劉海燕 李 超 薛 敏 楊振才

（1.河北師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，河北石家莊050024；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院飼料研究所國(guó)家水產(chǎn)飼料安全評(píng)價(jià)基地，北京100081）

水產(chǎn)動(dòng)物有著五彩斑斕的體色，正常的體色代表著水產(chǎn)動(dòng)物的年齡、健康及品質(zhì)。很多水產(chǎn)動(dòng)物特征性的體色歸功于體內(nèi)類胡蘿卜素的類別及含量，這些類胡蘿卜素不能在動(dòng)物體內(nèi)從頭合成，必須依賴于外源食物中豐富的類胡蘿卜素的提供[1]。然而，在現(xiàn)代集約化養(yǎng)殖過(guò)程中，一些水產(chǎn)動(dòng)物的正常體色往往容易丟失，帶來(lái)很大的經(jīng)濟(jì)損失。因此，采取營(yíng)養(yǎng)調(diào)控手段通過(guò)飼料成分的改變來(lái)改善體色已成為水產(chǎn)品品質(zhì)調(diào)控的重要內(nèi)容。研究表明，在配合飼料中添加適宜的類胡蘿卜素成為解決這一問(wèn)題的一種途徑。葉黃素是一種廣泛存在于蔬菜、花卉等綠色植物中的天然類胡蘿卜素，在萬(wàn)壽菊中的含量最高。一些研究表明，來(lái)自萬(wàn)壽菊的葉黃素可以改善禽類[2]以及黃色系體色水產(chǎn)動(dòng)物，如：黃顙魚、錦鯉、雜交鯰和金魚[3-6]等魚類皮膚的顏色。中華鱉（Pelodiscus sinensis）是我國(guó)重要的水產(chǎn)經(jīng)濟(jì)動(dòng)物，其體色為黃色的品質(zhì)受到市場(chǎng)的青睞。然而，人工集約化養(yǎng)殖過(guò)程中這種黃色體色的丟失卻降低了商品的價(jià)值。迄今為止，葉黃素在中華鱉飼料中的應(yīng)用還未見(jiàn)報(bào)道。急性毒性試驗(yàn)處在毒理學(xué)研究的早期階段，是水產(chǎn)飼料評(píng)價(jià)的重要參考依據(jù)，在將天然葉黃素應(yīng)用到中華鱉飼料中之前有必要首先進(jìn)行天然葉黃素添加劑對(duì)中華鱉的急性毒性實(shí)驗(yàn)研究。因此，本文將以中華鱉為研究對(duì)象，以天然葉黃素添加劑為受試物，旨在探討天然葉黃素添加劑對(duì)中華鱉的急性毒性，為天然葉黃素在中華鱉飼料中的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 天然葉黃素添加劑

實(shí)驗(yàn)所用天然葉黃素添加劑（源自萬(wàn)壽菊）由廣州智特奇生物技術(shù)有限公司提供，為黃色粉末狀物質(zhì)，脂溶性，葉黃素純度為4%。

1.2 中華鱉

實(shí)驗(yàn)所用中華鱉購(gòu)自石家莊鄧莊中華鱉養(yǎng)殖場(chǎng)，選取當(dāng)年孵化的中華鱉稚鱉，轉(zhuǎn)入與實(shí)驗(yàn)用水質(zhì)、溫度和光照相同的養(yǎng)殖缸中適應(yīng)15 d，以使中華鱉適應(yīng)實(shí)驗(yàn)環(huán)境，每天投喂2次。

1.3 實(shí)驗(yàn)步驟

根據(jù)葉黃素為脂溶性的理化性質(zhì)，依據(jù)GB/T22487—2008[7]，本實(shí)驗(yàn)確定的急性致毒方式為口服急性致毒法，分為單次和連續(xù)口服葉黃素兩個(gè)實(shí)驗(yàn)。

1.3.1 單次口服急性毒性實(shí)驗(yàn)

1.3.1.1 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

由于葉黃素不易溶于水，而且其黏合性及對(duì)中華鱉的誘食性均較差，很難單獨(dú)給予受試動(dòng)物，因此本實(shí)驗(yàn)將葉黃素添加劑與中華鱉稚鱉配合飼料混勻后制成小藥丸，投喂給中華鱉。根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，不能得到葉黃素添加劑對(duì)中華鱉的死亡劑量。因此，正式實(shí)驗(yàn)除了設(shè)一個(gè)對(duì)照組外，另設(shè)一個(gè)飼料中能最大攙入的添加劑量組，即葉黃素添加劑與對(duì)照飼料等量混合，加入一定量的水，制成小藥丸，置于冰箱中備用。對(duì)照組飼料的原料組成及主要營(yíng)養(yǎng)成分見(jiàn)表1中的D1組。本實(shí)驗(yàn)分為對(duì)照組和處理組兩個(gè)實(shí)驗(yàn)組，每個(gè)處理組30個(gè)重復(fù)。

1.3.1.2 實(shí)驗(yàn)條件

實(shí)驗(yàn)在室內(nèi)靜水系統(tǒng)的玻璃缸中進(jìn)行，每個(gè)玻璃缸（30 cm×60 cm×40 cm）飼養(yǎng)兩只中華鱉，為避免鱉的相互殘殺行為，在缸中用網(wǎng)隔將兩只鱉隔開(kāi)。缸內(nèi)設(shè)有恒溫器和充氧設(shè)備，光照采用自然光照加人工光照。使水溫保持在(30±0.5)℃；光周期為14 L∶10 D；每6 h充氧一次，每次30 min，使溶氧保持在5 mg/l以上；每日換水量為1/3，注入已調(diào)好pH值且水溫適宜的水，使pH值保持在8.0±0.5。

表1 實(shí)驗(yàn)飼料配方及營(yíng)養(yǎng)成分（風(fēng)干基礎(chǔ)）

在正式實(shí)驗(yàn)之前,將中華鱉稚鱉稱重，選取體重8.0 g左右的稚鱉60只，轉(zhuǎn)入與實(shí)驗(yàn)用水質(zhì)、溫度和光照條件相同的30個(gè)玻璃缸中養(yǎng)殖15 d，每天定時(shí)投喂對(duì)照飼料2次（9：00、18：00）。正式實(shí)驗(yàn)開(kāi)始時(shí)將30個(gè)玻璃缸隨機(jī)分為兩組（一組為對(duì)照組；另一組為實(shí)驗(yàn)組），每組30只中華鱉。中華鱉空腹24 h。受試物的給予方式為自主攝食，受試物制成的小藥丸準(zhǔn)確稱重后投喂給中華鱉，投喂半小時(shí)后收集殘餌，并進(jìn)行溶失率的測(cè)定，以校正殘餌量，準(zhǔn)確計(jì)量中華鱉的攝食量。在隨后的14 d觀察期中，中華鱉的飼養(yǎng)管理與馴養(yǎng)期間的相同，詳細(xì)觀察并記錄中華鱉的反應(yīng)情況：行為、攝食、體色等方面的變化，發(fā)現(xiàn)死鱉及時(shí)撈出并詳細(xì)記錄。

1.3.2 連續(xù)口服急性毒性實(shí)驗(yàn)

1.3.2.1 實(shí)驗(yàn)飼料及實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

根據(jù)單次口服實(shí)驗(yàn)結(jié)果，由于不能求出天然葉黃素添加劑的經(jīng)口急性毒性半致死劑量LD50，在進(jìn)行連續(xù)口服急性毒性評(píng)價(jià)時(shí)，劑量的設(shè)計(jì)原則依據(jù)GB/T-22488—2008[8]和歐洲食品安全委員會(huì) (EFSA)[9]靶動(dòng)物有效性和耐受性試驗(yàn)規(guī)程，在不影響飼料營(yíng)養(yǎng)水平的基礎(chǔ)上設(shè)計(jì)最高劑量組為可能攝入劑量組的10倍以上。因此本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)了5個(gè)葉黃素添加劑劑量水平，分別為0（D1）、0.15%（D2）、0.3%（D3）、0.6%（D4）、8%（D5）。5組飼料的原料組成及主要營(yíng)養(yǎng)成分詳見(jiàn)表1。根據(jù)GB/T23187—2008[10]中的高效液相色譜法實(shí)際檢測(cè)葉黃素在這5組實(shí)驗(yàn)飼料中的含量分別為1.16(D1)、70.3(D2)、132.0(D3)、239.0(D4)和3 410 mg/kg(D5)。因此本實(shí)驗(yàn)為單因素5個(gè)處理水平的設(shè)計(jì)，每個(gè)處理24個(gè)重復(fù)。粉料先用顆粒機(jī)制成直徑為2 mm的軟顆粒，用保鮮盒冷凍保存于-20℃冰箱中備用。

1.3.2.2 實(shí)驗(yàn)鱉及實(shí)驗(yàn)條件

正式實(shí)驗(yàn)開(kāi)始時(shí)，選取120只體質(zhì)健康、體重相近的中華鱉稚鱉，禁食24 h后稱重，隨機(jī)分配到60個(gè)玻璃缸中。每天定時(shí)（9:00、18:00）、定量投喂實(shí)驗(yàn)飼料，記錄每只中華鱉每天的投喂量，同時(shí)測(cè)定各實(shí)驗(yàn)顆粒料的含水量。殘餌在投喂30 min后用吸管吸出，在鼓風(fēng)干燥箱中于65℃下烘干至恒重，稱重記錄。在相同的條件下用同樣的方法測(cè)定各組飼料的溶失率，對(duì)殘餌量進(jìn)行校正。實(shí)驗(yàn)條件同1.3.1。實(shí)驗(yàn)期為21 d。

1.4 指標(biāo)計(jì)算

攝食率(FI，%)=100×R1/[(Wt+W0)/2]；

飼料系數(shù)(FCR)=R1/(Wt-W0)；

特定生長(zhǎng)率(SGR，%/d)=100×[ln(Wt)-ln(W0)]/t；葉黃素日攝入量[mg/(kg bw·d)]=FI×C；

存活率(%)=100×存活魚尾數(shù)/初始魚尾數(shù)。式中：R1——攝食量；

W0——鱉初體重；

Wt——鱉末體重；

t——實(shí)驗(yàn)天數(shù)；

C——葉黃素在飼料中的含量。

1.5 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析

所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均采用Statistica 6.0軟件進(jìn)行單因素方差分析（oneway ANOVA）,若數(shù)據(jù)差異顯著則進(jìn)行Duncan's法多重比較，差異顯著水平為P＜0.05。

2 結(jié)果

2.1 單次口服急性毒性實(shí)驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)組中華鱉的葉黃素添加劑實(shí)際攝入量為18 831 mg/（kg bw），其中葉黃素的實(shí)際攝入劑量為753.24 mg/（kg bw）。實(shí)驗(yàn)開(kāi)始后，實(shí)驗(yàn)期間無(wú)論是對(duì)照組，還是葉黃素添加劑實(shí)驗(yàn)組[18 831 mg/（kg bw）]中華鱉沒(méi)有任何異常反應(yīng)，其游泳能力、呼吸功能和體色等均未出現(xiàn)異常變化，且每日攝食情況良好，行為安逸，沒(méi)有一只中華鱉出現(xiàn)死亡。

2.2 連續(xù)口服急性毒性實(shí)驗(yàn)（見(jiàn)表2）

表2 天然葉黃素添加劑對(duì)中華鱉生長(zhǎng)性能及飼料利用的影響

由表2可知：實(shí)驗(yàn)期間，所有實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組的中華鱉成活率均為100%。中華鱉對(duì)天然葉黃素添加劑在5個(gè)處理組中的日攝入量分別為：0、14.58、29.32、58.23、801.19 mg/(kg bw·d)；對(duì)天然葉黃素的日攝入量分別為：0.01、0.68、1.29、2.32、34.15 mg/(kg bw·d)。

在21 d的連續(xù)攝食葉黃素添加劑后，中華鱉的攝食、生長(zhǎng)及飼料利用均未受到顯著影響，各組間的攝食率、飼料系數(shù)和特定生長(zhǎng)率均未達(dá)到顯著性差異（P＞0.05）。

3 討論

葉黃素是類胡蘿卜素的含氧衍生物，具有很強(qiáng)的抗氧化能力，能夠有效清除體內(nèi)的自由基，對(duì)于預(yù)防和延緩老年性黃斑退化引起的視力衰退與失眠癥等起著重要作用[11]，在營(yíng)養(yǎng)和藥用方面有著很大的應(yīng)用前景，是近年來(lái)功能食品領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。目前，對(duì)葉黃素安全性的評(píng)價(jià)已成為葉黃素利用的焦點(diǎn)[12]，相關(guān)的急性毒性試驗(yàn)也有一些研究報(bào)道。胡憲等（2009）對(duì)大、小鼠進(jìn)行了葉黃素的急性毒性試驗(yàn)，結(jié)果表明，大、小鼠急性經(jīng)口LD50＞10 000 mg/kg，認(rèn)為葉黃素屬無(wú)毒物質(zhì)[13]；李大婧等（2008）對(duì)由葉黃素和α-亞麻酸組成的軟膠囊進(jìn)行了安全性毒理學(xué)評(píng)價(jià)，結(jié)果顯示，根據(jù)急性毒性(LD)劑量分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)，此葉黃素膠囊也屬無(wú)毒級(jí)[14];Ravikrishnan等(2011)研究發(fā)現(xiàn)，含67%葉黃素的LutemaxTM2020產(chǎn)品對(duì)大鼠的經(jīng)口LD50＞2 000 mg/kg，90 d的最大未觀察到有害作用劑量（NOAEL,no-observed-adverse-effect-level）大于400 mg/(kg bw·d)[12];Kumar等(2009)[15]和Harikumar等(2008)[16]分別在大鼠的研究中發(fā)現(xiàn)，葉黃素90 d的NOAEL為210 mg/(kg bw·d)和400 mg/(kg bw·d)，這些劑量均是實(shí)驗(yàn)中的最大劑量。從以上結(jié)果可以看出，這些純度很高的食品保健級(jí)葉黃素經(jīng)毒理學(xué)安全評(píng)價(jià)的結(jié)果是無(wú)毒物質(zhì)。

但是，應(yīng)用于飼料中的天然葉黃素添加劑不同于食品保健級(jí)的產(chǎn)品，葉黃素的純度較低。由于在從萬(wàn)壽菊提取過(guò)程中的一些加工工藝要求，葉黃素添加劑中存在著一些載體并殘留著一些化學(xué)物質(zhì)，它們是否會(huì)對(duì)水產(chǎn)動(dòng)物產(chǎn)生負(fù)面影響，這對(duì)于將葉黃素添加劑應(yīng)用到水產(chǎn)動(dòng)物飼料中是一個(gè)值得思考的問(wèn)題。盡管相關(guān)實(shí)驗(yàn)已經(jīng)證明，一定劑量葉黃素添加劑在飼料中的添加可以改善禽類和魚類的體色，也并未產(chǎn)生不良作用[2-6]，但有關(guān)葉黃素添加劑的急性毒性實(shí)驗(yàn)還未見(jiàn)報(bào)道，其毒性等級(jí)尚未知。因此，在本研究中我們采用含4%葉黃素的天然葉黃素添加劑作為中華鱉的受試物來(lái)測(cè)試葉黃素添加劑可能具有的毒性。

在本文單次口服致毒實(shí)驗(yàn)中，當(dāng)受試物(葉黃素添加劑)劑量為18 831 mg/(kg bw)時(shí)，中華鱉沒(méi)有出現(xiàn)一只死亡現(xiàn)象。依據(jù)GB/T 22487—2008《水產(chǎn)飼料安全性評(píng)價(jià)急性毒性試驗(yàn)規(guī)程》對(duì)受試物的急性毒性分級(jí)方法，需根據(jù)LC50或LD50數(shù)值，判定受試物的毒性分級(jí)，若水產(chǎn)動(dòng)物的口服受試物劑量LD50在5 001～15 000 mg/(kg bw)，則判定為實(shí)際無(wú)毒[7]。因此本試驗(yàn)中天然葉黃素添加劑對(duì)中華鱉經(jīng)口LD50＞18 831 mg/(kg bw)，可以判定本實(shí)驗(yàn)中所用天然葉黃素添加劑為實(shí)際無(wú)毒物質(zhì)，這與純度很高的食品保健級(jí)葉黃素的結(jié)果相一致。在連續(xù)口服致毒實(shí)驗(yàn)中，盡管天然葉黃素添加劑的日攝入量高達(dá)801.19 mg/(kgbw·d)，21 d總攝入量為16 824.99 mg/kg時(shí)，中華鱉的攝食、生長(zhǎng)及飼料轉(zhuǎn)化率均未受到影響。因此，本實(shí)驗(yàn)中天然葉黃素添加劑對(duì)中華鱉的21 d NOAEL為大于801.19 mg/(kg bw·d)。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)中所用天然葉黃素添加劑為無(wú)毒物質(zhì)，可以添加到中華鱉的飼料中，不會(huì)對(duì)中華鱉產(chǎn)生毒性作用，但其對(duì)體色的改善效果，還需要進(jìn)一步進(jìn)行生長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)研究。

4 結(jié)論

①單次口服急性毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，天然葉黃素添加劑對(duì)中華鱉經(jīng)口LD ＞18 831 mg/(kg bw)，為實(shí)際無(wú)毒物質(zhì)；

②21 d的連續(xù)口服試驗(yàn)結(jié)果表明天然葉黃素添加劑沒(méi)有顯著影響中華鱉的生長(zhǎng)與飼料利用，其對(duì)中華鱉21 d的NOAEL為大于801.19 mg/(kgbw d)。

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