敖翔　章清　武強(qiáng)　賀樂奇　張群峰　柯文才　彭志海

[摘要] 目的 構(gòu)建含有CD24基因的重組質(zhì)粒，在人胚腎上皮細(xì)胞Hek293中表達(dá)出具有免疫原性的抗原。方法 用PCR方法擴(kuò)增CD24基因，克隆到載體pYD5-hFC中，獲得重組質(zhì)粒pYD5-CD24，轉(zhuǎn)化DH10α感受態(tài)細(xì)胞中，挑選克隆抽取質(zhì)粒，以脂質(zhì)體介導(dǎo)將質(zhì)粒轉(zhuǎn)染Hek293細(xì)胞，72 h后收集細(xì)胞培養(yǎng)上清，Western-Blot分析鑒定。結(jié)果 構(gòu)建了含有CD24基因的重組質(zhì)粒，并在人胚腎上皮細(xì)胞Hek293中獲得帶有hFC標(biāo)簽的CD24蛋白。結(jié)論 本研究成功表達(dá)出了具有免疫原性的CD24蛋白。

[關(guān)鍵詞] CD24；表達(dá)；Western

[中圖分類號] R741[文獻(xiàn)標(biāo)識碼] B[文章編號] 1673-9701（2012）29-0047-02

CD24基因編碼唾液酸糖蛋白錨定在細(xì)胞表面糖基磷脂酰肌醇鏈上，在成熟的粒細(xì)胞和許多B細(xì)胞中都有表達(dá)[1]，它作為黏附分子對調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞生長、增殖及侵襲等均具有重要作用[2]，且其高表達(dá)及表達(dá)模式與患者生存率及預(yù)后密切相關(guān)，是多種腫瘤有價(jià)值的診斷和預(yù)后指標(biāo)[3]。

真核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)水平高，表達(dá)產(chǎn)物可進(jìn)行翻譯后加工，其抗原性、免疫原性和功能等生物活性與天然蛋白相似等特點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于各種不同外源基因的表達(dá)。本文以真核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)CD24基因，對表達(dá)產(chǎn)物的特異性進(jìn)行鑒定，并對核蛋白的免疫原性進(jìn)行初步研究，為CD24基因工程亞單位疫苗的研制及診斷抗原的研究做進(jìn)一步的探索。

1 材料與方法

1.1材料

CD24模版購自美國open biosysterms公司，DH10α感受態(tài)細(xì)胞自己制備，限制性內(nèi)切酶HindIII、BamHI購自NEB公司，T4連接酶、 Taq DNA聚合酶購自美國TAKARA公司，Hek293細(xì)胞株、F17培養(yǎng)基、F68、脂質(zhì)體cellfectine、抽質(zhì)粒試劑盒均購自invitrogen公司，Anti-CD24鼠抗購自Abcam公司，HRP標(biāo)記羊抗鼠IgGFc購自Sigma。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

細(xì)胞培養(yǎng)參照文獻(xiàn)[4]進(jìn)行，具體步驟如下，Hek293細(xì)胞培養(yǎng)基：F17無血清培養(yǎng)基，培養(yǎng)條件：27℃，5%CO2。懸浮培養(yǎng)：細(xì)胞接種到無菌的三角瓶置于恒溫?fù)u床培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速120轉(zhuǎn)/min，加入1%的F68，懸浮細(xì)胞密度一般維持在（0.5×106~1×106）cells/mL之間，一般傳代（2～3）次/周。

1.3 目的基因擴(kuò)增

根據(jù)CD24模板，PCR擴(kuò)增全長基因。上游引物P1為5GCCGTCTCGGATCCATGGGCAGAGCAATGGTGGC 3，5端加上BamHI酶切位點(diǎn)；下游引物P2為5GCCGTCTCAAGCTTAAGAGTAGAGATGCAGAAGAG 3，5端加上HindIII酶切位點(diǎn)。擴(kuò)增片斷為240 bp，含有完整的CD24基因，引物由南京金思特科技有限公司合成。

1.4重組質(zhì)粒構(gòu)建

將PCR產(chǎn)物CD24經(jīng)BamHI和HindIII雙酶切，酶切條件：37℃，2 h，酶切產(chǎn)物用1%的瓊脂糖凝膠電泳分離回收（按說明書操作），回收的目的片段與pYD5載體連接，連接產(chǎn)物pYD5-CD24熱擊轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)DH10α，涂布LB平板（平板中含有Amp），37℃培養(yǎng)過夜，挑獨(dú)立的克隆接種于10 mL LB培養(yǎng)基中（Amp）震蕩培養(yǎng)過夜。

1.5酶切及測序

收集細(xì)胞抽質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定，1 mL送測序，1.5 mL保種。若測序正確，將保存菌種擴(kuò)大培養(yǎng)抽質(zhì)粒（按Invitrogen公司試劑盒說明書操作）。

1.6細(xì)胞轉(zhuǎn)染及表達(dá)分析

轉(zhuǎn)染在6孔板中進(jìn)行，當(dāng)細(xì)胞生長密度達(dá)到1×106 cells/mL時(shí)，利用脂質(zhì)體（cellfectine）介導(dǎo)轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染后72 h左右收集細(xì)胞培養(yǎng)上清加入 loadingbuffer制得裂解液，根據(jù)Western bloting常規(guī)操作做WB檢測。一抗：CD24單克隆抗體。二抗：是HRP標(biāo)記羊抗鼠IgGFc。

2 結(jié)果與分析

2.1 目的基因擴(kuò)增結(jié)果

PCR擴(kuò)增出的CD24基因，經(jīng)1％瓊脂糖凝膠電泳檢測，得到一條大約240 bp的特異性條帶，與預(yù)期片段大小相符（圖1）。

圖1 CD24的PCR分析

1：2000 marker；2：CD24

2.2 重組質(zhì)粒鑒定結(jié)果

重組質(zhì)粒pYD5-CD24轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞DH10α，在含有氨芐抗生素的LB培養(yǎng)板上挑取獨(dú)立克隆培養(yǎng)，抽出質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切，酶切結(jié)果如圖2。酶切后得到大約6 kb和240 bp兩片段，分別與pYD5載體和CD24基因分子質(zhì)量一致。測序結(jié)果證明載體pYD5和CD24基因接頭連接處正確，大小和讀碼框架正確完整。

2.3 Western bloting分析結(jié)果

Western bloting結(jié)果如圖3，轉(zhuǎn)入CD24的Hek293細(xì)胞表達(dá)得到一條37 kD左右的帶，與預(yù)測的37.4 kD相符，說明表達(dá)出來的真核蛋白能與CD24單克隆抗體發(fā)生免疫反應(yīng)。

3 結(jié)論

研究發(fā)現(xiàn)CD24可促進(jìn)大腸癌細(xì)胞的增殖，同時(shí)激活Raf-ERK通路及p38MAPK激酶[5]，也與卵巢上皮性腫瘤惡性程度相關(guān)[6]，此外與乳腺癌標(biāo)本中CD44+CD24-細(xì)胞E-鈣黏連水平明顯下降[7]。CD24的表達(dá)與胃癌腫瘤病理學(xué)分級、臨床分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有相關(guān)性，同時(shí)CD24的異常表達(dá)可能與胃癌的早期發(fā)生有關(guān)[8]。CD24可能與食管鱗癌（ESCC）淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（LNM）相關(guān)[9]。樹突狀細(xì)胞受脂多糖刺激后CD24表達(dá)顯著增高，這有利于DC-T細(xì)胞簇的形成及抗原的遞呈，從而導(dǎo)致DC免疫功能的增強(qiáng)[10]。CD24表達(dá)可能是反映前列腺癌發(fā)生、進(jìn)展、生物學(xué)行為和預(yù)后的重要癌干細(xì)胞標(biāo)記物[11]。CD24在病理分級高的胰腺癌中表達(dá)高于分級低者，且惡性程度高的原發(fā)癌患者CD24表達(dá)明顯增強(qiáng)[12]。這些提示CD24在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中扮演著重要角色[13]。

本研究采用真核表達(dá)系統(tǒng)在Hek293細(xì)胞中表達(dá)重組CD24蛋白，真核系統(tǒng)與大腸桿菌等原核表達(dá)系統(tǒng)相比，能更好地保持蛋白的免疫原性，且pYD5載體為CD24加入hFC標(biāo)簽以利于蛋白的純化。用Western Blot方法進(jìn)行檢測，確定在Hek293細(xì)胞中表達(dá)出了真核蛋白，分子量約為37.4 kD，與預(yù)計(jì)的結(jié)果相符，且與CD24單克隆抗體發(fā)生良好的免疫反應(yīng)，這表明重組核蛋白保持了天然核蛋白的免疫原性，為進(jìn)一步研究該蛋白奠定了基礎(chǔ)。

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（收稿日期：2012-09-03）