5 h時，MET和MHA組的MAT活性較高，到1 h時3個微膠囊組的MAT活性開始上升而MET組下降，RES組上升較緩慢；3 h時RES組MAT活性持續(xù)上升，且達到觀察期內(nèi)的最高點，6 h時RES組MAT活性回落至最低，而此時MET組的MAT活性卻突然上升至最高。MHA處理組在0.5、1和3 h時始終保持較高的MAT活性，在6 h時有所下降。

3 討論

水生動物飼料中魚粉蛋白源被部分或全部替代后，會導(dǎo)致氨基酸的缺乏，通過添加晶體氨基酸(CAA)可以彌補限制性氨基酸的不足，同時提高蛋白質(zhì)的利用效率，改善凡納濱對蝦(Penaeus vannamei)[1]、日本對蝦(Penaeus japonicus)[2]、羅非魚(Tilapia nilotica)[3-4]、虹鱒 (Salmo gairdnerii Richardson)[5]、斑 點 叉尾 鮰(Ictal?urus punctatus)[6-7]、鯉魚(cyprinus carpio)[8]和尖吻鱸(Lates calcarifer Bloch)[9]等動物的生長。然而，水生動物利用晶體氨基酸的效果并非一致。有研究指出，動物腸道吸收CAA的速度比吸收肽和蛋白質(zhì)要快[10-12]，導(dǎo)致由飼料來源的蛋白分解出的游離氨基酸利用效率降低，部分氨基酸分解作用加劇[13]。有關(guān)CAA在動物體內(nèi)代謝程度的研究較少，Segovia-Quintero等通過飼喂尼羅羅非魚含放射性35S的蛋氨酸結(jié)果表明，蛋氨酸在整個腸道都有吸收，在前腸吸收最高[14]。

蛋氨酸吸收入血最初在肝臟聚集，首先經(jīng)MAT在ATP的作用下形成SAM，成為體內(nèi)最重要的甲基供體并且參與多種細胞信號傳遞過程。本試驗通過測定凡納濱對蝦養(yǎng)殖第28 d和第50 d時的MAT活性間接反映蛋氨酸的吸收速度和代謝程度。結(jié)果表明，養(yǎng)殖試驗進行至第28 d和50 d時，攝食后的不同時間點凡納濱對蝦肝胰腺MAT活性是有差異的。28 d時攝食0.5 h時CAP組的MAT活性最高，并且?guī)追N蛋氨酸添加形式除了TPA微膠囊蛋氨酸組以外均高于MET組，提示晶體蛋氨酸是否在0.5 h內(nèi)已經(jīng)被吸收代謝，也就是說在0.5 h以內(nèi)，由于晶體蛋氨酸進入消化道后以較高的底物濃度刺激了MAT的活性，使得該處理組在0.5 h時已經(jīng)過了該酶活性的最高峰值；而微膠囊蛋氨酸的不同處理均具有一定的緩釋作用，在0.5 h時CAP組MAT活性最高，已經(jīng)有一定量蛋氨酸釋放被吸收進入代謝途徑，分析可能由于包被技術(shù)的原因使該處理組表現(xiàn)出蛋氨酸的突釋，三種微膠囊蛋氨酸的制作工藝是不同的，包被的時間也不同，導(dǎo)致其釋放的速度以及包被的效果存在差異[15]。1 h時MET組活性上升提示蛋白結(jié)合態(tài)中的蛋氨酸可能已經(jīng)分解游離出來，通過腸道黏膜吸收而使MAT活性上升；第50 d時0.5 h，MET和MHA處理組的MAT活性較高，提示蛋氨酸已經(jīng)被吸收代謝，到1 h時三個微膠囊組的MAT活性開始上升，圖2顯示，CAP和TPA處理組微膠囊的蛋氨酸吸收可能快于RES組，RES組MAT活性逐漸上升，3 h時達最大，提示此時RES組的蛋氨酸吸收較高，可能與蛋白質(zhì)結(jié)合態(tài)分解出的蛋氨酸同步，并被動物較好利用，積極參與了蛋氨酸的代謝過程。MET組在第28 d攝食后12 h MAT活性最高，在第50 d攝食后6 h MAT活性最高（12 h樣本損壞）提示可能在此時已經(jīng)完成一個蛋氨酸循環(huán)并進入到下一個循環(huán)，而此時蛋氨酸濃度較高致使蛋氨酸形成SAM時MAT表現(xiàn)出較高的活性。

Segovia-Quintero等認為強飼尼羅羅非魚含有MET和CAP蛋氨酸的飼料后，肝臟35S的活性在1 h和6 h時顯著增高，并且一直保持到12 h，TPA處理組肝臟中35S放射活性在整個觀察期內(nèi)顯著低于另外兩個組，因此，認為TPA包被的蛋氨酸吸收速率低于晶體蛋氨酸和CAP包被的蛋氨酸，TPA的緩釋效果好于CAP[14]；本試驗中第28 d的結(jié)果顯示，微膠囊處理的三個蛋氨酸組在12 h的MAT活性均有下降，MET組的MAT活性高于微膠囊處理的三個蛋氨酸組，以RES組最低，這和前者結(jié)果相似；第50 d時12 h的樣本損壞，未能獲得此時的結(jié)果。

4 小結(jié)

本試驗條件下的數(shù)據(jù)表明，生長過程中的不同時期，凡納濱對蝦對氨基酸的吸收是存在差異的，微膠囊化對晶體蛋氨酸的吸收有一定的緩釋作用，可以改善晶體蛋氨酸和蛋白質(zhì)結(jié)合態(tài)蛋氨酸的吸收效率。需要進一步優(yōu)化蛋氨酸的微膠囊壁材、包被工藝和了解凡納濱對蝦機體蛋氨酸的代謝動力學(xué)，在提高蛋氨酸吸收的基礎(chǔ)上改善其代謝效率。

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